Summary

Bildbasierte Hochdurchsatz-Quantifizierung der mitochondrialen DNA-Synthese und -Verteilung

Published: May 05, 2023
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Summary

Es wird ein Verfahren zur Untersuchung der Dynamik des mitochondrialen DNA-Stoffwechsels (mtDNA) in Zellen unter Verwendung eines Multi-Well-Plattenformats und automatisierter Immunfluoreszenzbildgebung zum Nachweis und zur Quantifizierung der mtDNA-Synthese und -Verteilung beschrieben. Dies kann weiter genutzt werden, um die Auswirkungen verschiedener Inhibitoren, zellulärer Belastungen und Genstilllegung auf den mtDNA-Stoffwechsel zu untersuchen.

Abstract

Die überwiegende Mehrheit der zellulären Prozesse erfordert eine kontinuierliche Energiezufuhr, deren häufigster Träger das ATP-Molekül ist. Eukaryotische Zellen produzieren den größten Teil ihres ATP in den Mitochondrien durch oxidative Phosphorylierung. Mitochondrien sind einzigartige Organellen, weil sie ein eigenes Genom haben, das repliziert und an die nächste Generation von Zellen weitergegeben wird. Im Gegensatz zum Kerngenom gibt es in der Zelle mehrere Kopien des mitochondrialen Genoms. Die detaillierte Untersuchung der Mechanismen, die für die Replikation, Reparatur und Aufrechterhaltung des mitochondrialen Genoms verantwortlich sind, ist unerlässlich, um das ordnungsgemäße Funktionieren von Mitochondrien und ganzen Zellen sowohl unter normalen als auch unter Krankheitsbedingungen zu verstehen. Hier wird eine Methode vorgestellt, die die Hochdurchsatzquantifizierung der Synthese und Verteilung von mitochondrialer DNA (mtDNA) in in vitro kultivierten humanen Zellen ermöglicht. Dieser Ansatz basiert auf der Immunfluoreszenzdetektion von aktiv synthetisierten DNA-Molekülen, die durch den Einbau von 5-Brom-2′-Desoxyuridin (BrdU) markiert sind, und der gleichzeitigen Detektion aller mtDNA-Moleküle mit Anti-DNA-Antikörpern. Zusätzlich werden die Mitochondrien mit spezifischen Farbstoffen oder Antikörpern sichtbar gemacht. Die Kultivierung von Zellen im Multi-Well-Format und der Einsatz eines automatisierten Fluoreszenzmikroskops erleichtern es, die Dynamik der mtDNA und die Morphologie der Mitochondrien unter verschiedenen experimentellen Bedingungen in relativ kurzer Zeit zu untersuchen.

Introduction

Für die meisten eukaryotischen Zellen sind Mitochondrien essentielle Organellen, da sie eine entscheidende Rolle in zahlreichen zellulären Prozessen spielen. Mitochondrien sind in erster Linie die wichtigsten Energielieferanten der Zellen1. Mitochondrien sind auch an der Regulierung der zellulären Homöostase (z. B. intrazelluläres Redox2 und des Kalziumhaushalts3), der Zellsignalübertragung 4,5, der Apoptose6, der Synthese verschiedener biochemischer Verbindungen 7,8 und der angeborenen Immunantwortbeteiligt 9. Mitochondriale Dysfunktion wird mit verschiedenen pathologischen Zuständen und menschlichen Krankheiten in Verbindung gebracht10.

Die Funktion der Mitochondrien hängt von der genetischen Information ab, die sich in zwei getrennten Genomen befindet: dem Kern- und dem mitochondrialen Genom. Das mitochondriale Genom kodiert im Vergleich zum Kerngenom nur eine kleine Anzahl von Genen, aber alle mtDNA-kodierten Gene sind für das menschliche Leben unerlässlich. Die mitochondriale Proteinmaschinerie, die für die Aufrechterhaltung der mtDNA notwendig ist, wird von nDNA kodiert. Die grundlegenden Komponenten des mitochondrialen Replisoms sowie einige mitochondriale Biogenesefaktoren wurden bereits identifiziert (in früheren Forschungsarbeiten überprüft11,12). Die mitochondrialen DNA-Replikations- und Erhaltungsmechanismen sind jedoch noch weit davon entfernt, verstanden zu werden. Im Gegensatz zur nDNA liegt das mitochondriale Genom in mehreren Kopien vor, was eine zusätzliche Schicht zur Regulierung der mitochondrialen Genexpression darstellt. Viel weniger ist derzeit über die Verteilung und Segregation von mtDNA innerhalb von Organellen bekannt, inwieweit diese Prozesse reguliert sind und wenn ja, welche Proteine beteiligt sind13. Das Segregationsmuster ist entscheidend, wenn Zellen eine gemischte Population aus Wildtyp- und mutierter mtDNA enthalten. Ihre ungleiche Verteilung kann zur Bildung von Zellen mit einer schädlichen Menge an mutierter mtDNA führen.

