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Behavior

एलिगेंस लॉन अवॉइडेंस परख के लिए एक स्मार्टफोन-आधारित इमेजिंग विधि

Published: February 24, 2023 doi: 10.3791/65197
Automatic Translation
1, 2, 1
1Department of Physiology, Mitohormesis Research Center, Yonsei University Wonju College of Medicine, 2Division of Biological Science and Technology, College of Science and Technology, Yonsei University, Mirae Campus

Summary

यह लेख स्मार्टफोन और प्रकाश उत्सर्जक डायोड (एलईडी) प्रकाश बॉक्स जैसे आसानी से उपलब्ध वस्तुओं का उपयोग करके, कैनोरहाब्डिस एलिगेंस के लॉन से बचने के व्यवहार को रिकॉर्ड करने की एक सरल, कम लागत वाली विधि का वर्णन करता है। हम वीडियो फ़ाइल को गिनती के लिए अधिक उपयुक्त प्रारूप में संसाधित करने के लिए एक पायथन स्क्रिप्ट भी प्रदान करते हैं।

Abstract

विषाक्त या रोगजनक बैक्टीरिया के संपर्क में आने पर, नेमाटोड केनोरहाब्डिस एलिगेंस एक सीखा लॉन परिहार व्यवहार प्रदर्शित करता है, जिसमें कीड़े धीरे-धीरे अपने खाद्य स्रोत को छोड़ देते हैं और जीवाणु लॉन के बाहर रहना पसंद करते हैं। परख हानिकारक परिस्थितियों का ठीक से जवाब देने के लिए बाहरी या आंतरिक संकेतों को समझने की कीड़े की क्षमता का परीक्षण करने का एक आसान तरीका है। हालांकि एक सरल परख, गिनती समय लेने वाली है, विशेष रूप से कई नमूनों के साथ, और परख अवधि जो रात भर फैली हुई है, शोधकर्ताओं के लिए असुविधाजनक है। एक इमेजिंग सिस्टम जो लंबी अवधि में कई प्लेटों की छवि बना सकता है, उपयोगी लेकिन महंगा है। यहां, हम सी एलिगेंस में लॉन से बचने को रिकॉर्ड करने के लिए एक स्मार्टफोन-आधारित इमेजिंग विधि का वर्णन करते हैं। इस विधि के लिए केवल एक स्मार्टफोन और एक प्रकाश उत्सर्जक डायोड (एलईडी) प्रकाश बॉक्स की आवश्यकता होती है, जो संचारित प्रकाश स्रोत के रूप में काम करता है। फ्री टाइम-लैप्स कैमरा एप्लिकेशन का उपयोग करके, प्रत्येक फोन लॉन के बाहर मैन्युअल रूप से कीड़े गिनने के लिए पर्याप्त तीखेपन और विपरीत छह प्लेटों तक छवि बना सकता है। परिणामी फिल्मों को हर घंटे के समय बिंदु के लिए 10 एस ऑडियो वीडियो इंटरलीव (एवीआई) फाइलों में संसाधित किया जाता है, फिर प्रत्येक प्लेट को दिखाने के लिए क्रॉप किया जाता है ताकि उन्हें गिनती के लिए अधिक उत्तरदायी बनाया जा सके। यह विधि उन लोगों के लिए एक लागत प्रभावी तरीका है जो परिहार दोषों की जांच करना चाहते हैं और संभावित रूप से अन्य सी एलिगेंस परखों तक बढ़ाया जा सकता है।

Introduction

एलिगेंस का अध्ययन करने के कई फायदों के बीच, इसका सरल तंत्रिका तंत्र यह अध्ययन करने का अवसर प्रदान करता है कि आनुवंशिक और सेलुलर स्तर पर परिवर्तन नेटवर्क फ़ंक्शन और व्यवहार आउटपुट को कैसे प्रभावित करते हैं। सीमित संख्या में न्यूरॉन्स होने के बावजूद, सी एलिगेंस जटिल व्यवहारों की एक विस्तृत श्रृंखला प्रदर्शित करते हैं। इनमें से एक लॉन से बचाव है, जिसमें जीवाणुभक्षी नेमाटोड जीवाणु लॉन को छोड़कर एक हानिकारक खाद्य स्रोत का जवाब देता है। एलिगेंस रोगजनक बैक्टीरिया 1,2,3 के लॉन से बचते हैं, बैक्टीरिया के लॉन जो विषाक्त पदार्थों का उत्पादन करते हैं या विषाक्तपदार्थों के साथ स्पाइक किए जाते हैं 1,4, और यहां तक कि आरएनएआई-व्यक्त करने वाले बैक्टीरिया जिनका लक्ष्य जीन वध कीड़े के स्वास्थ्य के लिए हानिकारक है। अध्ययनों से पता चला है कि कीड़े रोगजनक बैक्टीरिया 1,6 द्वारा उत्पादित मेटाबोलाइट्स जैसे बाहरी संकेतों का जवाब देते हैं, या आंतरिक संकेत जो इंगित करते हैं कि भोजन उन्हें बीमार कर रहा है 4,7। इन संकेतों को संरक्षित सिग्नलिंग मार्गों के माध्यम से संसाधित किया जाता है, जैसे कि माइटोजन-सक्रिय प्रोटीन काइनेज (एमएपी) मार्ग और ट्रांसफॉर्मिंग ग्रोथ फैक्टर बीटा (टीजीएफ) मार्ग, और आंत और तंत्रिका तंत्र 4,6,7,8 के बीच संचार की आवश्यकता होती है।

