Summary

Quantification à haut débit basée sur l’image de la synthèse et de la distribution de l’ADN mitochondrial

Published: May 05, 2023
doi:

Summary

Une procédure d’étude de la dynamique du métabolisme de l’ADN mitochondrial (ADNmt) dans les cellules à l’aide d’un format de plaque multipuits et d’une imagerie automatisée par immunofluorescence pour détecter et quantifier la synthèse et la distribution de l’ADNmt est décrite. Cela peut être utilisé pour étudier les effets de divers inhibiteurs, stress cellulaires et silençage génique sur le métabolisme de l’ADNmt.

Abstract

La grande majorité des processus cellulaires nécessitent un apport continu d’énergie, dont le porteur le plus courant est la molécule d’ATP. Les cellules eucaryotes produisent la majeure partie de leur ATP dans les mitochondries par phosphorylation oxydative. Les mitochondries sont des organites uniques parce qu’elles ont leur propre génome qui est répliqué et transmis à la génération suivante de cellules. Contrairement au génome nucléaire, il existe plusieurs copies du génome mitochondrial dans la cellule. L’étude détaillée des mécanismes responsables de la réplication, de la réparation et du maintien du génome mitochondrial est essentielle pour comprendre le bon fonctionnement des mitochondries et des cellules entières dans des conditions normales et pathologiques. Ici, une méthode qui permet la quantification à haut débit de la synthèse et de la distribution de l’ADN mitochondrial (ADNmt) dans les cellules humaines cultivées in vitro est présentée. Cette approche est basée sur la détection par immunofluorescence de molécules d’ADN synthétisées activement marquées par incorporation de 5-bromo-2′-désoxyuridine (BrdU) et la détection simultanée de toutes les molécules d’ADNmt avec des anticorps anti-ADN. De plus, les mitochondries sont visualisées avec des colorants ou des anticorps spécifiques. La culture de cellules dans un format multipuits et l’utilisation d’un microscope à fluorescence automatisé facilitent l’étude de la dynamique de l’ADNmt et de la morphologie des mitochondries dans diverses conditions expérimentales dans un temps relativement court.

Introduction

Pour la plupart des cellules eucaryotes, les mitochondries sont des organites essentiels, car elles jouent un rôle crucial dans de nombreux processus cellulaires. Tout d’abord, les mitochondries sont les principaux fournisseurs d’énergie des cellules1. Les mitochondries sont également impliquées dans la régulation de l’homéostasie cellulaire (par exemple, l’oxydoxintracellulaire 2 et l’équilibre calcique3), la signalisation cellulaire4,5, l’apoptose 6, la synthèse de différents composés biochimiques 7,8 et la réponse immunitaire innée9. Le dysfonctionnement mitochondrial est associé à divers états pathologiques et maladies humaines10.

Le fonctionnement des mitochondries dépend de l’information génétique située dans deux génomes distincts : le génome nucléaire et le génome mitochondrial. Le génome mitochondrial code un petit nombre de gènes par rapport au génome nucléaire, mais tous les gènes codés par l’ADNmt sont essentiels à la vie humaine. La machinerie protéique mitochondriale nécessaire au maintien de l’ADNmt est codée par l’ADNn. Les composants de base du réplisome mitochondrial, ainsi que certains facteurs de biogenèse mitochondriale, ont déjà été identifiés (examinés dans des recherches antérieures11,12). Cependant, les mécanismes de réplication et de maintien de l’ADN mitochondrial sont encore loin d’être compris. Contrairement à l’ADNn, le génome mitochondrial existe en plusieurs copies, ce qui fournit une couche supplémentaire pour réguler l’expression des gènes mitochondriaux. On en sait beaucoup moins actuellement sur la distribution et la ségrégation de l’ADNmt au sein des organites, dans quelle mesure ces processus sont régulés et, le cas échéant, quelles protéines sont impliquées13. Le schéma de ségrégation est crucial lorsque les cellules contiennent une population mixte d’ADNmt de type sauvage et muté. Leur distribution inégale peut conduire à la génération de cellules avec une quantité néfaste d’ADNmt muté.

