Avaliação dos Níveis de Autofagia em Dois Diferentes Modelos de Células Pancreáticas Utilizando Imunofluorescência LC3
Summary
O objetivo deste protocolo é determinar os níveis autofágicos em câncer de pâncreas e células acinares pancreáticas através da imunofluorescência da LC3 e quantificação do ponto da CL3.
Abstract
A autofagia é um processo catabólico especializado que degrada seletivamente componentes citoplasmáticos, incluindo proteínas e organelas danificadas. A autofagia permite que as células respondam fisiologicamente aos estímulos de estresse e, assim, mantenham a homeostase celular. As células cancerosas podem modular seus níveis de autofagia para se adaptar a condições adversas como hipóxia, deficiência de nutrientes ou danos causados pela quimioterapia. O adenocarcinoma ductal do pâncreas é um dos tipos mais mortais de câncer. As células cancerosas do pâncreas apresentam alta atividade autofágica devido à suprarregulação transcricional e ativação pós-traducional das proteínas autofágicas.
Aqui, a linhagem celular PANC-1 foi usada como modelo de células cancerosas humanas pancreáticas, e a linhagem celular acinar pancreática AR42J foi usada como modelo fisiológico de células de mamíferos altamente diferenciadas. Este estudo utilizou a imunofluorescência da proteína de cadeia leve 3 associada a microtúbulos (CL3) como um indicador do estado de ativação da autofagia. A LC3 é uma proteína autofágica que, em condições basais, apresenta um padrão difuso de distribuição no citoplasma (conhecido como CL3-I nessa condição). A indução da autofagia desencadeia a conjugação da LC3 à fosfatidiletanolamina na superfície dos autofagossomos recém-formados para formar a LC3-II, uma proteína ligada à membrana que auxilia na formação e expansão dos autofagossomos. Para quantificar o número de estruturas autofágicas marcadas, utilizou-se o software de código aberto FIJI com o auxílio da ferramenta “3D Objects Counter”.
A medida dos níveis autofágicos tanto em condições fisiológicas quanto em células cancerosas permite estudar a modulação da autofagia sob diversas condições, como hipóxia, tratamento quimioterápico ou knockdown de certas proteínas.
Introduction
A macroautofagia (comumente referida como autofagia) é um processo catabólico especializado que degrada seletivamente componentes citoplasmáticos, incluindo proteínas e organelas danificadas 1,2. A autofagia permite que as células respondam fisiologicamente aos estímulos de estresse e, assim, mantenham a homeostase celular3. Durante a autofagia, uma dupla vesícula de membrana é formada: o autofagossomo. O autofagossomo contém as moléculas de carga e as conduz ao lisossomo para degradação 1,4.
Os autofagossomos são decorados pela proteína autofágica associada à proteína microtubular de cadeia leve 3 (CL3)5. Quando a autofagia não é induzida, a CL3 é difundida no citoplasma e no núcleo na conformação da LC3-I. Por outro lado, quando a autofagia é induzida, a CL3 é conjugada com uma fosfatidiletanolamina na membrana das estruturas autofágicas6. Essa nova conformação da LC3 é conhecida como LC3-II1. O desvio de conformação da CL3 provoca alterações em sua localização celular e sua migração por eletroforese em gel de dodecil sulfato de sódio e poliacrilamida (SDS-PAGE), que pode ser detectada por técnicas como imunofluorescência e western blot 5,7. Dessa forma, a conjugação da CL3 é um evento chave no processo autofágico que pode ser usado para medir a atividade autofágica.
A célula acinar pancreática é uma célula altamente diferenciada que, em condições saudáveis, apresenta baixa taxa de autofagia. Entretanto, em diferentes condições fisiológicas ou sob estimulação farmacológica, podem ativar a autofagia. Portanto, a determinação dos níveis autofágicos nessa linhagem celular é útil para estudar os potenciais efeitos diretos ou indiretos de diferentes agentes farmacológicos ou biológicos sobre aautofagia8,9.
