使用LC3免疫荧光评估两种不同胰腺细胞模型中的自噬水平
Summary
该协议的目标是通过LC3免疫荧光和LC3点定量确定胰腺癌和胰腺腺泡细胞中的自噬水平。
Abstract
自噬是一种特殊的分解代谢过程，可选择性降解细胞质成分，包括蛋白质和受损细胞器。自噬允许细胞对压力刺激做出生理反应，从而维持细胞稳态。癌细胞可能会调节其自噬水平以适应不良条件，如缺氧、营养缺乏或化疗造成的损害。导管胰腺腺癌是最致命的癌症类型之一。胰腺癌细胞由于自噬蛋白的转录上调和翻译后激活而具有高自噬活性。
这里，PANC-1细胞系被用作胰腺人癌细胞的模型，AR42J胰腺腺泡细胞系被用作高度分化的哺乳动物细胞的生理模型。本研究使用微管相关蛋白轻链3（LC3）的免疫荧光作为自噬激活状态的指标。LC3是一种自噬蛋白，在基础条件下，在细胞质中显示出弥漫分布模式（在这种情况下称为LC3-I）。自噬诱导触发LC3与新形成的自噬体表面的磷脂酰乙醇胺的结合，形成LC3-II，这是一种有助于自噬体形成和扩增的膜结合蛋白。为了量化标记的自噬结构的数量，在“3D对象计数器”工具的帮助下使用了开源软件FIJI。
生理条件和癌细胞中自噬水平的测量使我们能够研究在缺氧、化疗或敲低某些蛋白质等不同条件下自噬的调节。
Introduction
巨自噬（通常称为自噬）是一种特殊的分解代谢过程，可选择性降解细胞质成分，包括蛋白质和受损细胞器1，2。自噬允许细胞对应激刺激做出生理反应，从而维持细胞稳态3。在自噬过程中，形成双膜囊泡：自噬体。自噬体包含货物分子并驱动它们到溶酶体进行降解1，4。
自噬体由自噬蛋白微管相关蛋白轻链3（LC3）5修饰。当不诱导自噬时，LC3以LC3-I构象扩散在细胞质和细胞核中。另一方面，当诱导自噬时，LC3与自噬结构6中的磷脂酰乙醇胺偶联。这种新的LC3构象被称为LC3-II1。LC3构象转移导致其细胞定位及其十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）迁移发生变化，这可以通过免疫荧光和蛋白质印迹5，7等技术检测到。通过这种方式，LC3偶联是自噬过程中的关键事件，可用于测量自噬活性。
胰腺腺泡细胞是一种高度分化的细胞，在健康条件下，自噬率较低。然而，在不同的生理条件下或在药物刺激下，它们可以激活自噬。因此，测定该细胞系中的自噬水平有助于研究不同药理学或生物制剂对自噬的潜在直接或间接影响8，9。
导管胰腺腺癌是最致命的癌症类型之一，因为它诊断较晚，化疗耐药性高10。由于自噬相关蛋白的转录上调和翻译后活化，胰腺癌细胞具有高自噬活性11。胰腺癌细胞可能会调整其自噬水平，以应对缺氧、营养剥夺或化疗引起的损伤等不利条件11。因此，分析胰腺癌细胞中的自噬水平可以帮助了解它们如何适应不同的环境，并评估自噬调节治疗的有效性。
这项研究展示了一种在两种不同的胰腺细胞模型中进行LC3免疫荧光的方法。第一个模型PANC-1细胞作为胰腺导管腺癌的模型。这些细胞用吉西他滨处理，吉西他滨是一种化疗药物，以前已被证明可以诱导自噬，特别是在携带致癌Kirsten大鼠肉瘤病毒基因（KRAS）的胰腺癌细胞中12，13。第二种模型AR42J细胞作为胰腺外分泌细胞的更生理模型。这些细胞用地塞米松分化，使其与腺泡胰腺细胞更相似14。在这些细胞中，通过使用PP242（一种有效的mTOR抑制剂15）在药理学上诱导自噬。在这项研究中，我们证明了用两种不同的胰腺模型描述的方案的适用性及其区分低自噬和高自噬状态的能力。
Protocol
Representative Results
Discussion
该协议中描述的方法允许可视化细胞中的内源性LC3分布并量化不同条件下的自噬水平。另一种用于分析LC3分布和确定自噬激活的类似方法涉及荧光标记的LC3转染（如RFP-LC3）19。RFP-LC3转染的优点是不需要固定（允许将该方法应用于活细胞成像20），更便宜，并且不依赖于LC3抗体反应性。另一方面，LC3的免疫荧光具有提供内源性LC3图像的优点，从而避免了与LC3过表?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作得到了布宜诺斯艾利斯大学（UBACyT 2018-2020 20020170100082BA）、国家科学研究与技术委员会（CONICET）（PIP 2021-2023 GI− 11220200101549CO;和PUE 22920170100033）和国家科学技术促进局（PICT 2019-01664）的资助。
Materials
| 10x Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Corning | 46-013-CM | |
| 12 mm round coverslips | HDA | CBR_OBJ_6467 | |
| 24 Well- Cell Culture Plate | Sorfa | 220300 | |
| Absolute ethanol | Biopack | 2207.10.00 | |
| Alexa Fluor 594 Donkey anti-rabbit IgG (H+L) | Invitrogen | R37119 | |
| Confocal Laser Scanning Microscope | Zeiss | LSM 800 | |
| DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride) | Invitrogen | 62248 | |
| Dexamethasone | Sigma Aldrich | D4902 | |
| DMEN | Sartorius | 01-052-1A | |
| Fetal Bovine Serum | NATOCOR | Lintc-634 | |
| Gemcitabina | Eli Lilly | VL7502 | |
| LC3B (D11) XP Rabbit mAb | Cell Signaling Technology | 3868S | |
| Methanol | Anedra | 6197 | |
| Parafilm "M" (Laboratory Sealing Film) | Bemis/Curwood | PM-996 | |
| Pen-Strep Solution | Sartorius | 03-031-1B | |
| PP242 | Santa Cruz Biotechnology | SC-301606 | |
| Trypsin EDTA | Gibco | 11570626 |
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