Summary
מטרת פרוטוקול זה היא לקבוע רמות אוטופגיות בסרטן הלבלב ובתאי אסינר בלבלב באמצעות אימונופלואורסנציה LC3 וכימות נקודות LC3.
Abstract
אוטופגיה היא תהליך קטבולי מיוחד המפרק באופן סלקטיבי רכיבים ציטופלזמיים, כולל חלבונים ואברונים פגומים. אוטופגיה מאפשרת לתאים להגיב פיזיולוגית לגירויי לחץ, ובכך לשמור על הומאוסטזיס תאי. תאים סרטניים עשויים לווסת את רמות האוטופגיה שלהם כדי להסתגל לתנאים שליליים כגון היפוקסיה, מחסור בחומרים מזינים או נזק שנגרם על ידי כימותרפיה. אדנוקרצינומה של הלבלב היא אחד מסוגי הסרטן הקטלניים ביותר. לתאי סרטן הלבלב יש פעילות אוטופגיה גבוהה עקב הגברת השעתוק וההפעלה שלאחר התרגום של חלבוני אוטופגיה.
כאן, קו התאים PANC-1 שימש כמודל של תאי סרטן אנושיים בלבלב, וקו תאי הלבלב AR42J שימש כמודל פיזיולוגי של תאי יונקים ממוינים מאוד. מחקר זה השתמש באימונופלואורסנציה של שרשרת אור של חלבון הקשור למיקרוטובול 3 (LC3) כאינדיקטור למצב הפעלת אוטופגיה. LC3 הוא חלבון אוטופגיה אשר, בתנאי בסיס, מראה דפוס מפוזר של התפלגות בציטופלסמה (המכונה LC3-I במצב זה). השראת אוטופגיה מעוררת את הצמידות של LC3 לפוספטידיל-אתנולמין על פני השטח של אוטופגוזומים שזה עתה נוצרו ליצירת LC3-II, חלבון הקשור לקרום המסייע בהיווצרות ובהרחבה של אוטופגוזומים. כדי לכמת את מספר המבנים האוטופגיים המסומנים, נעשה שימוש בתוכנת הקוד הפתוח FIJI בעזרת הכלי "3D Objects Counter".
מדידת הרמות האוטופגיות הן בתנאים פיזיולוגיים והן בתאים סרטניים מאפשרת לנו לחקור את אפנון האוטופגיה בתנאים מגוונים כגון היפוקסיה, טיפול כימותרפי או הפלת חלבונים מסוימים.
Introduction
מקרואוטופגיה (המכונה בדרך כלל אוטופגיה) הוא תהליך קטבולי מיוחד המפרק באופן סלקטיבי רכיבים ציטופלזמיים, כולל חלבונים ואברונים פגומים 1,2. אוטופגיה מאפשרת לתאים להגיב פיזיולוגית לגירויי לחץ, ובכך לשמור על הומאוסטזיס תאי3. במהלך אוטופגיה נוצרת שלפוחית קרום כפולה: האוטופגוזום. האוטופגוזום מכיל את מולקולות המטען ומניע אותן לליזוזום לפירוק 1,4.
אוטופגוזומים מעוטרים על ידי שרשרת אור החלבון האוטופגית המשויכת למיקרוטובול 3 (LC3)5. כאשר אוטופגיה אינה מושרית, LC3 מפוזר בציטופלסמה ובגרעין בקונפורמציה LC3-I. מצד שני, כאשר אוטופגיה מושרית, LC3 מצומד עם phosphatidylethanolamine בקרום של מבנים אוטופגיים6. קונפורמציה LC3 חדשה זו ידועה בשם LC3-II1. שינוי הקונפורמציה LC3 גורם לשינויים בלוקליזציה התאית שלו ובנדידת האלקטרופורזה של ג'ל דודציל נתרן סולפט-פוליאקרילאמיד (SDS-PAGE), אשר ניתן לזהות באמצעות טכניקות כגון אימונופלואורסנציה וכתם מערבי 5,7. בדרך זו, צימוד LC3 הוא אירוע מפתח בתהליך האוטופגי שניתן להשתמש בו כדי למדוד פעילות אוטופגית.
תא acinar הלבלב הוא תא ממוין מאוד, אשר, בתנאים בריאים, יש שיעור נמוך של אוטופגיה. עם זאת, בתנאים פיזיולוגיים שונים או תחת גירוי תרופתי, הם יכולים להפעיל אוטופגיה. לכן, קביעת רמות אוטופגיות בקו תאים זה שימושית לחקר ההשפעות הישירות או העקיפות האפשריות של סוכנים פרמקולוגיים או ביולוגיים שונים על אוטופגיה 8,9.
