Quantificação baseada em imagens de alto rendimento da síntese e distribuição do DNA mitocondrial
Summary
Um procedimento para estudar a dinâmica do metabolismo do DNA mitocondrial (mtDNA) em células usando um formato de placa multi-poço e imagens automatizadas de imunofluorescência para detectar e quantificar a síntese e distribuição do mtDNA é descrito. Isso pode ser usado para investigar os efeitos de vários inibidores, estresses celulares e silenciamento gênico no metabolismo do mtDNA.
Abstract
A grande maioria dos processos celulares requer um fornecimento contínuo de energia, cujo portador mais comum é a molécula de ATP. As células eucarióticas produzem a maior parte de seu ATP nas mitocôndrias por fosforilação oxidativa. As mitocôndrias são organelas únicas porque têm seu próprio genoma que é replicado e transmitido para a próxima geração de células. Em contraste com o genoma nuclear, existem múltiplas cópias do genoma mitocondrial na célula. O estudo detalhado dos mecanismos responsáveis pela replicação, reparo e manutenção do genoma mitocondrial é essencial para a compreensão do bom funcionamento das mitocôndrias e das células inteiras em condições normais e de doença. Aqui, um método que permite a quantificação em alto rendimento da síntese e distribuição de DNA mitocondrial (mtDNA) em células humanas cultivadas in vitro é apresentado. Esta abordagem é baseada na detecção por imunofluorescência de moléculas de DNA ativamente sintetizadas marcadas pela incorporação de 5-bromo-2′-desoxiuridina (BrdU) e na detecção concomitante de todas as moléculas de mtDNA com anticorpos anti-DNA. Além disso, as mitocôndrias são visualizadas com corantes ou anticorpos específicos. O cultivo de células em formato multipoço e o uso de um microscópio automatizado de fluorescência facilitam o estudo da dinâmica do mtDNA e da morfologia das mitocôndrias sob uma variedade de condições experimentais em um tempo relativamente curto.
Introduction
Para a maioria das células eucarióticas, as mitocôndrias são organelas essenciais, pois desempenham um papel crucial em inúmeros processos celulares. Em primeiro lugar, as mitocôndrias são os principais fornecedores de energia das células1. As mitocôndrias também estão envolvidas na regulação da homeostase celular (por exemplo, redoxintracelular 2 e balanço de cálcio3), sinalização celular4,5, apoptose6, síntese de diferentes compostos bioquímicos 7,8 e resposta imune inata9. A disfunção mitocondrial está associada a vários estados patológicos e doenças humanas10.
O funcionamento das mitocôndrias depende da informação genética localizada em dois genomas separados: o genoma nuclear e o genoma mitocondrial. O genoma mitocondrial codifica um pequeno número de genes em comparação com o genoma nuclear, mas todos os genes codificados pelo mtDNA são essenciais para a vida humana. A maquinaria de proteínas mitocondriais necessária para manter o mtDNA é codificada por nDNA. Os componentes básicos do replissoma mitocondrial, bem como alguns fatores da biogênese mitocondrial, já foram identificados (revisado em pesquisaanterior11,12). No entanto, os mecanismos de replicação e manutenção do DNA mitocondrial ainda estão longe de serem compreendidos. Em contraste com o nDNA, o genoma mitocondrial existe em múltiplas cópias, o que fornece uma camada adicional para regular a expressão gênica mitocondrial. Muito menos se sabe atualmente sobre a distribuição e segregação do mtDNA dentro de organelas, em que medida esses processos são regulados e, se são, quais proteínas estão envolvidas13. O padrão de segregação é crucial quando as células contêm uma população mista de mtDNA selvagem e mutado. Sua distribuição desigual pode levar à geração de células com uma quantidade prejudicial de mtDNA mutado.
Até o momento, os fatores proteicos necessários para a manutenção do mtDNA têm sido identificados principalmente por métodos bioquímicos, análises bioinformáticas ou estudos associados a doenças. Neste trabalho, a fim de garantir uma alta chance de identificar fatores que escaparam previamente à identificação, uma estratégia diferente é descrita. O método é baseado na marcação do mtDNA durante replicação ou reparo com 5-bromo-2′-desoxiuridina (BrdU), um análogo nucleosídeo da timidina. O BrdU é prontamente incorporado em fitas de DNA nascentes durante a síntese de DNA e, em geral, é usado para monitorar a replicação do DNA nuclear14. No entanto, o procedimento aqui desenvolvido foi otimizado para detectar BrdU incorporado ao mtDNA usando a imunofluorescência de anticorpos anti-BrdU.