यद्यपि परख सरल है, सीखा व्यवहार कई घंटों में विकसित होता है, अक्सर रात भर में। जबकि ऐसे उत्परिवर्ती हैं जो छोड़ने में असमर्थ हैं, इस मामले में दोष प्रदर्शित करने के लिए केवल एक समय बिंदु पर स्कोरिंग से बचना पर्याप्त है, कई उत्परिवर्ती अंततः छोड़ देते हैं लेकिन बाहर आने में धीमे होते हैं। इनके लिए, कीड़े के आंदोलन को हर कुछ घंटों में ट्रैक करने की आवश्यकता होती है, जिसे रात भर करना मुश्किल हो सकता है। गिनती में भी समय लगता है, जिससे प्लेटों के बीच एक अंतराल समय बनता है, और इस प्रकार प्लेटों की संख्या सीमित हो जाती है जिन्हें एक ही समय में परीक्षण किया जा सकता है। परख की पूरी अवधि के लिए एक साथ कई प्लेटों को रिकॉर्ड करने के लिए एक इमेजिंग सेटअप का उपयोग करना बहुत उपयोगी होगा, लेकिन अनुसंधान प्रयोगशाला की वित्त पोषण स्थिति के आधार पर सेटअप की लागत निषेधात्मक हो सकती है।

इसे संबोधित करने के लिए, हमने एक बहुत ही सरल विधि तैयार की जो बचाव परख को रिकॉर्ड करने के लिए स्मार्टफोन का उपयोग करती है। प्रत्येक फोन छह परख प्लेटों तक के टाइम-लैप्स वीडियो रिकॉर्ड कर सकता है। संचारित प्रकाश प्रदान करने के लिए, हम एक प्रकाश उत्सर्जक डायोड (एलईडी) प्रकाश बॉक्स का उपयोग करते हैं जिसे आसानी से ऑनलाइन खरीदा जा सकता है। परख प्लेटों को एक ऊंचे मंच पर रखा जाता है, जो खोखले आयताकार सुरंगों द्वारा समर्थित होता है, जो आने वाले प्रकाश को केंद्रित करता है, जिससे विपरीत होता है। हम एक पायथन स्क्रिप्ट भी प्रदान करते हैं जो वीडियो को ऑडियो वीडियो इंटरलीव (एवीआई) फ़ाइलों में परिवर्तित करता है जो प्रत्येक प्रति घंटा समय बिंदु के 10 एस क्लिप दिखाते हैं। वीडियो को तब अलग-अलग प्लेटों में क्रॉप किया जाता है और मैन्युअल गिनती के लिए उपयोग करने के लिए अलग-अलग फ़ाइलों में सहेजा जाता है।

विधि एक कम लागत वाली प्रक्रिया प्रदान करती है जो उपयोग करने में भी बेहद आसान है, उन वस्तुओं का उपयोग करके जो अधिकांश लोगों के लिए आसानी से उपलब्ध हैं। यहां, हम मानव रोगज़नक़ स्यूडोमोनास एरुगिनोसा (पीए 14) के खिलाफ अच्छी तरह से स्थापित लॉन परिहार परख का उपयोग करके विधि का वर्णन करते हैं, जिसका प्रोटोकॉल पहले 2,9 वर्णित किया गया है। अंत में, हम उन लोगों के लिए इमेजिंग विधि के विचारों और सीमाओं की भी समीक्षा करते हैं जो इसे अन्य सी एलिगेंस व्यवहार प्रयोगों पर लागू करना चाहते हैं।

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Protocol

1. इमेजिंग उपकरण स्थापित करना (चित्रा 1 ए-ई)

  1. सुनिश्चित करें कि निम्नलिखित न्यूनतम आवश्यकताओं के साथ एक स्मार्टफोन कैमरा उपलब्ध है:
    12 मेगापिक्सल (एमपी) कैमरा
    1080p रिज़ॉल्यूशन वीडियो
    5 जीबी स्टोरेज स्पेस (20 मिनट वीडियो 3-4 जीबी है)
    एप्लिकेशन स्टोर से टाइम-लैप्स वीडियो ऐप (मुफ्त एप्लिकेशन उपलब्ध)
  2. एलईडी लाइट बॉक्स को 25 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर के निचले रैक पर रखें जहां परख होगी।
  3. एलईडी प्रकाश की सतह पर डॉटेड पैटर्न को छिपाने के लिए, एलईडी बॉक्स की पूरी सतह को कवर करने के लिए ऊतकों की दो चादरें फैलाएं।
  4. नमूने के लिए एक ऊंचा चरण बनाएं (चित्रा 1 ए, डी)। ऊंचा चरण एक स्पष्ट प्लास्टिक शीट है जो खोखले आयताकार सुरंगों द्वारा समर्थित है। सुरंगें प्रकाश को केंद्रित करने के लिए कंडेनसर की तरह काम करती हैं, जो नमूने (चित्रा 1 सी) के लिए बेहतर विपरीत प्रदान करती हैं। सुनिश्चित करें कि प्रकाश फैलाव को कम करने के लिए सुरंग की दीवारें कुछ अंधेरी हैं। इस अध्ययन में भूरे रंग के पेपर बॉक्स का उपयोग किया गया था। सुरंग का आयाम 5.5 सेमी x 17 सेमी x 4.5 सेमी (W x L x H) है। एलईडी लाइट बॉक्स पांच सुरंगों तक फिट हो सकता है।
  5. रिकॉर्डिंग के लिए फोन रखने के लिए मंच के ऊपर एक और रैक रखें (चित्रा 1 बी, ई)। प्रत्येक फोन तीन से छह प्लेटों (तीन प्लेटों की एक से दो पंक्तियों) को रिकॉर्ड करेगा, इसलिए तदनुसार रैक ऊंचाई समायोजित करें। यह नमूने से लगभग 15 सेमी ऊपर होगा (चित्रा 1 बी)।
  6. रात भर की रिकॉर्डिंग के दौरान फोन में प्लग करने के लिए इनक्यूबेटर के अंदर एक पावर स्ट्रिप रखें।