אדנוקרצינומה של הלבלב היא אחד מסוגי הסרטן הקטלניים ביותר, בהתחשב באבחנה המאוחרת שלה ובעמידות הגבוהה שלהלכימותרפיה 10. לתאי סרטן הלבלב יש פעילות אוטופגיה גבוהה עקב הגברת השעתוק וההפעלה שלאחר התרגום של חלבונים הקשורים לאוטופגיה11. תאי סרטן הלבלב עשויים להתאים את רמות האוטופגיה שלהם בתגובה לתנאים שליליים כמו היפוקסיה, מחסור בחומרים מזינים או נזק הנגרם על ידי כימותרפיה11. לפיכך, ניתוח רמות האוטופגיה בתאי סרטן הלבלב יכול לעזור להבין כיצד הם מסתגלים לסביבות משתנות ולהעריך את היעילות של טיפולים המווסתים אוטופגיה.
מחקר זה מראה שיטה לביצוע LC3 immunofluorescence בשני מודלים שונים של תאי הלבלב. המודל הראשון, תאי PANC-1, שימש כמודל לאדנוקרצינומה של צינור הלבלב. תאים אלה טופלו בגמציטאבין, חומר כימותרפי שהוכח בעבר כגורם לאוטופגיה, במיוחד בתאי סרטן הלבלב הנושאים את הגן האונקוגני Kirsten rat sarcoma virus (KRAS)12,13. המודל השני, תאי AR42J, שימש כמודל פיזיולוגי יותר של תאי לבלב אקסוקריניים. תאים אלה התמינו עם dexamethasone כדי להיות דומים יותר לתאי לבלב acinar14. בתאים אלה, אוטופגיה הושרה פרמקולוגית באמצעות שימוש ב- PP242, שהוא מעכב mTORרב עוצמה 15. במחקר זה אנו מדגימים את תחולת הפרוטוקול המתואר בשני מודלים שונים של הלבלב ואת יכולתו להבחין בין מצבים של אוטופגיה נמוכה וגבוהה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הכנת תאים
- משרים כיסויים עגולים בקוטר 12 מ"מ באתנול מוחלט, ומניחים אותם במאונך בבארות של צלחת בת 24 בארות.
- הסר את הכיסוי, ולחשוף את צלחת רב באר לקרינה אולטרה סגולה במשך 15 דקות.
- מקמו את הכיסויים בצורה אופקית, וכבסו אותם עם מדיום הנשר המותאם (DMEM) של Dulbecco.
- זרע מספר מעבר נמוך של תאי הלבלב. יש להתאים את הסכום לקבלת מפגש של 50%-75% ביום הקיבוע16.
הערה: מומלץ לזרוע 2.5 × 104 PANC-1 או 4 × 104 תאי AR42J לכל באר כדי לקבע את התאים לאחר 3 ימים. - תרבית את התאים ב-DMEM המכילים 10% נסיוב בקר עוברי, 100 U/mL פניצילין ו-100 מיקרוגרם/מ"ל סטרפטומיצין באינקובטור בטמפרטורה של 37°C תחת אטמוספירה לחה עם 5% פחמן דו-חמצני (CO2).
הערה: עבור תאי PANC-1, מומלץ לדגור על התאים במשך יומיים בין זריעת התאים לבין השלבים הבאים. לאחר זמן זה, התאים יכולים להיות נגועים, מטופלים, או מקובעים. פרוטוקול זה מדגים את הטיפול בגמציטאבין בתאי PANC-1 שאינם נגועים ואת התמיינות וטיפול PP242 בתאי AR42J שאינם נגועים.
2. טיפול בתאים
- טיפול בגמציטאבין לתאי PANC-1
- הכינו תמיסה של 1 מיקרוגרם/מיקרוליטר גמציטאבין ב-DMEM יומיים לאחר הזריעה. טפל בכל באר עם 2.6 μL של 1 מיקרוגרם / μL תמיסת gemcitabine כדי להשיג דילול סופי של 20 μM.
- דוגרים על התאים במשך 24 שעות באינקובטור.
- התמיינות AR42J וטיפול PP242
- הכן תמיסה של 4 מיקרוגרם / מ"ל dexamethasone ב DMEM.
- טפל בכל באר עם 4.9 μL של 4 מיקרוגרם / מ"ל dexamethasone פתרון כדי לקבל דילול סופי של 100 ננומטר.
- דוגרים על התאים במשך 48 שעות באינקובטור.
- הסר את המדיום, ולטפל בכל באר עם 0.5 μL של 1 mM PP242 כדי לקבל דילול סופי של 1 μM.
- דוגרים על התאים במשך שעתיים באינקובטור.
3. תיקון וחדירה של התאים
- הכינו צלחת 24 בארות עם מתנול קר וצלחת 6 בארות עם מלח חוצץ פוספט קר (PBS; 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 8 mM Na 2 HPO 4, 2 mM KH2PO4). שמור אותם על קרח.
- קחו כל כיסוי בפינצטה, שטפו אותו פעמיים ב-PBS ודגרו במשך 6 דקות במתנול.