A abordagem permite a quantificação em alto rendimento da síntese e distribuição do mtDNA em células humanas cultivadas in vitro. Uma estratégia de alto rendimento é necessária para conduzir testes sob diferentes condições experimentais em um tempo relativamente curto; Portanto, propõe-se no protocolo a utilização de um formato multipoço para cultura celular e microscopia de fluorescência automatizada para obtenção de imagens. O protocolo inclui a transfecção de células HeLa humanas com uma biblioteca de siRNA e o monitoramento subsequente da replicação ou reparo do mtDNA usando a marcação metabólica do DNA recém-sintetizado com BrdU. Essa abordagem é combinada com a imunomarcação do DNA com a ajuda de anticorpos anti-DNA. Ambos os parâmetros são analisados por microscopia quantitativa de fluorescência. Além disso, as mitocôndrias são visualizadas com um corante específico. Para demonstrar a especificidade do protocolo, a coloração BrdU foi testada em células desprovidas de mtDNA (células rho0), em células HeLa após o silenciamento de fatores de manutenção bem conhecidos do mtDNA e em células HeLa após tratamento com um inibidor de replicação do mtDNA. Os níveis de mtDNA também foram medidos por um método independente, a qPCR.
Protocol
Representative Results
Discussion
Historicamente, a marcação de DNA por incorporação de BrdU e detecção de anticorpos tem sido utilizada na replicação de DNA nuclear e na pesquisa do ciclo celular 14,27,28. Até agora, todos os protocolos para detecção de DNA marcado com BrdU incluíram uma etapa de desnaturação do DNA (ácida ou térmica) ou digestão enzimática (DNase ou proteinase) para permitir a exposição de epítopos e facilitar a penetraç?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado pelo Centro Nacional de Ciência, Polônia (Grant/Award Number: 2018/31/D/NZ2/03901).
Materials
| 2′,3′-Dideoxycytidine (ddC) | Sigma-Aldrich | D5782 | |
| 384 Well Cell Culture Microplates, black | Greiner Bio-One | #781946 | |
| 5-Bromo-2′-deoxyuridine (BrdU) | Sigma-Aldrich | B5002-1G | Dissolve BrdU powder in water to 20 mM stock solution and aliquot. Use 20 µM BrdU solution for labeling. |
| Adhesive sealing film | Nerbe Plus | 04-095-0060 | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG1 secondary antibody | Thermo Fisher Scientific | A-21121 | |
| Alexa Fluor 555 goat anti-mouse IgM secondary antibody | Thermo Fisher Scientific | A-21426 | |
| BioTek 405 LS microplate washer | Agilent | ||
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A4503 | |
| Cell counting chamber Thoma | Heinz Herenz | REF:1080339 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Cytiva | SH30243.01 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Thermo Fisher Scientific | 41965-062 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific | 10270-106 | |
| Formaldehyde solution | Sigma-Aldrich | F1635 | Formaldehyde is toxic; please read the safety data sheet carefully. |
| Hoechst 33342 | Thermo Fisher Scientific | H3570 | |
| IgG1 mouse monoclonal anti-BrdU (IIB5) primary antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-32323 | |
| IgM mouse monoclonal anti-DNA (AC-30-10) primary antibody | Progen | #61014 | |
| LightCycler 480 System | Roche | ||
| Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent | Thermo Fisher Scientific | #13778150 | |
| MitoTracker Deep Red FM | Thermo Fisher Scientific | M22426 | Mitochondria tracking dye |
| Multidrop Combi Reagent Dispenser | Thermo Fisher Scientific | ||
| Opti-MEM | Thermo Fisher Scientific | 51985-042 | |
| Orca-R2 (C10600) CCD Camera | Hamamatsu | ||
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P0781-100ML | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | P4417-100TAB | |
| PowerUp SYBR Green Master Mix | Thermo Fisher Scientific | A25742 | |
| qPCR primer Fw B2M (reference) | CAGGTACTCCAAAGATTCAGG | ||
| qPCR primer Fw GPI (reference gene) | GACCTTTACTACCCAGGAGA | ||
| qPCR primer Fw MT-ND1 | TAGCAGAGACCAACCGAACC | ||
| qPCR primer Fw POLG | TGGAAGGCAGGCATGGTCAAACC | ||
| qPCR primer Fw TFAM | GATGAGTTCTGCCTGCTTTAT | ||
| qPCR primer Fw TWNK | GCCATGTGACACTGGTCATT | ||
| qPCR primer Rev B2M (reference) | GTCAACTTCAATGTCGGATGG | ||
| qPCR primer Rev GPI (reference gene) | AGTAGACAGGGCAACAAAGT | ||
| qPCR primer Rev MT-ND1 | ATGAAGAATAGGGCGAAGGG | ||
| qPCR primer Rev POLG | GGAGTCAGAACACCTGGCTTTGG | ||
| qPCR primer Rev TFAM | GGACTTCTGCCAGCATAATA | ||
| qPCR primer Rev TWNK | AACATTGTCTGCTTCCTGGC | ||
| ScanR microscope | Olympus | ||
| siRNA Ctrl | Dharmacon | D-001810-10-5 | |
| siRNA POLG | Invitrogen | POLGHSS108223 | |
| siRNA TFAM | Invitrogen | TFAMHSS144252 | |
| siRNA TWNK | Invitrogen | C10orf2HSS125597 | |
| Suction device | NeoLab | 2-9335 | Suction device for cell culture |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284-500ML | |
| Trypsin | Biowest | L0931-500 | |
| UPlanSApo 20x 0.75 NA objective | Olympus |
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