2. बफर और मीडिया की तैयारी

  1. 3 ग्राम केएच2पीओ4, एनए2एचपीओ4 के 6 ग्राम, और एनएसीएल के 5 ग्राम को 1 एल आसुत एच2ओ में जोड़कर एम 9 बफर तैयार करें। बफर को ठंडा करें और फिर 1 एम एमजीएसओ4 का 1 एमएल जोड़ें।
  2. 108.3 ग्राम केएच 2पीओ 4 और 35.6 ग्राम के केएच2एचपीओ 4 सेएच 2ओ के 1 एल जोड़कर 1 एम केपीओ4 बफर तैयार करें। आटोक्लेविंग द्वारा निष्फल करें।
  3. 1 एमएल ब्लीच, 0.4 एमएल 1 एम एनएओएच और 2.6एमएल एच 2ओ को मिलाकर कृमि ब्लीचिंग घोल तैयार करें।
  4. निमेटोड ग्रोथ मीडिया (एनजीएम) एगर प्लेट्स तैयार करें।
    1. 3 लीटर फ्लास्क में 3 ग्राम NaCl, 2.5 ग्राम bacto पेप्टोन, और 17 ग्राम bacto agar जोड़ें। आसुत जल का 975 एमएल जोड़ें और एक हलचल पट्टी डालें।
    2. ऑटोक्लेविंग द्वारा निष्फल करें, फिर 55 डिग्री सेल्सियस तक ठंडा करें, और 1 एमएल कोलेस्ट्रॉल (इथेनॉल में 5 मिलीग्राम / एमएल), 1 एमसीएल2 का 1 एमएल, 1 एम एमजीएसओ4 का 1 एमएल, और 1 एमकेपीओ4 बफर (पीएच 6.0) का 25 एमएल जोड़ें। अच्छी तरह से मिश्रण करने के लिए हिलाएं। 6 सेमी प्लेटों में डालें। प्लेटों को कम से कम 2 दिनों तक सूखने दें।
  5. ओपी 50 ई कोलाई के साथ बीज एनजीएम एगर प्लेटों को ओपी 50 के रात भर के कल्चर के लगभग 1 एमएल पाइप करके बैक्टीरिया का लॉन बनाने के लिए। उपयोग करने के लिए तैयार होने तक कमरे के तापमान (आरटी) पर छोड़ दें।

3. उच्च-पेप्टोन एनजीएम प्लेटों की तैयारी (पीए 14 के लिए)

नोट: इन प्लेटों को परख से कम से कम 5 दिन पहले बनाया जाना चाहिए।

  1. 0.35% पेप्टोन युक्त एनजीएम बनाएं। 250 एमएल एर्लेनमेयर फ्लास्क में 0.3 ग्राम एनएसीएल, 0.35 ग्राम बैक्टो पेप्टोन और 1.7 ग्राम बैक्टो आगर मिलाएं। आसुत जल के 97.5 एमएल जोड़ें और एक हलचल पट्टी डालें।
  2. फ्लास्क के मुंह को एल्यूमीनियम पन्नी और ऑटोक्लेव के साथ 20 मिनट के लिए 121 डिग्री सेल्सियस पर कवर करें।
  3. 55 डिग्री सेल्सियस तक ठंडा करें और 0.1 एमएल कोलेस्ट्रॉल (इथेनॉल में 5 मिलीग्राम / एमएल), 1 एमसीएल2 के 0.1 एमएल, 1 एम एमजीएसओ4 के 0.1 एमएल और 1 एमकेपीओ4 बफर (पीएच 6.0) के 2.5 एमएल जोड़ें। अच्छी तरह से मिश्रण करने के लिए हिलाएं।
  4. 35 मिमी पेट्री व्यंजनों में उच्च-पेप्टोन एनजीएम डालें।
  5. प्लेटों को कम से कम 2 दिनों के लिए सुखाएं।

4. ब्लीचिंग द्वारा कीड़े को सिंक्रनाइज़ करना

नोट: परख से 3 दिन पहले इस चरण को शुरू करें।

  1. ग्रेविड वयस्क कीड़े वाली प्लेटें लें और उन्हें एम 9 बफर के साथ प्लेटों को धोकर 1.7 एमएल माइक्रोट्यूब में इकट्ठा करें।
  2. जितना संभव हो उतना तरल निकालें, फिर ब्लीचिंग समाधान के 400 μL जोड़ें। आंतरायिक भंवर के साथ लगभग 4-5 मिनट प्रतीक्षा करें, जब तक कि वयस्क कृमि शरीर टूट न जाए, अंडे जारी न करें।
  3. ब्लीचिंग समाधान को पतला करने के लिए बाकी माइक्रोट्यूब को भरने के लिए एम 9 बफर जोड़ें। 1-2 सेकंड के लिए अधिकतम गति (12,000 से 13,000 x g) पर स्पिन करें। सुपरनैटेंट को हटा दें और एम 9 बफर के साथ तीन बार धो लें।
  4. अंडे को एम 9 बफर युक्त एक खाली 35 मिमी पेट्री डिश में स्थानांतरित करें। अंडे को रात भर 20 डिग्री सेल्सियस पर निकलने दें। भोजन की अनुपस्थिति में, हैच किए गए कीड़े एल 1 लार्वा चरण में गिरफ्तार हो जाएंगे, जो सभी कीड़े के विकास चरण को सिंक्रनाइज़ करेंगे।
    नोट: जिलेटिन समाधान (आटोक्लेव पानी में 0.05% जिलेटिन) के साथ 35 मिमी पेट्री डिश को कोटिंग करने से अंडे को नीचे चिपकने से रोका जा सकता है और अंडे के नुकसान को कम किया जा सकता है।
  5. अगले दिन, एल 1 चरण के कीड़े को ओपी 50 बीज वाले एनजीएम प्लेटों में स्थानांतरित करें।
  6. कीड़े को 53-54 घंटे के लिए 20 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें जब तक कि कीड़े एल 4 लार्वा चरण तक नहीं पहुंच जाते।

5. बैक्टीरिया की तैयारी (स्यूडोमोनास एरुगिनोसा, पीए 14)