4. חסימת התאים
- יש לשטוף כל כיסוי פעמיים ב-PBS, ולדגור במשך שעה אחת בסרום בקר עוברי 10% ב-PBS (תמיסת חסימה).
הערה: בשלב זה, ייתכן שהפרוטוקול יושהה. את הכיסויים ניתן לאחסן למשך הלילה במקרר בתמיסת החסימה, ולהמשיך את הפרוטוקול למחרת.
5. דגירה על הכיסויים עם הנוגדן הראשוני
- הכינו תמיסה ביחס 1:1,000 של אנטי-LC3 בתמיסת החסימה, ותחזקו אותה על קרח.
- הניחו פיסת סרט איטום מעבדה על מכסה רב בארות.
- יש להניח טיפה אחת (25 μL) לכל כיסוי של תמיסת אנטי-LC3 מעל סרט האיטום.
- קח כל כיסוי עם פינצטה, ומניחים אותו מעל טיפת הנוגדנים הראשונית, דואג שצד התא יהיה במגע עם התמיסה.
- הכינו תא לח על ידי הנחת פיסת נייר לחה בקופסת פלסטיק בעלת תחתית שטוחה.
- מכניסים את הצלחת מרובת הבארות לתא הלחות, מכסים אותה בנייר כסף ודורים לילה במקרר.
6. דגירה על הכיסויים עם הנוגדן המשני
- מוציאים את הצלחת מרובת הבארות מתא הלחות, ומחזירים את הכיסויים לצלחת מרובת הקידוחים.
- בצע שלוש שטיפות עם PBS.
- הכינו תמיסה של אנטי-ארנב עם תווית פלואורסצנטית עם דילול של 1:800 בתמיסת החסימה, ושמרו אותה על קרח מוגן מפני אור.
- הניחו פיסת סרט איטום על המכסה הרב-באר.
- יש להניח טיפה (25 μL) לכל כיסוי של תמיסת אנטי-ארנב מעל סרט האיטום.
- קח כל כיסוי עם פינצטה, ומניחים אותו מעל טיפת הנוגדנים הראשונית, דואג שצד התא יהיה במגע עם התמיסה.
- דגרו על הצלחת מרובת הבארות בתא הלחות למשך שעתיים בטמפרטורת החדר (RT) המוגנת מפני אור.
7. צביעת התאים עם 4′ ,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)
- מוציאים את הצלחת מרובת הבארות מתא הלחות, ומחזירים את הכיסויים לצלחת מרובת הקידוחים.
- בצע שלוש שטיפות עם PBS.
- הכן תמיסה של 300 ננומטר של DAPI ב-PBS (מוגן מפני אור).
- יש לדגור על כל מכסה עם תמיסת DAPI למשך 10 דקות.
- בצע שלוש שטיפות עם PBS. שמור על צלחת רב באר מוגן מפני אור.
8. מונטאז'
- הכינו שתי כוסות עם מים ופיסת נייר.
- יש להניח טיפה אחת (10 μL) לכל כיסוי של תמיסת פוליוויניל אלכוהול-Bis(trimethylaluminum)-1,4-diazabicyclo[2.2.2]octane adduct (PVA-DABCO) על שקופית.
הערה: PVA-DABCO מוכן על-ידי שילוב של 0.25 M DABCO, 10% W/V PVA, 20% גליצרול ו-50% Tris HCl (1.5 M, pH 8.8) במים טהורים במיוחד. - קחו כל כיסוי בפינצטה, שטפו אותו בכל מים, ייבשו אותה בנייר והניחו אותה מעל טיפת PVA-DABCO (כשהתאים באים במגע עם התמיסה).
- תן לו להתייבש במשך הלילה, מוגן מפני אור.
9. צפייה במיקרוסקופ קונפוקלי ולכידת תמונה
- דמיינו את הכיסויים במיקרוסקופ קונפוקלי הפוך באמצעות מטרה של סביב 63x17.
- צלם תמונות מייצגות של התאים המסומנים בתוויות.
10. כימות נקודות LC3
- גרור ושחרר כל קובץ תמונה המכיל את הערוצים שנלכדו, כגון ".czi", במסך ImageJ (FIJI) כדי להיפתח. לחץ על אישור בתיבת הדו-שיח וסגור את חלון המסוף .
- בכרטיסייה תמונה , בחרו ' צבע' >'פיצול ערוצים'.
- סגור את התמונות המתאימות לערוצים שאינם תמונת LC3.
- בכרטיסיה תמונה , בחר התאם > איזון צבע
- הזיזו את המחוון ' מרבי' שמאלה עד לרוויית התמונה כדי להציג באופן חזותי את קווי המתאר של התא.
- ציירו את קו המתאר של התא בעזרת הכלי בחירה חופשית .
- לחץ על לאפס כפתור כדי לאפס את התאמת הצבע.
- בכרטיסיה עריכה , בחר גזור כדי לגזור את הפריט שנבחר.