O adenocarcinoma ductal de pâncreas é um dos tipos de câncer mais letais, dado seu diagnóstico tardio e sua alta resistência àquimioterapia10. As células cancerosas do pâncreas apresentam alta atividade autofágica devido à suprarregulação transcricional e ativação pós-traducional de proteínas relacionadas à autofagia11. As células do câncer de pâncreas podem ajustar seus níveis de autofagia em resposta a condições desfavoráveis como hipóxia, privação de nutrientes ou dano induzido por quimioterapia11. Assim, analisar os níveis de autofagia em células de câncer de pâncreas pode ajudar a entender como elas se adaptam a diferentes ambientes e avaliar a eficácia de tratamentos moduladores da autofagia.
Este estudo mostra um método para realizar a imunofluorescência CL3 em dois modelos celulares pancreáticos distintos. O primeiro modelo, células PANC-1, serviu de modelo para adenocarcinoma ductal pancreático. Essas células foram tratadas com gemcitabina, um agente quimioterápico que já demonstrou induzir autofagia, especificamente em células de câncer de pâncreas portadoras do gene oncogênico Kirsten rat sarcoma virus (KRAS)12,13. O segundo modelo, células AR42J, serviu como um modelo mais fisiológico de células pancreáticas exócrinas. Essas células foram diferenciadas com dexametasona para se tornarem mais semelhantes às células pancreáticas acinares14. Nessas células, a autofagia foi induzida farmacologicamente pelo uso da PP242, que é um potente inibidor da mTOR15. Neste estudo, demonstramos a aplicabilidade do protocolo descrito com dois modelos pancreáticos diferentes e sua capacidade de discriminar estados de baixa e alta autofagia.
Protocol
Representative Results
Discussion
O método descrito neste protocolo permite visualizar a distribuição endógena da CL3 na célula e quantificar os níveis autofágicos sob diferentes condições. Outro método semelhante utilizado para analisar a distribuição da CL3 e determinar a ativação da autofagia envolve a transfecção de LC3 marcada com fluorescência (como RFP-LC3)19. A transfecção RFP-LC3 tem as vantagens de não necessitar de fixação (o que permite a aplicação deste método em imagens de células<sup class=…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado por bolsas da Universidade de Buenos Aires (UBACyT 2018-2020 20020170100082BA), do Conselho Nacional de Pesquisa Científica e Tecnologia (CONICET) (PIP 2021-2023 GI− 11220200101549CO; e PUE 22920170100033) e da Agência Nacional de Promoção Científica e Tecnológica (PICT 2019-01664).
Materials
| 10x Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Corning | 46-013-CM | |
| 12 mm round coverslips | HDA | CBR_OBJ_6467 | |
| 24 Well- Cell Culture Plate | Sorfa | 220300 | |
| Absolute ethanol | Biopack | 2207.10.00 | |
| Alexa Fluor 594 Donkey anti-rabbit IgG (H+L) | Invitrogen | R37119 | |
| Confocal Laser Scanning Microscope | Zeiss | LSM 800 | |
| DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride) | Invitrogen | 62248 | |
| Dexamethasone | Sigma Aldrich | D4902 | |
| DMEN | Sartorius | 01-052-1A | |
| Fetal Bovine Serum | NATOCOR | Lintc-634 | |
| Gemcitabina | Eli Lilly | VL7502 | |
| LC3B (D11) XP Rabbit mAb | Cell Signaling Technology | 3868S | |
| Methanol | Anedra | 6197 | |
| Parafilm "M" (Laboratory Sealing Film) | Bemis/Curwood | PM-996 | |
| Pen-Strep Solution | Sartorius | 03-031-1B | |
| PP242 | Santa Cruz Biotechnology | SC-301606 | |
| Trypsin EDTA | Gibco | 11570626 |
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