नोट: परख से 4 दिन पहले इस चरण को शुरू करें।

  1. लकीर ने बिना किसी एंटीबायोटिक के लुरिया बर्टानी (एलबी) एगर प्लेट पर -80 डिग्री सेल्सियस से बैक्टीरिया को पिघलाया और रात भर 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट किया।
    नोट: हमेशा ताजा बैक्टीरिया का उपयोग करें। स्ट्रीक प्लेटों को 1 सप्ताह से अधिक समय तक 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत नहीं किया जाना चाहिए।
  2. किंग्स शोरबा के 3 एमएल में एक एकल कॉलोनी को टीका लगाएं और रात भर 37 डिग्री सेल्सियस हिलाने वाले इनक्यूबेटर में उगाएं।
  3. अगले दिन, उच्च-पेप्टोन एनजीएम प्लेटों पर रात भर की संस्कृति का 7 μL बीज लें और 24 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
  4. बीज वाली प्लेटों को आरटी में ले जाएं और उपयोग से पहले 24 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें। एक बार तैयार होने के बाद, अगले 24 घंटे के भीतर प्लेट का उपयोग करें।

6. रिकॉर्ड करने की तैयारी

नोट: परख से ठीक पहले ऐसा करें।

  1. स्मार्टफोन को पावर आउटलेट से जुड़े पावर स्ट्रिप में प्लग करें। रिकॉर्डिंग करते समय फोन को लॉक स्क्रीन पर लौटने से रोकने के लिए ऑटो-लॉक सेटिंग को अक्षम करना सुनिश्चित करें।
  2. टाइम-लैप्स कैमरा ऐप खोलें और टाइम-लैप्स अंतराल को 2 सेकंड पर सेट करें। 30 fps पर वीडियो की गुणवत्ता 1080p पर सेट करें।
  3. स्मार्टफोन को बैक-फेसिंग कैमरे के साथ रिकॉर्ड करने के लिए स्क्रीन के साथ रखें। यह सुनिश्चित करने के लिए स्क्रीन की जाँच करें कि पेपर बॉक्स सुरंगें दृश्य के क्षेत्र के भीतर फिट होती हैं।

7. लॉन से बचाव परख

  1. प्लैटिनम तार पिक का उपयोग करके, 30 सिंक्रनाइज़ किए गए एल 4 चरण कीड़े (एल 1 से 53-54 घंटे) को पीए 14 प्लेट में स्थानांतरित करें। कीड़े को बैक्टीरिया लॉन के बीच में रखें। इस अध्ययन में प्रत्येक स्थिति के लिए, दो प्लेटों का परीक्षण किया गया था (यानी, प्रति स्थिति 60 कीड़े)।
  2. दो प्लेटों को रिकॉर्डिंग उपकरण के ऊंचे चरण पर रखें, जिसमें ढक्कन नीचे की ओर हो। आगर के साथ साइड कैमरे की ओर होगा।
  3. स्मार्टफोन स्क्रीन पर, टैप करें कि प्लेट कहां है, ताकि कैमरा परख प्लेटों पर ध्यान केंद्रित कर सके। यह प्लेट पर एक लेबल या लेखन करने में मदद करता है क्योंकि कैमरा सही ढंग से ध्यान केंद्रित करने के लिए इसका उपयोग कर सकता है।
    नोट: प्लेटों के निचले भाग पर लिखना कीड़े की इमेजिंग में हस्तक्षेप नहीं करता है जब तक कि यह किनारे की ओर है। सौभाग्य से, कीड़े जाने के बाद भी लॉन के पास रहते हैं, इसलिए लॉन के आसपास के तत्काल क्षेत्र के लिए एक अबाधित दृश्य की आवश्यकता होती है।
  4. रिकॉर्डिंग प्रारंभ करें.
  5. एक बार रिकॉर्डिंग शुरू हो जाने के बाद, मंच पर अधिक प्लेटें जोड़ें। कीड़े को चुनने में लगने वाले समय के कारण प्लेटों के बीच एक महत्वपूर्ण अंतराल समय हो सकता है। बाद में अंतराल समय पर ध्यान दें ताकि प्रत्येक स्थिति को शुरू होने के समय गिना जा सके।
  6. मंच पर रखी प्लेटों के अंतिम सेट से 20 घंटे के लिए रिकॉर्ड करें। अंतिम टाइम-लैप्स वीडियो में, 20 घंटे की रिकॉर्डिंग के परिणामस्वरूप 20 मिनट लंबा वीडियो होगा।
    नोट: परख के बाद प्लेटों से सीधे कीड़े की गिनती करना सार्थक हो सकता है, कम से कम पहले कुछ अवसरों के लिए शुरुआत में। इसकी तुलना वीडियो इमेजिंग के माध्यम से प्राप्त मूल्यों के खिलाफ की जा सकती है ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि वे समान संख्या प्राप्त करते हैं।