- סגור את התמונה מבלי לשמור אותה.
- בכרטיסיה עריכה , בחר הדבק.
- בתפריט ' נתח' , בחרו בכלי 3D Objects Counter.
- הגדר את הסף. בדוגמה המובאת במחקר זה, הסף נקבע על 2,000.
- הגדר את מסנן הגודל. במחקר זה, הוא מוגדר בין 50 ל 500.
- ודא שהתיבות אובייקטים וסיכום מסומנות.
- לחץ על אישור. מספר הנקודות יתואר כאובייקטים שזוהו בסיכום.
איור 1: דיאגרמה סכמטית של פרוטוקול LC3 immunofluorescence. דיאגרמה סכמטית המייצגת את הפרוטוקול הכללי שסופק עבור LC3 immunofluorescence. איור שנוצר באמצעות BioRender.com. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
פרוטוקול זה מבצע immunofluorescence של LC3 בשורות תאי הלבלב כדי לקבוע את רמות autophagy בתנאים שונים. התוצאה של ניסוי זה הייתה קבלת תמונות סלולריות מהערוצים האדומים והכחולים, המתאימים ל-LC3 ול-DAPI. תמונות LC3 מציינות את ההתפלגות התאית של חלבון זה, בעוד DAPI מראה את הלוקליזציה הגרעינית. איור 2A מראה תמונה מייצגת של האימונופלואורסנציה של LC3 והתמזגותה עם צביעת DAPI בתאי PANC-1 בתנאי טיפול בסיסיים או בגמציטאבין. קבוצה של תמונות של צביעת LC3 נותחה באמצעות הכלי 3D Objects Counter בפיג'י. באמצעות תוכנה זו כומתה כמות נקודות LC3 לתא. גרף העמודות באיור 2B מראה את התוצאות של כימות נקודות LC3 בתאי PANC-1 בתנאי טיפול בסיסיים לעומת גמציטאבין. בגרף זה, נקודות LC3 גדלו באופן משמעותי תחת טיפול בגמציטאבין, כאשר מספר נקודות LC3 מציין ישירות את הפעילות האוטופגית. כמו כן, הוכחנו בעבר כי גמציטאבין מעורר אוטופגיה בתאי סרטן הלבלב12. בסך הכל, השיטה המוצגת במאמר זה מאפשרת לזהות את רמת העלייה בהפעלת אוטופגיה הנגרמת על ידי gemcitabine בתאים אלה.
בעוד פרוטוקול זה מתמקד בשימוש באימונופלואורסנציה LC3 כדי לקבוע פעילות אוטופגית בתאי סרטן הלבלב, הוא עשוי להיות מיושם על קווי תאים אחרים, כולל מודלים רלוונטיים יותר מבחינה פיזיולוגית. כדי לבחון את יעילות השיטה בהערכת תגובות פיזיולוגיות, נעשה שימוש בקו התאים AR42J. למרות שתאים אלה נגזרים מגידול לבלב אקסוקריני של חולדה, הם יכולים להתמיין לתאים אקסוקריניים עם גירוי גלוקוקורטיקואיד, ובכך להפוך אותם למודל לבלב מתאים 8,14,18. תאי AR42J התמינו עם טיפול 100 ננומטר dexamethasone במשך 48 שעות, ואחריו טיפול עם מעכב mTOR PP242 כדי לגרום אוטופגיה15. התוצאות המתקבלות מוצגות באיור 3, אשר מראה עלייה משמעותית במספר נקודות LC3 לכל תא תחת טיפול PP242.
עד כה הוכחנו כי השיטה המוצגת יעילה להערכת פעילות אוטופגית הן בתאים סרטניים והן במודל פיזיולוגי יותר. עם זאת, חשוב לציין כי סטיות קלות מהפרוטוקול המוצג עלולות לגרום לתוצאות בלתי ניתנות לפרשנות.
איור 4A מראה תמונה מייצגת מניסוי תת-אופטימלי שבו נזרעו יותר מדי תאים על הכיסויים, והתקבל מפגש יתר. ניסוי מסוג זה עשוי להיות בלתי ניתן לפירוש מסיבות שונות. ראשית, סוגי התאים המוזכרים בעבודה זו נגזרים מהלבלב האקסוקריני, שבו התאים מקובצים באצ'יני. תחת מפגש יתר, התאים האלה נוטים להיערם ולגדול זה על גבי זה (כמו למשל תא 1 ותא 2 באיור 4A, שנמצאים מעל תא 3 ותא 4). תופעה זו הופכת את זה לכמעט בלתי אפשרי לדעת לאיזה תא שייכות נקודות LC3, ובכך מקשה מאוד להעריך את מספר הנקודות בכל תא. מצד שני, תאים במפגש גבוה נוטים להיות בסטרס, מה שמפעיל אוטופגיה. כתוצאה מכך, ההבדלים ברמות האוטופגיות בין תאי הבקרה לתאים המטופלים עשויים לקטון עקב עלייה בפעילות האוטופגית ברקע.