Jusqu’à présent, les facteurs protéiques nécessaires au maintien de l’ADNmt ont été identifiés principalement par des méthodes biochimiques, des analyses bioinformatiques ou par des études associées à la maladie. Dans ce travail, afin d’assurer une forte chance d’identifier les facteurs qui ont précédemment échappé à l’identification, une stratégie différente est décrite. La méthode est basée sur le marquage de l’ADNmt pendant la réplication ou la réparation avec la 5-bromo-2′-désoxyuridine (BrdU), un analogue nucléosidique de la thymidine. BrdU est facilement incorporé dans les brins d’ADN naissants lors de la synthèse de l’ADN et, en général, est utilisé pour surveiller la réplication de l’ADN nucléaire14. Cependant, la procédure développée ici a été optimisée pour détecter BrdU incorporé dans l’ADNmt en utilisant l’immunofluorescence des anticorps anti-BrdU.

L’approche permet la quantification à haut débit de la synthèse et de la distribution de l’ADNmt dans des cellules humaines cultivées in vitro. Une stratégie à haut débit est nécessaire pour effectuer des essais dans différentes conditions expérimentales dans un temps relativement court; Par conséquent, il est proposé dans le protocole d’utiliser un format multipuits pour la culture cellulaire et la microscopie à fluorescence automatisée pour l’imagerie. Le protocole comprend la transfection de cellules HeLa humaines avec une bibliothèque de siRNA et la surveillance ultérieure de la réplication ou de la réparation de l’ADNmt à l’aide du marquage métabolique de l’ADN nouvellement synthétisé avec BrdU. Cette approche est combinée avec l’immunomarquage de l’ADN à l’aide d’anticorps anti-ADN. Les deux paramètres sont analysés à l’aide de la microscopie quantitative à fluorescence. De plus, les mitochondries sont visualisées avec un colorant spécifique. Pour démontrer la spécificité du protocole, la coloration BrdU a été testée sur des cellules dépourvues d’ADNmt (cellules rho0), sur des cellules HeLa lors du silençage de facteurs de maintenance de l’ADNmt bien connus et sur des cellules HeLa après traitement avec un inhibiteur de la réplication de l’ADNmt. Les niveaux d’ADNmt ont également été mesurés par une méthode indépendante, à savoir la qPCR.

Protocol

1. Préparation du mélange siRNA Un jour avant le début de l’expérience, les cellules de graines (par exemple, HeLa) sur une boîte de 100 mm afin qu’elles atteignent 70% à 90% de confluence le lendemain.NOTE: Toutes les opérations doivent être effectuées dans des conditions stériles dans une chambre à flux laminaire. Préparer la quantité appropriée de siRNA diluée à une concentration de 140 nM dans un milieu Opti-MEM (voir tableau des matériaux…

Representative Results

Un schéma de la procédure pour l’étude à haut débit de la dynamique de la synthèse et de la distribution de l’ADNmt est présenté à la figure 1. L’utilisation d’un format de plaque multipuits permet l’analyse simultanée de nombreuses conditions expérimentales différentes, telles que le silençage de différents gènes à l’aide d’une bibliothèque de siRNA. Les conditions utilisées pour le marquage des molécules d’ADN nouvellement synthétisées avec BrdU permett…

Discussion

Historiquement, le marquage de l’ADN par incorporation BrdU et la détection d’anticorps a été utilisé dans la réplication de l’ADN nucléaire et la recherche sur le cycle cellulaire 14,27,28. Jusqu’à présent, tous les protocoles de détection de l’ADN marqué BrdU ont inclus une étape de dénaturation de l’ADN (acide ou thermique) ou de digestion enzymatique (DNase ou protéinase) pour permettre l’expositio…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ce travail a été soutenu par le Centre national des sciences, Pologne (numéro de subvention/bourse: 2018/31/D/NZ2/03901).