8. पायथन स्क्रिप्ट का उपयोग कर वीडियो का प्रसंस्करण

  1. चलचित्र फ़ाइल को संसाधित करने के लिए किसी कंप्यूटर पर स्थानांतरित करें. एक्सटेंशन एक MOV (iPhone) या MP4 फ़ाइल (Android) होगा।
  2. वीडियो को संसाधित करने के लिए पायथन कोड का उपयोग करें। कोड github.com/khyoon201/wormavoid पर पाया जा सकता है।
  3. पायथन स्क्रिप्ट को चलाने के लिए, सुनिश्चित करें कि कंप्यूटर पर निम्नलिखित पहले से इंस्टॉल हैं: ffmpeg, वीडियो फ़ाइलों को परिवर्तित करने के लिए एक उपकरण (स्थापना के लिए निर्देश इसकी वेबसाइट पर पाए जा सकते हैं, ffmpeg.org/download), और पायथन पैकेज os, पांडा, tkinter, और ffmpeg-python।
  4. extract_frame.py स्क्रिप्ट का उपयोग करके प्रत्येक प्लेट के आयाम और निर्देशांक ज्ञात करें।
    1. extract_frame.py स्क्रिप्ट चलाएँ। कंप्यूटर पर संग्रहीत वीडियो फ़ाइल का चयन करने के लिए एक विंडो दिखाई देगी। चलाने के बाद, समान नाम वाली एक jpeg फ़ाइल उसी निर्देशिका में दिखाई देगी।
    2. jpeg फ़ाइल को ImageJ (imagej.org) में खोलें।
    3. मेनू से, विश्लेषण > सेट माप चुनें। सुनिश्चित करें कि प्रदर्शन लेबल बॉक्स चेक किया गया है (चित्रा 2A)। विंडो बंद करें।
    4. सीधी रेखा उपकरण का उपयोग करके, एक प्लेट के व्यास को उसके पार एक रेखा खींचकर मापें, फिर मेनू से विश्लेषण > माप चुनें। यदि वीडियो 1080p में है, तो प्रत्येक प्लेट लगभग 480 पिक्सेल चौड़ी होगी। इस जानकारी को नीचे लिखें और परिणाम विंडो बंद करें।
    5. मल्टी-पॉइंट टूल का उपयोग करके, प्रत्येक प्लेट के ऊपरी बाईं ओर अंक चिह्नित करें। ये बिंदु क्रॉप किए गए वीडियो (चित्रा 2 बी) के ऊपरी बाएं कोने बन जाएंगे। आदेश मायने रखता है; प्लेटों को कब शुरू किया गया था, इसके क्रम में चिह्नित करें। सभी प्लेटों के लिए एक बिंदु बनाने के बाद, मेनू से विश्लेषण > माप चुनें। अंकों के एक्स और वाई निर्देशांक सहित माप, परिणाम विंडो में दिखाई देंगे।
    6. एकाधिक वीडियो संसाधित करने के लिए, अन्य jpeg फ़ाइलों के साथ ImageJ में प्रक्रिया दोहराएँ. सभी X और Y निर्देशांक एक ही परिणाम विंडो में सूचीबद्ध किए जाएंगे।
    7. परिणाम विंडो को csv फ़ाइल में सहेजें। फ़ाइल को चलचित्र फ़ाइलों के समान निर्देशिका में सहेजा जाना चाहिए.
  5. प्रत्येक प्लेट के लिए प्रारंभिक समय ज्ञात कीजिए।
    1. कंप्यूटर या फोन पर फिल्म चलाएं, और कैमरे के नीचे रखी प्लेटों के प्रत्येक सेट के शुरुआती समय पर ध्यान दें।
    2. निर्देशांक के साथ परिणाम.csv फ़ाइल खोलें और एक "प्रारंभ" स्तंभ जोड़ें। अलग-अलग प्लेटों के अनुरूप प्रत्येक पंक्ति के लिए, "प्रारंभ" कॉलम के तहत सेकंड में उपयुक्त प्रारंभ समय दर्ज करें (उदाहरण के लिए, यदि प्रारंभ समय 0:00:08 है, तो 8 दर्ज करें)। रक्षा कर।
      नोट: कॉलम नाम "स्टार्ट" होना चाहिए (निचले मामले में, उद्धरण चिह्नों के बिना) फसल और ट्रिमिंग के लिए अगली स्क्रिप्ट द्वारा पहचाना जाना चाहिए।
  6. वीडियो को क्रॉप और ट्रिम करें।
    1. crop_n_trim.py स्क्रिप्ट चलाएँ।
    2. संकेत दिए जाने पर, परिणाम.csv फ़ाइल चुनें.
      नोट: सुनिश्चित करें कि परिणाम.csv फ़ाइल और सभी चलचित्र फ़ाइलें एक ही निर्देशिका में हैं।
    3. प्लेट आयाम दर्ज करें. पहले नोट किया गया पिक्सेल मान दर्ज करें.
      नोट: स्क्रिप्ट अब "लेबल" कॉलम में फ़ाइल नाम पढ़कर सही मूवी फ़ाइल खोजने के लिए परिणाम.csv फ़ाइल की प्रत्येक पंक्ति को पढ़ेगी, और कॉलम "एक्स" और "वाई" में इंगित निर्देशांक के अनुसार क्रॉप करेगी। प्रत्येक प्लेट का प्रारंभ समय "प्रारंभ" कॉलम में इंगित समय से निर्धारित किया जाएगा। स्क्रिप्ट खत्म होने के बाद, एक फ़ोल्डर फिल्म के समान नाम के साथ दिखाई देगा, इसके बाद प्रारंभ समय (जैसे, "Movie1_8"), जिसमें परख के प्रत्येक प्रति घंटा समय बिंदु के अनुरूप 10 एस वीडियो सहेजे जाएंगे।

9. इमेजजे का उपयोग कर मैन्युअल गिनती

  1. प्रत्येक AVI फ़ाइल को ImageJ में खोलें।
  2. लॉन के बाहर दिखाई देने वाले कीड़े की गिनती करें। कीड़े जो एक फ्रेम में अतिक्रमित होते हैं, आमतौर पर दूसरे फ्रेम में अलग हो जाते हैं ताकि उन्हें सही ढंग से गिना जा सके।
  3. प्रत्येक समय बिंदु के लिए अधिभोग दर की गणना करें:
    अधिभोग दर = (कुल कृमि - लॉन के बाहर कीड़े की संख्या)/कुल कृमि
    नोट: वीडियो के दौरान कीड़े लॉन के अंदर और बाहर चले जाएंगे, लेकिन यह परिणामों को महत्वपूर्ण रूप से नहीं बदलेगा। सटीक प्रति घंटा समय बिंदु (वीडियो में 5 सेकंड) पर औसत, या कीड़े की संख्या प्रतीत होने वाली संख्या के साथ जाने का प्रयास करें।

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Representative Results

स्क्रिप्ट द्वारा निर्मित पहला वीडियो परख की शुरुआत से 1 घंटे का है। 0 घंटे के लिए वीडियो सहेजा नहीं जाता है, क्योंकि कीड़े लॉन के अंदर परख शुरू करते हैं, इसलिए अधिभोग दर हमेशा 100% होती है।