באיור 4B, מוצגת תמונה מייצגת מסוג אחר של ניסוי תת-אופטימלי שבו התאים היו מקובעים עם פרפורמאלדהיד במקום מתנול. בעוד ששיטת קיבוע זו יעילה בדרך כלל לשימור מגוון חלבונים, היא אינה מתאימה ל- LC3, מכיוון שהתמונה המתקבלת אינה משקפת במדויק את התפלגות האמיתית שלה. טעות טכנית זו עלולה למנוע מציאת הבדלים בין רמות אוטופגיות נמוכות וגבוהות.
בדרך כלל, קווי תאים ניתן לטפל, transfected, או קבוע 1 יום לאחר הזריעה. עם זאת, חשוב להזכיר כי במקרה של תאי PANC-1, יש צורך להמתין יומיים לאחר הזריעה כדי להבטיח את ההיצמדות המלאה של התאים לכיסויי הזכוכית לפני שתמשיך בשלבים הבאים של הניסוי. איור 4C מראה תמונה מייצגת מניסוי שבו התאים טופלו בגמציטאבין רק יום אחד לאחר הזריעה. מן האיור, ניתן לראות כי התאים בניסוי זה היו בעלי צורה עגולה. מורפולוגיה זו הפחיתה את הקשר בין הציטופלסמה לגרעין, והקשתה על הבנת ההתפלגות התוך-תאית של LC3 ועל הבחנה בין רמות אוטופגיות נמוכות וגבוהות. חשוב לציין כי AR42J אין בעיה זו, והם מוכנים לטיפול או תיקון ביום שלאחר הזריעה.
תוצאה תת-אופטימלית נוספת יכולה להתקבל כאשר זמן קיבוע המתנול משתנה. זמני קיבוע קצרים יותר עלולים לגרום לקיבוע לא שלם, כפי שמיוצג באיור 4D, שבו התאים היו קבועים למשך 3 דקות. קיבוע לא שלם עלול להפריע לתיוג חיסוני תקין של LC3, מה שמוביל לתמונות לא ברורות ולכימות תת-אופטימלי.
איור 2: אימונופלואורסנציה LC3 בתאי PANC-1 בתנאי בסיס או גמציטאבין וכימות נקודות LC3. תאי PANC-1 טופלו בגמציטאבין של 20 מיקרומטר במשך 24 שעות או לא טופלו ולאחר מכן תויגו חיסונית עם אנטי-LC3. (A) מוצגות תמונות מייצגות של כל תנאי. סרגל קנה מידה: 10 מיקרומטר. (B) גרף העמודות מייצג את האמצעים ואת שגיאות התקן של האמצעים (SEM) של נקודות LC3 לתא עבור כל תנאי. N = 10 תאים לכל תנאי משלושה ניסויים עצמאיים. p < 0.001 על ידי מבחן t של סטודנט. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: אימונופלואורסנציה LC3 בתאי AR42J בתנאי בסיס או PP242 וכימות נקודות LC3. תאי AR42J התמינו עם 100 ננומטר dexamethasone במשך 48 שעות ולאחר מכן טופלו עם 1 μM PP242 במשך 2 שעות או נותרו ללא טיפול, ואחריו תיוג חיסוני עם anti-LC3. (A) מוצגות תמונות מייצגות של כל תנאי. סרגל קנה מידה: 10 מיקרומטר. (B) גרף העמודות מייצג את האמצעים ואת שגיאות התקן של האמצעים (SEM) של נקודות LC3 לתא עבור כל תנאי. N = 10 תאים לכל תנאי משלושה ניסויים עצמאיים. ** p < 0.01 על ידי מבחן t של סטודנט. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: ניסויים תת-אופטימליים. מוצגות תמונות מייצגות של LC3 immunofluorescence בניסויים תת-אופטימליים. סרגל קנה מידה: 10 מיקרומטר. (A) מפגש עודף: 7 × 104 תאי PANC-1 נזרעו, טופלו בגמציטבין, ותויגו חיסונית עם אנטי LC3. ארבעה תאים מסומנים כדי להראות שתא 1 ותא 2 נמצאים מעל תא 3 ותא 4. (B) קיבוע PFA: תאי PANC-1 טופלו בגמציטאבין, קובעו עם PFA ותויגו חיסונית עם אנטי-LC3. (C) מתיחה חלקית: תאי PANC-1 טופלו בגמציטאבין יום לאחר הזריעה ותויגו חיסונית באנטי-LC3. (D) קיבוע חלקי: תאי PANC-1 טופלו בגמציטאבין, קובעו במתנול למשך 3 דקות ותויגו חיסונית באנטי-LC3. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
