ミトコンドリアDNA合成と分布のハイスループット画像ベースの定量
Summary
mtDNAの合成と分布を検出および定量するためのマルチウェルプレートフォーマットおよび自動免疫蛍光イメージングを使用して、細胞内のミトコンドリアDNA(mtDNA)代謝のダイナミクスを研究する手順について説明します。これはさらに、mtDNA代謝に対するさまざまな阻害剤、細胞ストレス、および遺伝子サイレンシングの影響を調べるために使用できます。
Abstract
細胞プロセスの大部分はエネルギーの継続的な供給を必要とし、その最も一般的なキャリアはATP分子です。真核細胞は、酸化的リン酸化によってミトコンドリアでATPの大部分を産生します。ミトコンドリアは、複製されて次世代の細胞に受け継がれる独自のゲノムを持っているため、ユニークな細胞小器官です。核ゲノムとは対照的に、細胞内にはミトコンドリアゲノムの複数のコピーがあります。ミトコンドリアゲノムの複製、修復、および維持に関与するメカニズムの詳細な研究は、正常状態と疾患状態の両方でミトコンドリアおよび細胞全体の適切な機能を理解するために不可欠です。ここでは、 インビトロで 培養したヒト細胞におけるミトコンドリアDNA(mtDNA)の合成および分布のハイスループット定量を可能にする方法が提示される。このアプローチは、5-ブロモ-2′-デオキシウリジン(BrdU)取り込みによって標識された活発に合成されたDNA分子の免疫蛍光検出と、抗DNA抗体によるすべてのmtDNA分子の同時検出に基づいています。さらに、ミトコンドリアは特定の色素または抗体で可視化されます。マルチウェル形式で細胞を培養し、自動蛍光顕微鏡を利用することで、mtDNAの動態やミトコンドリアの形態を様々な実験条件下で比較的短時間で研究することが容易になります。
Introduction
ほとんどの真核細胞にとって、ミトコンドリアは多くの細胞プロセスにおいて重要な役割を果たすため、不可欠な細胞小器官です。何よりもまず、ミトコンドリアは細胞の主要なエネルギー供給者です1。ミトコンドリアは、細胞の恒常性(例えば、細胞内酸化還元2およびカルシウムバランス3)、細胞シグナル伝達4,5、アポトーシス6、異なる生化学的化合物の合成7,8、および自然免疫応答9の調節にも関与しています。ミトコンドリア機能障害は、様々な病的状態およびヒト疾患に関連している10。
ミトコンドリアの機能は、核ゲノムとミトコンドリアゲノムの2つの別々のゲノムにある遺伝情報に依存します。ミトコンドリアゲノムは核ゲノムに比べて少数の遺伝子をコードしていますが、mtDNAにコードされた遺伝子はすべて人間の生活に不可欠です。mtDNAを維持するために必要なミトコンドリアタンパク質機構は、nDNAによってコードされています。ミトコンドリアレプリソームの基本成分、およびいくつかのミトコンドリア生合成因子はすでに同定されています(以前の研究でレビュー11,12)。しかし、ミトコンドリアDNAの複製と維持のメカニズムはまだ理解されていません。nDNAとは対照的に、ミトコンドリアゲノムは複数のコピーで存在し、ミトコンドリア遺伝子発現を調節するための追加の層を提供します。オルガネラ内のmtDNAの分布と分離、これらのプロセスがどの程度調節されているか、もしそうなら、どのタンパク質が関与しているかについては、現在ほとんど知られていません13。分離パターンは、細胞に野生型と変異したmtDNAの混合集団が含まれている場合に重要です。それらの不均等な分布は、有害な量の変異mtDNAを有する細胞の生成をもたらし得る。
これまでのところ、mtDNAの維持に必要なタンパク質因子は、主に生化学的方法、バイオインフォマティクス分析、または疾患関連研究によって特定されてきました。この作業では、以前に識別を逃れた要因を特定する可能性が高いことを保証するために、別の戦略について説明します。この方法は、チミジンのヌクレオシド類似体である5-ブロモ-2′-デオキシウリジン(BrdU)による複製または修復中のmtDNAの標識に基づいています。BrdUは、DNA合成中に新生DNA鎖に容易に組み込まれ、一般に、核DNAの複製をモニタリングするために使用されます14。しかし、ここで開発された手順は、抗BrdU抗体の免疫蛍光を用いてmtDNAに取り込まれたBrdUを検出するために最適化されています。
このアプローチにより、 in vitroで培養したヒト細胞におけるmtDNA合成と分布のハイスループット定量が可能になります。比較的短時間でさまざまな実験条件下でテストを実施するには、ハイスループット戦略が必要です。したがって、プロトコールでは、細胞培養のためのマルチウェルフォーマットおよびイメージングのための自動蛍光顕微鏡法を利用することが提案されている。このプロトコルには、siRNAライブラリによるヒトHeLa細胞のトランスフェクションと、その後のBrdUによる新しく合成されたDNAの代謝標識を使用したmtDNA複製または修復のモニタリングが含まれます。このアプローチは、抗DNA抗体の助けを借りてDNAの免疫染色と組み合わされます。両方のパラメータは、定量的蛍光顕微鏡を用いて分析される。さらに、ミトコンドリアは特定の色素で視覚化されます。プロトコルの特異性を実証するために、mtDNAを含まない細胞(rho0細胞)、よく知られているmtDNA維持因子のサイレンシング時のHeLa細胞、およびmtDNA複製阻害剤で処理した後のHeLa細胞でBrdU染色をテストしました。mtDNAレベルも独立した方法、すなわちqPCRによって測定された。
Protocol
Representative Results
Discussion
歴史的に、BrdUの取り込みおよび抗体検出によるDNA標識は、核DNA複製および細胞周期研究において使用されてきた14,27,28。これまでのところ、BrdU標識DNAを検出するためのすべてのプロトコルには、エピトープの露出を可能にし、抗体の浸透を促進するためのDNA変性ステップ(酸性または熱)または酵素消化(DNaseまたはプロテイ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、ポーランド国立科学センターの支援を受けました(助成金/受賞番号:2018/31/D/NZ2/03901)。
Materials
| 2′,3′-Dideoxycytidine (ddC) | Sigma-Aldrich | D5782 | |
| 384 Well Cell Culture Microplates, black | Greiner Bio-One | #781946 | |