वाइल्ड-टाइप एन 2 कीड़े की तुलना एनपीआर -1 उत्परिवर्ती के साथ की जाती है, जिनके लॉन से बचाव दोष साहित्य 6,10 (चित्रा 3 ए-ई) में अच्छी तरह से स्थापित है। जैसा कि जंगली प्रकार में देखा जा सकता है, कीड़े उत्तरोत्तर जीवाणु लॉन छोड़ देते हैं और बाहर रहते हैं (चित्रा 3 ए, बी)। परिणाम समय के साथ अधिभोग दर में परिवर्तन दिखाने के लिए एक ग्राफ में प्लॉट किए जाते हैं (चित्रा 3 बी)। वीडियो में बाहर के कीड़े स्पष्ट रूप से दिखाई दे रहे हैं, लेकिन मोटे जीवाणु लॉन के अंदर कीड़े को अलग करना कठिन है (चित्रा 3 डी, ई)। हालांकि, क्योंकि प्रत्येक प्लेट में ठीक 30 कीड़े होते हैं, लॉन के अंदर अभी भी कीड़े की संख्या की गणना कुल 30 से गिने गए कीड़े को घटाकर की जा सकती है।

यद्यपि यह धारणा संभावित रूप से गणना त्रुटियों को पेश कर सकती है, खासकर अगर कुछ कीड़े प्लेट की दीवारों के पास समाप्त होते हैं जहां इसे देखना मुश्किल हो सकता है, तो यह एक महत्वपूर्ण चिंता का विषय नहीं था। जब प्लेटों से सीधे की गई गणनाओं की तुलना छवि वाले कीड़े से गणना के साथ की गई, तो छवि वाले कीड़े से गणना अत्यधिक सटीक निकली। जब प्रत्येक स्ट्रेन के लिए तीन परीक्षणों को एक साथ औसत किया गया था, तो एन 2 और एनपीआर -1 उपभेदों ने क्रमशः 99.5% और 96.2% सटीकता प्राप्त की (चित्रा 3 बी, सी)। ध्यान दें, इसकीउच्च गतिशीलता 11 के कारण कुछ एनपीआर -1 कीड़े को याद करने की थोड़ी अधिक प्रवृत्ति थी, जबकि जंगली प्रकार के कीड़े लॉन के पास रहने की प्रवृत्ति रखते थे।

Figure 1
चित्रा 1: इमेजिंग उपकरण। (ए) इमेजिंग सेटअप का एक योजनाबद्ध दृश्य। (बी) पीए 14 लॉन से बचने के लिए 25 डिग्री सेल्सियस तक सेट इनक्यूबेटर के अंदर स्थापित इमेजिंग उपकरण। (सी) सुरंग के साथ या उसके बिना चित्रित कीड़े की तुलना। (डी) सुरंगों के शीर्ष पर प्लेटों को कैसे लगाया जाता है, इसका एक करीबी दृश्य। (E) फोन की ऊंचाई को समायोजित किया जाता है ताकि छह 35 मिमी प्लेटों तक स्क्रीन में फिट हो सकें। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
(ए) विश्लेषण > सेट माप में, डिस्प्ले लेबल बॉक्स को चेक किया जाना चाहिए (लाल बिंदीदार बॉक्स)। (बी) वीडियो से निकाले गए एक एकल फ्रेम का उपयोग निर्देशांक को प्लॉट करने के लिए किया जाता है जो फसल के लिए उपयोग किए जाते हैं। मल्टी-पॉइंट टूल का उपयोग करके किए गए बिंदु पीले रंग में हैं। ये अंतिम क्रॉप किए गए वीडियो (डॉटेड व्हाइट बॉक्स के रूप में चिह्नित) के ऊपरी बाएं कोनों के रूप में काम करते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्र 3: प्रतिनिधि छवि और परख परिणाम। (A) PA14 एक्सपोजर के कई घंटों के बाद, अधिकांश कीड़े लॉन छोड़ देते हैं और बाहर रहते हैं। (बी) लॉन परिहार परख के प्रतिनिधि परिणाम। अधिभोग दर निर्धारित करने के लिए हर घंटे कीड़े की आवाजाही का पालन किया जाता है। 20 घंटे के समय बिंदु पर खुले वर्ग सी से प्लेटों से सीधे गिनती से निर्धारित औसत मूल्य को इंगित करते हैं। (सी) वीडियो के माध्यम से की गई गणनाओं की सटीकता का आकलन करने के लिए, कीड़े को सीधे परख के अंत में भी गिना गया और वीडियो इमेजिंग के माध्यम से प्राप्त मूल्यों के खिलाफ तुलना की गई। मान लॉन के अंदर / बाहर कृमि संख्याओं को इंगित करते हैं। (D, E) एल 4 कीड़े बैक्टीरिया लॉन (काले तीर) के बाहर स्पष्ट रूप से देखे जाते हैं, जबकि अंदर कीड़े देखने में कठिन होते हैं (सफेद तीर)। एक फ्रेम में अतिक्रमित कीड़े आमतौर पर उसी फिल्म (ब्लैक आउटलाइन एरोहेड) से दूसरे फ्रेम में अलग किए जा सकते हैं। नीचे दाईं ओर की संख्या 10 s वीडियो क्लिप (30 फ्रेम / s) के कुल फ्रेम में से फ्रेम संख्या को इंगित करती है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

प्रत्यक्ष अवलोकन पर भरोसा करने के बजाय इमेजिंग पशु व्यवहार, न केवल सुविधाजनक है, बल्कि दृश्य प्रलेखन छोड़ने का लाभ भी है। यह एक उद्देश्य तीसरे व्यक्ति द्वारा अंधा विश्लेषण की अनुमति देता है, या छवि पहचान तकनीकों का उपयोग करके स्वचालित विश्लेषण के लिए भी इस्तेमाल किया जा सकता है। फायदे के बावजूद, आमतौर पर पेश किए गए मानक उपकरण लागत में उच्च होते हैं, इसलिए एक बार खरीदे जाने के बाद सेटअप के लिए प्रतिबद्ध होता है।