השיטה המתוארת בפרוטוקול זה מאפשרת להמחיש את התפלגות LC3 האנדוגנית בתא ולכמת את הרמות האוטופגיות בתנאים שונים. שיטה דומה נוספת המשמשת לניתוח התפלגות LC3 ולקביעת הפעלת אוטופגיה כוללת טרנספקציה LC3 עם תווית פלואורסצנטית (כגון RFP-LC3)19. RFP-LC3 transfection יש את היתרונות של לא צריך קיבוע (המאפשר ליישם שיטה זו הדמיה תאים חיים20), להיות זול יותר, ולא תלוי תגובת נוגדנים LC3. מצד שני, immunofluorescence של LC3 יש את היתרון של מתן תמונה של LC3 אנדוגני, ובכך למנוע בעיות אפשריות הקשורות ביטוי יתר LC3, כגון היווצרות של אגרגטים חלבונים שאינם תלויים אוטופגיה21. יתר על כן, שיטה זו אינה תלויה בקלות ההדבקה של התאים, כלומר היא ישימה לקווי תאים מגוונים. עם זאת, בהתאם לנוגדן LC3 המשמש ותגובתיותו, ישנם כמה קווים תאיים שבהם זה לא יכול לעבוד. נוגדנים מסוימים עשויים לפעול היטב עבור מינים מסוימים אך לא עבור אחרים, גם כאשר הם תואמים תיאורטית למינים שונים. במקרה של הנוגדן המשמש בפרוטוקול זה (LC3B D11), מצאנו שהוא פועל באופן מושלם עבור תאים אנושיים (PANC-1, HEK293T, HeLa) ותאי חולדה (AR42J). עם זאת, זה לא עובד עבור תאי עכבר (תאי MEF), כפי שראינו צביעה גרעינית לא ספציפית. ראוי לציין כי לכימות כתמי LC3, בין אם הם אנדוגניים או מבוטאים יתר על המידה, יש מגבלות בהבחנה בין שינויים בהפעלת אוטופגיה, אשר עשויים להצביע על ייצור מוגבר של LC3-II, לבין שינויים בהשפלה LC3-II, אשר עשויים להצביע על מצב שטף אוטופגי. ניתן להשתמש בשיטות נוספות כדי להעריך באופן מקיף את פעילות האוטופגיה. לדוגמה, השימוש בביטוי RFP-GFP-LC3 יכול לספק הערכה מדויקת על ידי הבחנה בין LC3-II בתוך או מחוץ לליזוזום22,23.
כפי שניתן לראות באיור 4, ישנם כמה שלבים קריטיים בפרוטוקול שאסור לשנותם, בהתחשב בכך שהשינוי שלהם יכול להוביל לתוצאות לא אופטימליות. ראשית, חשוב להגדיר את מספר התאים הנכון שיש לזרוע. כאשר לא נזרעים מספיק תאים, הם נוטים לא להתנגד לטרנספקציה או לטיפולים ונשארים מעוגלים. להיפך, כאשר תאים נזרעים עודף, הם נוטים לגדול על גבי התאים השכנים, מה שהופך את זה מאתגר להתמקד בתאים בודדים ולהבחין בין נקודות LC3 שלהם. יש לציין שבמצבים שבהם תאים נמצאים בקרבת מקום אך אינם חופפים כפי שמתואר באיור 4A, ייתכן שיהיה מועיל להשתמש בצביעת מערכת החיסון עם סמנים ספציפיים של הממברנה, כמו למשל EGFR, כדי להבחין בין הסמנים החיוביים השייכים לכל תא24. עם זאת, חשוב לציין כי סמנים מסוימים כמו E-cadherin ו- EpCAM אינם מתאימים למטרה זו בתאי PANC-1 בשל ביטוי הממברנה המופחת שלהם, הנובע מתהליך המעבר אפיתל-מזנכימלי טיפוסי הקשור לסוג תא זה25,26,27. שנית, כאשר עובדים במיוחד עם תאי PANC-1, חיוני להמתין לפחות יום אחד בין הזריעה לבין השלבים הבאים של הניסוי. לעומת זאת, כאשר לא מחכים לזמן הנכון, ניתן לעגל את התאים, מה שמקשה על פירוש התוצאות. שלישית, קיבוע הוא שלב קריטי בפרוטוקול זה. כפי שהראינו, השיטה עובדת רק עם קיבוע מתנול נאות. קיבוע Paraformaldehyde אינו פועל כראוי עבור תיוג חיסוני LC3, בעוד זמן קיבוע מתנול לא צריך להיות שונה, בהתחשב בכך זמנים קצרים יותר עלול להוביל קיבוע חלקי. בדקנו זמני קיבוע מתנול עד שעה ולא ראינו הבדלים בסימון LC3. עם זאת, אנו ממליצים שלא להשתמש בזמני קיבוע ממושכים, שכן קיבוע מתנול עלול להוביל לאובדן חלבונים תאיים מסיסים ומולקולות פלואורסצנטיות חופשיות28. לכן, מומלץ לדבוק בזמן הקיבוע הסטנדרטי כדי להבטיח תוצאות מדויקות ומהימנות.
