Evaluering af autofaginiveauer i to forskellige bugspytkirtelcellemodeller ved hjælp af LC3-immunofluorescens
Summary
Målet med denne protokol er at bestemme autofagiske niveauer i kræft i bugspytkirtlen og pancreas acinarceller gennem LC3 immunofluorescens og LC3 dot kvantificering.
Abstract
Autofagi er en specialiseret katabolisk proces, der selektivt nedbryder cytoplasmatiske komponenter, herunder proteiner og beskadigede organeller. Autofagi gør det muligt for celler fysiologisk at reagere på stressstimuli og dermed opretholde cellulær homeostase. Kræftceller kan modulere deres autofaginiveauer for at tilpasse sig ugunstige tilstande som hypoxi, næringsstofmangel eller skader forårsaget af kemoterapi. Ductal pancreas adenocarcinom er en af de dødeligste former for kræft. Kræftceller i bugspytkirtlen har høj autofagiaktivitet på grund af transkriptionel opregulering og posttranslationel aktivering af autofagiproteiner.
Her blev PANC-1-cellelinjen brugt som model af humane kræftceller i bugspytkirtlen, og AR42J-pancreas acinarcellelinjen blev brugt som en fysiologisk model af højt differentierede pattedyrceller. Denne undersøgelse anvendte immunofluorescensen af mikrotubulusassocieret protein lyskæde 3 (LC3) som en indikator for status for autofagiaktivering. LC3 er et autofagiprotein, der under basale forhold viser et diffust fordelingsmønster i cytoplasmaet (kendt som LC3-I i denne tilstand). Autofagi induktion udløser konjugering af LC3 til phosphatidylethanolamin på overfladen af nydannede autofagosomer til dannelse af LC3-II, et membranbundet protein, der hjælper med dannelsen og udvidelsen af autofagosomer. For at kvantificere antallet af mærkede autofagiske strukturer blev open source-softwaren FIJI brugt ved hjælp af værktøjet “3D Objects Counter”.
Målingen af de autofagiske niveauer både under fysiologiske forhold og i kræftceller giver os mulighed for at studere moduleringen af autofagi under forskellige forhold som hypoxi, kemoterapibehandling eller knockdown af visse proteiner.
Introduction
Makroautofagi (almindeligvis benævnt autofagi) er en specialiseret katabolisk proces, der selektivt nedbryder cytoplasmatiske komponenter, herunder proteiner og beskadigede organeller 1,2. Autofagi gør det muligt for celler fysiologisk at reagere på stressstimuli og dermed opretholde cellulær homeostase3. Under autofagi dannes en dobbelt membranvesikel: autofagosomet. Autofagosomet indeholder lastmolekylerne og driver dem til lysosomet for nedbrydning 1,4.
Autofagosomer er dekoreret af det autofagiske protein mikrotubulus-associerede protein lyskæde 3 (LC3)5. Når autofagi ikke induceres, diffunderes LC3 i cytoplasmaet og kernen i LC3-I-konformationen. På den anden side, når autofagi induceres, konjugeres LC3 med et phosphatidylethanolamin i membranen i de autofagiske strukturer6. Denne nye LC3-konformation er kendt som LC3-II1. LC3-konformationsskiftet forårsager ændringer i dets cellulære lokalisering og dets dodecylnatriumsulfat-polyacrylamidgelelektroforese (SDS-PAGE) migration, som kan detekteres ved teknikker som immunofluorescens og western blot 5,7. På denne måde er LC3-konjugering en nøglebegivenhed i den autofagiske proces, der kan bruges til at måle autofagisk aktivitet.
Acinarcellen i bugspytkirtlen er en stærkt differentieret celle, der under sunde forhold har en lav autofagi. Under forskellige fysiologiske forhold eller under farmakologisk stimulering kan de imidlertid aktivere autofagi. Derfor er bestemmelsen af autofagiske niveauer i denne cellelinje nyttig til undersøgelse af de potentielle direkte eller indirekte virkninger af forskellige farmakologiske eller biologiske agenser på autofagi 8,9.
Duktalt pancreas adenocarcinom er en af de dødeligste kræftformer i betragtning af dens sene diagnose og dens høje kemoterapiresistens10. Kræftceller i bugspytkirtlen har høj autofagiaktivitet på grund af transkriptionel opregulering og posttranslationel aktivering af autofagirelaterede proteiner11. Kræftceller i bugspytkirtlen kan justere deres autofaginiveauer som reaktion på ugunstige tilstande som hypoxi, næringsstofmangel eller kemoterapi-induceret skade11. Derfor kan analyse af autofaginiveauerne i kræftceller i bugspytkirtlen hjælpe med at forstå, hvordan de tilpasser sig forskellige miljøer og evaluere effektiviteten af autofagimodulerende behandlinger.