एलिगेंस व्यवहार की वीडियो रिकॉर्डिंग एकत्र करने के लिए स्मार्टफोन का उपयोग करना कई फायदे प्रदान करता है। इसे तकनीकी ज्ञान के साथ न्यूनतम परिचितता की आवश्यकता होती है और उन वस्तुओं का उपयोग करके स्थापित करना बेहद आसान है जिन्हें आसानी से और सस्ते में खरीदा जा सकता है। एक और लाभ स्मार्टफोन की पोर्टेबिलिटी है- यह छोटे स्थानों में फिट हो सकता है, और चूंकि इसका अपना भंडारण है, इसलिए इसे कंप्यूटर से वापस कनेक्ट करने की आवश्यकता नहीं है। यह सेटअप को कहीं भी रखने की अनुमति देता है, तब भी जब स्थान बेहद सीमित हो। रिकॉर्ड की गई वीडियो फ़ाइलों को कंप्यूटर पर ले जाना सुविधाजनक है-फाइलें उतनी बड़ी नहीं हैं क्योंकि वे संपीड़ित एमपीईजी -4 प्रारूप में एन्कोड की गई हैं। फ़ाइलों को स्थानांतरित करना विशेष रूप से सुविधाजनक है जब फ़ाइल स्थानांतरण के वायरलेस विकल्प उपलब्ध होते हैं।

क्योंकि कीड़े को बिना किसी आवर्धन के चित्रित किया जाता है, वीडियो में कैप्चर किए गए कीड़े में केवल कुछ पिक्सेल होते हैं। एल 4 कीड़े आवर्धन के बिना कैप्चर किए जाने के लिए काफी बड़े हैं, लेकिन छोटे पिक्सेल आकार उच्च गुणवत्ता वाली छवि पहचान और आंदोलन ट्रैकिंग के लिए इसके उपयोग को सीमित करते हैं। हाल के मॉडलों द्वारा पेश किए गए ज़ूम लेंस का उपयोग करना या ज़ूम लेंस एडाप्टर संलग्न करना अधिक विस्तृत छवियों को प्राप्त करने में मदद कर सकता है, हालांकि हमने खुद यह कोशिश नहीं की है। हालांकि, यह दृश्य के क्षेत्र और प्लेटों की संख्या को भी कम करेगा जिन्हें एक साथ चित्रित किया जा सकता है।

गिनती को आसान बनाने के लिए, वीडियो को अलग-अलग प्लेटों को दिखाने के लिए क्रॉप किया जाता है, और परख के हर घंटे के अनुरूप 10 एस वीडियो में ट्रिम किया जाता है। यह भी महत्वपूर्ण है क्योंकि वीडियो को एवीआई प्रारूप में परिवर्तित करने से फ़ाइल का आकार काफी बढ़ जाता है, और वीडियो को क्रॉप करना और ट्रिम करना यह सुनिश्चित करता है कि फ़ाइल आकार अधिक प्रबंधनीय हैं। क्रॉप्ड एवीआई फाइलों का उपयोग संभावित रूप से छवि पहचान एल्गोरिथ्म के साथ स्वचालित रूप से कीड़े को गिनने के लिए भी किया जा सकता है। जंगली प्रकार के तनाव के लिए, हमने पाया कि सरल थ्रेशोल्डिंग का उपयोग करके इमेजजे में स्वचालित गिनती का एक कच्चा रूप संभव है। हालांकि, जब छोटे शरीर के आकार वाले उत्परिवर्ती का उपयोग किया जाता है, तो स्वचालित गणना अधिक त्रुटियां पैदा करती है।

कीड़े की छवि बनाने और विश्लेषण को स्वचालित करने के लिए कई प्रयास किए गए हैं। परंपरागत रूप से, कीड़े को एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप से जुड़े कैमरे के माध्यम से रिकॉर्ड किया जाता था, जो आमतौर पर केवल अपने सीमित क्षेत्र के कारण एक बार में कुछ कीड़े की इमेजिंग की अनुमति देता है। उच्च थ्रूपुट विश्लेषण के लिए एक साथ अधिक कीड़े की छवि बनाने की आवश्यकता ने शोधकर्ताओं को रचनात्मक इमेजिंग दृष्टिकोण विकसित करने के लिए प्रेरित किया। एक तरीका संशोधित फ्लैटबेड स्कैनर का उपयोग जीवन काल परख, जैसे कि वर्मस्कैन या जीवनकाल मशीन12,13 की छवि के लिए करना था। एक उच्च-रिज़ॉल्यूशन स्कैनर कीड़े की छवि बना सकता है ताकि जीवित कीड़े को स्थानांतरित करने वाले मृत कीड़े से अलग किया जा सके।

उच्च एफपीएस दर पर कृमि आंदोलनों को ट्रैक करने के लिए, एक कैमरा एक लेंस से जुड़ा होता है, और कीड़े को माइक्रोस्कोप14,15 के बिना चित्रित किया जाता है। चुर्गिन एट अल, जिन्होंने एक पॉलीडिमेथिलसिलोक्सेन (पीडीएमएस) मल्टी-वेल प्लेट में उगाए गए व्यक्तिगत कीड़े की दीर्घकालिक इमेजिंग के लिए एक विधि वॉरमोटेल14 विकसित की, सही कैमरा और लेंस16 चुनते समय विचार करने के लिए कारकों पर विस्तृत स्पष्टीकरण प्रदान करते हैं। इस विधि में लागत में अपेक्षाकृत मामूली होने का अतिरिक्त लाभ भी है।