| 5-Bromo-2′-deoxyuridine (BrdU) | Sigma-Aldrich | B5002-1G | Dissolve BrdU powder in water to 20 mM stock solution and aliquot. Use 20 µM BrdU solution for labeling. |
| Adhesive sealing film | Nerbe Plus | 04-095-0060 | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG1 secondary antibody | Thermo Fisher Scientific | A-21121 | |
| Alexa Fluor 555 goat anti-mouse IgM secondary antibody | Thermo Fisher Scientific | A-21426 | |
| BioTek 405 LS microplate washer | Agilent | ||
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A4503 | |
| Cell counting chamber Thoma | Heinz Herenz | REF:1080339 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Cytiva | SH30243.01 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Thermo Fisher Scientific | 41965-062 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific | 10270-106 | |
| Formaldehyde solution | Sigma-Aldrich | F1635 | Formaldehyde is toxic; please read the safety data sheet carefully. |
| Hoechst 33342 | Thermo Fisher Scientific | H3570 | |
| IgG1 mouse monoclonal anti-BrdU (IIB5) primary antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-32323 | |
| IgM mouse monoclonal anti-DNA (AC-30-10) primary antibody | Progen | #61014 | |
| LightCycler 480 System | Roche | ||
| Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent | Thermo Fisher Scientific | #13778150 | |
| MitoTracker Deep Red FM | Thermo Fisher Scientific | M22426 | Mitochondria tracking dye |
| Multidrop Combi Reagent Dispenser | Thermo Fisher Scientific | ||
| Opti-MEM | Thermo Fisher Scientific | 51985-042 | |
| Orca-R2 (C10600) CCD Camera | Hamamatsu | ||
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P0781-100ML | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | P4417-100TAB | |
| PowerUp SYBR Green Master Mix | Thermo Fisher Scientific | A25742 | |
| qPCR primer Fw B2M (reference) | CAGGTACTCCAAAGATTCAGG | ||
| qPCR primer Fw GPI (reference gene) | GACCTTTACTACCCAGGAGA | ||
| qPCR primer Fw MT-ND1 | TAGCAGAGACCAACCGAACC | ||
| qPCR primer Fw POLG | TGGAAGGCAGGCATGGTCAAACC | ||
| qPCR primer Fw TFAM | GATGAGTTCTGCCTGCTTTAT | ||
| qPCR primer Fw TWNK | GCCATGTGACACTGGTCATT | ||
| qPCR primer Rev B2M (reference) | GTCAACTTCAATGTCGGATGG | ||
| qPCR primer Rev GPI (reference gene) | AGTAGACAGGGCAACAAAGT | ||
| qPCR primer Rev MT-ND1 | ATGAAGAATAGGGCGAAGGG | ||
| qPCR primer Rev POLG | GGAGTCAGAACACCTGGCTTTGG | ||
| qPCR primer Rev TFAM | GGACTTCTGCCAGCATAATA | ||
| qPCR primer Rev TWNK | AACATTGTCTGCTTCCTGGC | ||
| ScanR microscope | Olympus | ||
| siRNA Ctrl | Dharmacon | D-001810-10-5 | |
| siRNA POLG | Invitrogen | POLGHSS108223 | |
| siRNA TFAM | Invitrogen | TFAMHSS144252 | |
| siRNA TWNK | Invitrogen | C10orf2HSS125597 | |
| Suction device | NeoLab | 2-9335 | Suction device for cell culture |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284-500ML | |
| Trypsin | Biowest | L0931-500 | |
| UPlanSApo 20x 0.75 NA objective | Olympus |
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