Denne undersøgelse viser en metode til at udføre LC3-immunfluorescens i to forskellige cellulære modeller i bugspytkirtlen. Den første model, PANC-1-celler, tjente som model for pancreas ductal adenocarcinom. Disse celler blev behandlet med gemcitabin, et kemoterapimiddel, der tidligere har vist sig at inducere autofagi, specifikt i kræftceller i bugspytkirtlen, der bærer det onkogene Kirsten rottesarkomvirusgen (KRAS)12,13. Den anden model, AR42J-celler, fungerede som en mere fysiologisk model af eksokrine bugspytkirtelceller. Disse celler blev differentieret med dexamethason for at blive mere lig acinar bugspytkirtelceller14. I disse celler blev autofagi farmakologisk induceret ved anvendelse af PP242, som er en potent mTOR-hæmmer15. I denne undersøgelse demonstrerer vi anvendeligheden af den beskrevne protokol med to forskellige bugspytkirtelmodeller og dens evne til at skelne mellem tilstande med lav og høj autofagi.
Protocol
Representative Results
Discussion
Metoden beskrevet i denne protokol gør det muligt at visualisere den endogene LC3-fordeling i cellen og kvantificere de autofagiske niveauer under forskellige forhold. En anden lignende metode, der anvendes til at analysere LC3-fordelingen og bestemme autofagiaktivering, involverer fluorescensmærket LC3-transfektion (såsom RFP-LC3)19. RFP-LC3-transfektion har fordelene ved ikke at have brug for fiksering (hvilket gør det muligt at anvende denne metode i levende cellebilleddannelse<sup class="x…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af tilskud fra universitetet i Buenos Aires (UBACyT 2018-2020 20020170100082BA), National Council for Scientific Research and Technology (CONICET) (PIP 2021-2023 GI− 11220200101549CO; og PUE 22920170100033) og National Agency for Scientific and Technological Promotion (PICT 2019-01664).
Materials
| 10x Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Corning | 46-013-CM | |
| 12 mm round coverslips | HDA | CBR_OBJ_6467 | |
| 24 Well- Cell Culture Plate | Sorfa | 220300 | |
| Absolute ethanol | Biopack | 2207.10.00 | |
| Alexa Fluor 594 Donkey anti-rabbit IgG (H+L) | Invitrogen | R37119 | |
| Confocal Laser Scanning Microscope | Zeiss | LSM 800 | |
| DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride) | Invitrogen | 62248 | |
| Dexamethasone | Sigma Aldrich | D4902 | |
| DMEN | Sartorius | 01-052-1A | |
| Fetal Bovine Serum | NATOCOR | Lintc-634 | |
| Gemcitabina | Eli Lilly | VL7502 | |
| LC3B (D11) XP Rabbit mAb | Cell Signaling Technology | 3868S | |
| Methanol | Anedra | 6197 | |
| Parafilm "M" (Laboratory Sealing Film) | Bemis/Curwood | PM-996 | |
| Pen-Strep Solution | Sartorius | 03-031-1B | |
| PP242 | Santa Cruz Biotechnology | SC-301606 | |
| Trypsin EDTA | Gibco | 11570626 |
References
- Grasso, D., Renna, F. J., Vaccaro, M. I. Initial steps in mammalian autophagosome biogenesis. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 6, 146 (2018).
- Galluzzi, L., et al. Molecular definitions of autophagy and related processes. EMBO Journal. 36 (13), 1811-1836 (2017).
- Kitada, M., Koya, D. Autophagy in metabolic disease and ageing. Nature Reviews Endocrinology. 17 (11), 647-661 (2021).
- Ktistakis, N. T., Tooze, S. A. Digesting the expanding mechanisms of autophagy. Trends in Cell Biology. 26 (8), 624-635 (2016).
- Tanida, I., Ueno, T., Kominami, E. LC3 and autophagy. Methods in Molecular Biology. 445, 77-88 (2008).
- Kabeya, Y., et al. LC3, a mammalian homologue of yeast Apg8p, is localized in autophagosome membranes after processing. EMBO Journal. 19 (21), 5720-5728 (2000).