Materials

2′,3′-Dideoxycytidine (ddC) Sigma-Aldrich D5782
384  Well Cell Culture Microplates, black Greiner Bio-One #781946
5-Bromo-2′-deoxyuridine (BrdU) Sigma-Aldrich B5002-1G Dissolve BrdU powder in water to 20 mM stock solution and aliquot. Use 20 µM BrdU solution for labeling.
Adhesive sealing film Nerbe Plus 04-095-0060
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG1 secondary antibody Thermo Fisher Scientific A-21121
Alexa Fluor 555 goat anti-mouse IgM secondary antibody Thermo Fisher Scientific A-21426
BioTek 405 LS microplate washer Agilent
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma-Aldrich A4503
Cell counting chamber Thoma Heinz Herenz REF:1080339
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Cytiva SH30243.01
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Thermo Fisher Scientific 41965-062
Fetal Bovine Serum (FBS) Thermo Fisher Scientific 10270-106
Formaldehyde solution Sigma-Aldrich F1635 Formaldehyde is toxic; please read the safety data sheet carefully.
Hoechst 33342 Thermo Fisher Scientific H3570
IgG1 mouse monoclonal anti-BrdU (IIB5) primary antibody Santa Cruz Biotechnology sc-32323
IgM mouse monoclonal anti-DNA (AC-30-10) primary antibody Progen #61014
LightCycler 480 System Roche
Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent Thermo Fisher Scientific #13778150
MitoTracker Deep Red FM Thermo Fisher Scientific M22426 Mitochondria tracking dye 
Multidrop Combi Reagent Dispenser Thermo Fisher Scientific
Opti-MEM Thermo Fisher Scientific 51985-042
Orca-R2 (C10600) CCD Camera Hamamatsu
Penicillin-Streptomycin  Sigma-Aldrich P0781-100ML
Phosphate buffered saline (PBS) Sigma-Aldrich P4417-100TAB
PowerUp SYBR Green Master Mix Thermo Fisher Scientific A25742
qPCR primer Fw B2M (reference) CAGGTACTCCAAAGATTCAGG 
qPCR primer Fw GPI (reference gene) GACCTTTACTACCCAGGAGA
qPCR primer Fw MT-ND1  TAGCAGAGACCAACCGAACC 
qPCR primer Fw POLG TGGAAGGCAGGCATGGTCAAACC
qPCR primer Fw TFAM GATGAGTTCTGCCTGCTTTAT
qPCR primer Fw TWNK GCCATGTGACACTGGTCATT
qPCR primer Rev B2M (reference) GTCAACTTCAATGTCGGATGG 
qPCR primer Rev GPI (reference gene) AGTAGACAGGGCAACAAAGT
qPCR primer Rev MT-ND1  ATGAAGAATAGGGCGAAGGG 
qPCR primer Rev POLG GGAGTCAGAACACCTGGCTTTGG
qPCR primer Rev TFAM GGACTTCTGCCAGCATAATA
qPCR primer Rev TWNK AACATTGTCTGCTTCCTGGC
ScanR microscope Olympus
siRNA Ctrl Dharmacon D-001810-10-5
siRNA POLG Invitrogen POLGHSS108223
siRNA TFAM Invitrogen TFAMHSS144252
siRNA TWNK Invitrogen C10orf2HSS125597
Suction device NeoLab 2-9335 Suction device for cell culture
Triton X-100 Sigma-Aldrich T9284-500ML
Trypsin Biowest L0931-500
UPlanSApo 20x 0.75 NA objective Olympus

References

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Borowski, L. S., Kasztelan, K., Czerwinska-Kostrzewska, J., Szczesny, R. J. High-Throughput Image-Based Quantification of Mitochondrial DNA Synthesis and Distribution. J. Vis. Exp. (195), e65236, doi:10.3791/65236 (2023).

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