שינויים מסוימים עשויים להתקבל בפרוטוקול המתואר. לדוגמה, ניתן להשתמש בצלחת 12 בארות במקום צלחת 24 בארות, כמו גם לגדל את התאים מעל כיסויים עגולים של 15 מ"מ במקום כיסויים של 12 מ"מ. במקרה זה, יש לשקול כי מספר התאים שיש לזרוע, כמו גם את הכרכים של ריאגנטים בשימוש, יהיה גדול יותר מאלה המתוארים בפרוטוקול זה. במקרה זה, יש לזרוע 4 × 10 4 PANC-1 ו- 6.5 × 104 AR42J. בנוסף, ניתן להחליף את פתרון החסימה המשומש באחרים, כמו 1% BSA ב- PBS, וזה יוביל לתוצאות דומות. באותו אופן, זמן החסימה ניתן להגדיל עד 24 שעות מבלי לשנות באופן משמעותי את התוצאות. זמני הדגירה והריכוז של הנוגדנים עשויים להיות מותאמים ויכולים להשתנות, למשל, אם משתמשים בנוגדן LC3 אחר. למרות שפתרון PVA-DABCO מוכן במחקר זה, ניתן להשתמש גם בפתרונות מונטאז' מסחריים. מצד שני, ניתן לשנות את שיטת הכימות. לדוגמה, החלת מסננים או מסיכות מסוימים על התמונות אפשרית, וניתן להשתמש בכלי חלופי לכימות נקודות.
בעבודה זו, כיוונו את היישום של immunofluorescence של LC3 כדי לחקור את ההתנהגות של תאים סרטניים הלבלב. בתאים אלה, אוטופגיה מופעלת באופן בסיסי ועשויה להיות מווסתת כתגובה למצבים מלחיצים מגוונים, כגון כימותרפיה, היפוקסיה או מחסור תזונתי11,12. קביעת אוטופגיה בתאים אלה עשויה להיות ישימה לחקר התגובה התאית לכימותרפיה, הקרנות או טיפולים אחרים המווסתים אוטופגיה. כפי שניתן לראות באיור 3, השיטה המוצגת יכולה להיות מיושמת במודלים פיזיולוגיים. אמנם, בעבודה זו, התמקדנו בכימות של רמות אוטופגיות, האימונופלואורסנציה של LC3 עשויה גם לאפשר הערכה של לוקליזציה בין LC3 וחלבונים מגוונים. זה יכול לשמש, למשל, כגישה מכניסטית לסמן חלבונים בנקודות שונות בתהליך אוטופגי ולהעריך אם colocalization עם LC3 מושפע על ידי טיפולים מסוימים או על ידי downregulation של כמה חלבונים. בדרך זו, ניתן לקבוע, למשל, אם מעכב אוטופגיה כלשהו קוטע את השטף האוטופגי לפני או אחרי צימוד LC3. לבסוף, ניתן להתאים את השיטה גם לדגימות רקמה כדי לקבוע הפעלת אוטופגיה במודלים של בעלי חיים או דגימות ביופסיה אנושיות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
לא הוכרז על ניגוד עניינים.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מאוניברסיטת בואנוס איירס (UBACyT 2018-2020, 20020170100082BA), המועצה הלאומית למחקר מדעי וטכנולוגיה (CONICET) (PIP 2021-2023 GI− 11220200101549CO; ו- PUE 22920170100033) והסוכנות הלאומית לקידום מדעי וטכנולוגי (PICT 2019-01664).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Corning | 46-013-CM | |
| 12 mm round coverslips | HDA | CBR_OBJ_6467 | |
| 24 Well- Cell Culture Plate | Sorfa | 220300 | |
| Absolute ethanol | Biopack | 2207.10.00 | |
| Alexa Fluor 594 Donkey anti-rabbit IgG (H+L) | Invitrogen | R37119 | |
| Confocal Laser Scanning Microscope | Zeiss | LSM 800 | |
| Dexamethasone | Sigma Aldrich | D4902 | |
| DMEN | Sartorius | 01-052-1A | |
| Fetal Bovine Serum | NATOCOR | Lintc-634 | |
| Gemcitabina | Eli Lilly | VL7502 | |
| LC3B (D11) XP Rabbit mAb | Cell Signaling Technology | 3868S | |
| Methanol | Anedra | 6197 | |
| Parafilm "M" (Laboratory Sealing Film) | Bemis/Curwood | PM-996 | |
| Pen-Strep Solution | Sartorius | 03-031-1B | |
| PP242 | Santa Cruz Biotechnology | SC-301606 | |
| Trypsin EDTA | Gibco | 11570626 |
References
- Grasso, D., Renna, F. J., Vaccaro, M. I. Initial steps in mammalian autophagosome biogenesis. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 6, 146 (2018).