- Mizushima, N., Yoshimori, T. How to interpret LC3 immunoblotting. Autophagy. 3 (6), 542-545 (2007).
- Vanasco, V., et al. Mitochondrial dynamics and VMP1-related selective mitophagy in experimental acute pancreatitis. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 640094 (2021).
- Williams, J. A. Regulatory mechanisms in pancreas and salivary acini. Annual Review of Physiology. 46, 361-375 (1984).
- Mizrahi, J. D., Surana, R., Valle, J. W., Shroff, R. T. Pancreatic cancer. Lancet. 395 (10242), 2008-2020 (2020).
- Li, J., et al. Regulation and function of autophagy in pancreatic cancer. Autophagy. 17 (11), 3275-3296 (2021).
- Ropolo, A., et al. A novel E2F1-EP300-VMP1 pathway mediates gemcitabine-induced autophagy in pancreatic cancer cells carrying oncogenic KRAS. Frontiers in Endocrinology. 11, 411 (2020).
- Pardo, R., et al. Gemcitabine induces the VMP1-mediated autophagy pathway to promote apoptotic death in human pancreatic cancer cells. Pancreatology. 10 (1), 19-26 (2010).
- Logsdon, C. D., Moessner, J., Williams, J. A., Goldfine, I. D. Glucocorticoids increase amylase mRNA levels, secretory organelles, and secretion in pancreatic acinar AR42J cells. Journal of Cell Biology. 100 (4), 1200-1208 (1985).
- Klionsky, D. J., et al. Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy (4th edition). Autophagy. 17 (1), 1 (2021).
- Segeritz, C. -. P., Vallier, L., Jalali, M., Saldanha, F. Y. L., Jalali, M. Chapter 9 – Cell culture: Growing cells as model systems in vitro. Basic Science Methods for Clinical Researchers. , 151-172 (2017).
- Elliott, A. D. Confocal microscopy: Principles and modern practices. Current Protocols in Cytometry. 92 (1), 68 (2020).
- Grasso, D., et al. a novel selective autophagy pathway mediated by VMP1-USP9x-p62, prevents pancreatic cell death. Journal of Biological Chemistry. 286 (10), 8308-8324 (2011).
- Ropolo, A., et al. The pancreatitis-induced vacuole membrane protein 1 triggers autophagy in mammalian cells. Journal of Biological Chemistry. 282 (51), 37124-37133 (2007).
- Karanasios, E., Stapleton, E., Walker, S. A., Manifava, M., Ktistakis, N. T. Live cell imaging of early autophagy events: Omegasomes and beyond. Journal of Visualized Experiments. (77), e50484 (2013).
- Kuma, A., Matsui, M., Mizushima, N. LC3, an autophagosome marker, can be incorporated into protein aggregates independent of autophagy: caution in the interpretation of LC3 localization. Autophagy. 3 (4), 323-328 (2007).
- Zhang, Z., Singh, R., Aschner, M. Methods for the detection of autophagy in mammalian cells. Current Protocols in Toxicology. 69, 1-26 (2016).
- Yoshii, S. R., Mizushima, N. Monitoring and measuring autophagy. International Journal of Molecular Sciences. 18 (9), 1865 (2017).
- Betriu, N., Andreeva, A., Semino, C. E. Erlotinib promotes ligand-induced EGFR degradation in 3D but not 2D cultures of pancreatic ductal adenocarcinoma cells. Cancers. 13 (18), 4504 (2021).
- Wang, W., Dong, L., Zhao, B., Lu, J., Zhao, Y. E-cadherin is downregulated by microenvironmental changes in pancreatic cancer and induces EMT. Oncology Reports. 40 (3), 1641-1649 (2018).
- Kim, S. K., et al. Phenotypic heterogeneity and plasticity of cancer cell migration in a pancreatic tumor three-dimensional culture model. Cancers. 12 (5), 1305 (2020).
- Meng, Y., et al. Cytoplasmic EpCAM over-expression is associated with favorable clinical outcomes in pancreatic cancer patients with Hepatitis B virus negative infection. International Journal of Clinical and Experimental Medicine. 8 (12), 22204-22216 (2015).
- Brock, R., Hamelers, I. H., Jovin, T. M. Comparison of fixation protocols for adherent cultured cells applied to a GFP fusion protein of the epidermal growth factor receptor. Cytometry. 35 (4), 353-362 (1999).