माइक्रोस्कोप के बिना कीड़े को कैप्चर करने से अनिवार्य रूप से ऐसी छवियां बनती हैं जिनमें कीड़े की हरकत या चाल पर विस्तृत विश्लेषण के लिए संकल्प की कमी होती है। इसे हल करने के लिए, बार्लो एट अल ने एकल 96-वेल प्लेट17 को कैप्चर करने के लिए तीन से दो सरणी में व्यवस्थित छह कैमरों का उपयोग करने की रणनीति का उपयोग किया। प्रत्येक कैमरा 96-वेल प्लेट के केवल चार x चार कुओं की छवि बनाने के लिए सेट किया गया है, जिसके परिणामस्वरूप छवि वाले कीड़े का आकार और रिज़ॉल्यूशन बहुत अधिक है।

चूंकि सी एलिगेंस का एक स्पष्ट शरीर है, इसलिए पृष्ठभूमि से विपरीत प्रदान करने के लिए प्रकाश व्यवस्था को भी समायोजित करना पड़ता है। हमारी विधि ने एक फ्लैट एलईडी लाइट बॉक्स से रोशनी का उपयोग किया, प्रकाश को केंद्रित करने के लिए एक संकीर्ण सुरंग से गुजरा। आयामों को चित्रित प्लेट के आकार से निर्धारित किया गया था; 5.5 सेमी चौड़ाई परिहार परख के लिए उपयोग की जाने वाली 35 मिमी प्लेट को फिट करती है। एक बड़े क्षेत्र की छवि बनाने के लिए, सुरंग को व्यापक होना होगा, लेकिन हमने पाया कि समान ध्यान केंद्रित प्रभाव प्राप्त करने के लिए ऊंचाई को भी बढ़ाने की आवश्यकता है। नकारात्मक पक्ष यह है कि, उच्च सुरंगों के साथ, प्लेट के माध्यम से अधिक दीवारों को देखा जा सकता है, जो प्लेट के किनारे पर दृश्य को बाधित करता है। एक और रणनीति जिसे नियोजित किया जा सकता है वह एक परिपत्र रिंग (एलईडी रिंग) में व्यवस्थित एलईडी स्ट्रिंग लाइट का उपयोग करना है। कई दिशाओं से आने वाला प्रकाश, कीड़े के शरीर की सतह पर बिखर जाता है, जिससे अंधेरे पृष्ठभूमि14,16,18 के खिलाफ हल्के कीड़े बनते हैं। यह न केवल बड़ी प्लेटों के लिए काम कर सकता है, बल्कि छोटे स्थानों में इमेजिंग के लिए जो एलईडी लाइट बॉक्स फिट नहीं कर सकते हैं।

कृमि समुदाय द्वारा विकसित कई उपलब्ध इमेजिंग रणनीतियों के साथ, शोधकर्ता सही एक खोजने के लिए कुछ विकल्पों की कोशिश करना चाह सकते हैं जो उनकी आवश्यकता के अनुरूप है। यहां वर्णित इमेजिंग विधि सस्ती और सुलभ है कि इसका उपयोग आसानी से स्नातक कक्षाओं में किया जा सकता है, या दीर्घकालिक सेटअप में निवेश करने से पहले एक अस्थायी समाधान के रूप में किया जा सकता है।

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Disclosures

हितों के टकराव की कोई घोषणा नहीं की गई है।

Acknowledgments

हम पांडुलिपि के महत्वपूर्ण पढ़ने और पायथन कोड का परीक्षण करने के लिए देवोक जूनग ली को धन्यवाद देते हैं। यह शोध कोरिया के राष्ट्रीय अनुसंधान फाउंडेशन 2017 R1A5A2015369 (K.h.Y.) और 2019R1C1C1008708 (K.-h.Y.) द्वारा प्रायोजित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
35 mm Petri dish SPL #10035
Bacto agar BD #214010
Bacto Peptone BD #211677
CaCl2 DAEJUNG 2507-1400
Cholesterol BioBasic CD0122
Dipotassium hydrogen phosphate (K2HPO4) JUNSEI 84120-0350
Glycerol BioBasic GB0232
King B Broth MB cell MB-K0827
LED light box multi-pad Artmate N/A This is a USB powered, LED light pad for tracing and drawing purposes. Artmate is a Korean brand, but searching for "LED light box for tracing" in any search engine should yield numerous options from other brands. Overall dimension is around 9" x 12" (A4 size). For example, from amazon US: https://www.amazon.com/LITENERGY-Ultra-Thin-Adjustable-Streaming-Stenciling/dp/B07H7FLJX1/ref=sr_1_5?crid=YMYU0VYY226R&keywords=
LED%2Blight%2Bbox&qid=1674183224&sprefix
=led%2Blight%2Bbo%2Caps%2C270&sr=8-5&th=1
MgSO4 DAEJUNG 5514-4400
Plastic paper sleeve (clear) Smead #85753 Any clear plastic sheet with a bit of stiffness can be used as stage. For example, from Amazon US: https://www.amazon.com/Smead-Organized-Translucent-Project-85753/dp/B07HJTRCT7/ref=psdc_1069554_t3_B09J48GXQ
8
Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4) JUNSEI 84185-0350
Power strip  To accommodate 3 phones and one LED box, you need at least 4 outlets.
Smartphone N/A N/A Minimum requirement: 12MP wide camera, 1080p HD video recording at 30fps
Sodium chloride(NaCl) DAEJUNG #7548-4100
Sodium phosphate dibasic anhydrous (Na2HPO4) YAKURI #31727

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References

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इस महीने JoVE में अंक 192
<em>एलिगेंस</em> लॉन अवॉइडेंस परख के लिए एक स्मार्टफोन-आधारित इमेजिंग विधि
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Kwon, S., Lee, J. I., Yoon, K. h. A… More

Kwon, S., Lee, J. I., Yoon, K. h. A Smartphone-Based Imaging Method for C. elegans Lawn Avoidance Assay. J. Vis. Exp. (192), e65197, doi:10.3791/65197 (2023).

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