- Galluzzi, L., et al. Molecular definitions of autophagy and related processes. EMBO Journal. 36 (13), 1811-1836 (2017).
- Kitada, M., Koya, D. Autophagy in metabolic disease and ageing. Nature Reviews Endocrinology. 17 (11), 647-661 (2021).
- Ktistakis, N. T., Tooze, S. A.
- Tanida, I., Ueno, T., Kominami, E.
- Kabeya, Y., et al. LC3, a mammalian homologue of yeast Apg8p, is localized in autophagosome membranes after processing. EMBO Journal. 19 (21), 5720-5728 (2000).
- Mizushima, N., Yoshimori, T. How to interpret LC3 immunoblotting. Autophagy. 3 (6), 542-545 (2007).
- Vanasco, V., et al. Mitochondrial dynamics and VMP1-related selective mitophagy in experimental acute pancreatitis. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 640094 (2021).
- Williams, J. A. Regulatory mechanisms in pancreas and salivary acini. Annual Review of Physiology. 46, 361-375 (1984).
- Mizrahi, J. D., Surana, R., Valle, J. W., Shroff, R. T.
- Li, J., et al. Regulation and function of autophagy in pancreatic cancer. Autophagy. 17 (11), 3275-3296 (2021).
- Ropolo, A., et al. A novel E2F1-EP300-VMP1 pathway mediates gemcitabine-induced autophagy in pancreatic cancer cells carrying oncogenic KRAS. Frontiers in Endocrinology. 11, 411 (2020).
- Pardo, R., et al. Gemcitabine induces the VMP1-mediated autophagy pathway to promote apoptotic death in human pancreatic cancer cells. Pancreatology. 10 (1), 19-26 (2010).
- Logsdon, C. D., Moessner, J., Williams, J. A., Goldfine, I. D. Glucocorticoids increase amylase mRNA levels, secretory organelles, and secretion in pancreatic acinar AR42J cells. Journal of Cell Biology. 100 (4), 1200-1208 (1985).
- Klionsky, D. J., et al. Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy (4th edition). Autophagy. 17 (1), 1 (2021).
- Segeritz, C. -P., Vallier, L. Chapter 9 - Cell culture: Growing cells as model systems in vitro. Basic Science Methods for Clinical Researchers. Jalali, M., Saldanha, F. Y. L., Jalali, M. , Academic Press. Cambridge, MA. 151-172 (2017).
- Elliott, A. D. Confocal microscopy: Principles and modern practices. Current Protocols in Cytometry. 92 (1), 68 (2020).
- Grasso, D., et al. a novel selective autophagy pathway mediated by VMP1-USP9x-p62, prevents pancreatic cell death. Journal of Biological Chemistry. 286 (10), 8308-8324 (2011).
- Ropolo, A., et al. The pancreatitis-induced vacuole membrane protein 1 triggers autophagy in mammalian cells. Journal of Biological Chemistry. 282 (51), 37124-37133 (2007).
- Karanasios, E., Stapleton, E., Walker, S. A., Manifava, M., Ktistakis, N. T. Live cell imaging of early autophagy events: Omegasomes and beyond. Journal of Visualized Experiments. (77), e50484 (2013).
- Kuma, A., Matsui, M., Mizushima, N. LC3, an autophagosome marker, can be incorporated into protein aggregates independent of autophagy: caution in the interpretation of LC3 localization. Autophagy. 3 (4), 323-328 (2007).
- Zhang, Z., Singh, R., Aschner, M. Methods for the detection of autophagy in mammalian cells. Current Protocols in Toxicology. 69, 1-26 (2016).
- Yoshii, S. R., Mizushima, N.
- Betriu, N., Andreeva, A., Semino, C. E. Erlotinib promotes ligand-induced EGFR degradation in 3D but not 2D cultures of pancreatic ductal adenocarcinoma cells. Cancers. 13 (18), 4504 (2021).
- Wang, W., Dong, L., Zhao, B., Lu, J., Zhao, Y. E-cadherin is downregulated by microenvironmental changes in pancreatic cancer and induces EMT. Oncology Reports. 40 (3), 1641-1649 (2018).
- Kim, S. K., et al. Phenotypic heterogeneity and plasticity of cancer cell migration in a pancreatic tumor three-dimensional culture model. Cancers. 12 (5), 1305 (2020).
- Meng, Y., et al. Cytoplasmic EpCAM over-expression is associated with favorable clinical outcomes in pancreatic cancer patients with Hepatitis B virus negative infection. International Journal of Clinical and Experimental Medicine. 8 (12), 22204-22216 (2015).
- Brock, R., Hamelers, I. H., Jovin, T. M. Comparison of fixation protocols for adherent cultured cells applied to a GFP fusion protein of the epidermal growth factor receptor. Cytometry. 35 (4), 353-362 (1999).