Bisher wurden die Proteinfaktoren, die für den Erhalt der mtDNA notwendig sind, vor allem durch biochemische Methoden, bioinformatische Analysen oder durch krankheitsassoziierte Studien identifiziert. Um eine hohe Wahrscheinlichkeit zu gewährleisten, Faktoren zu identifizieren, die sich bisher der Identifizierung entzogen haben, wird in dieser Arbeit eine andere Strategie beschrieben. Die Methode basiert auf der Markierung von mtDNA während der Replikation oder Reparatur mit 5-Brom-2′-desoxyuridin (BrdU), einem Nukleosid-Analogon von Thymidin. BrdU wird während der DNA-Synthese leicht in entstehende DNA-Stränge eingebaut und im Allgemeinen zur Überwachung der Replikation von Kern-DNAverwendet 14. Das hier entwickelte Verfahren wurde jedoch für den Nachweis von in mtDNA eingebautem BrdU unter Verwendung der Immunfluoreszenz von Anti-BrdU-Antikörpern optimiert.

Der Ansatz ermöglicht die Hochdurchsatzquantifizierung der mtDNA-Synthese und -Verteilung in humanen Zellen, die in vitro kultiviert wurden. Eine Hochdurchsatzstrategie ist notwendig, um Tests unter verschiedenen Versuchsbedingungen in relativ kurzer Zeit durchzuführen; Daher wird im Protokoll vorgeschlagen, ein Multi-Well-Format für die Zellkultivierung und automatisierte Fluoreszenzmikroskopie für die Bildgebung zu verwenden. Das Protokoll umfasst die Transfektion von humanen HeLa-Zellen mit einer siRNA-Bibliothek und die anschließende Überwachung der mtDNA-Replikation oder -Reparatur durch die metabolische Markierung neu synthetisierter DNA mit BrdU. Dieser Ansatz wird mit einer Immunfärbung der DNA mit Hilfe von Anti-DNA-Antikörpern kombiniert. Beide Parameter werden mittels quantitativer Fluoreszenzmikroskopie analysiert. Zusätzlich werden Mitochondrien mit einem bestimmten Farbstoff sichtbar gemacht. Um die Spezifität des Protokolls zu demonstrieren, wurde die BrdU-Färbung an Zellen ohne mtDNA (rho0-Zellen), an HeLa-Zellen nach dem Silencing bekannter mtDNA-Erhaltungsfaktoren und an HeLa-Zellen nach Behandlung mit einem mtDNA-Replikationsinhibitor getestet. Die mtDNA-Konzentrationen wurden auch mit einer unabhängigen Methode, nämlich der qPCR, gemessen.

Protocol

1. Herstellung der siRNA-Mischung Einen Tag vor Beginn des Experiments werden Zellen (z.B. HeLa) auf einer 100-mm-Schale so ausgesät, dass sie am nächsten Tag eine 70%-90%-Konfluenz erreichen.Anmerkungen: Alle Operationen müssen unter sterilen Bedingungen in einer Laminar-Flow-Kammer durchgeführt werden. Die entsprechende Menge siRNA wird auf eine Konzentration von 140 nM in Opti-MEM-Medium verdünnt (siehe Materialtabelle) hergestellt. Eine 96-Well-Platte kan…

Representative Results

Ein Schema des Verfahrens für die Hochdurchsatzuntersuchung der Dynamik der mtDNA-Synthese und -Verteilung ist in Abbildung 1 dargestellt. Die Verwendung eines Multi-Well-Plattenformats ermöglicht die gleichzeitige Analyse vieler verschiedener experimenteller Bedingungen, wie z.B. das Silencing verschiedener Gene mit Hilfe einer siRNA-Bibliothek. Die Bedingungen, die für die Markierung neu synthetisierter DNA-Moleküle mit BrdU verwendet werden, ermöglichen den Nachweis von BrdU-markiert…

Discussion

In der Vergangenheit wurde die DNA-Markierung durch BrdU-Einbau und Antikörpernachweis in der nukleären DNA-Replikation und Zellzyklusforschung eingesetzt 14,27,28. Bisher enthielten alle Protokolle zum Nachweis von BrdU-markierter DNA einen DNA-Denaturierungsschritt (sauer oder thermisch) oder einen Enzymverdau (DNase oder Proteinase), um die Epitopexposition zu ermöglichen und das Eindringen von Antikörpern zu erleichtern….

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Arbeit wurde vom National Science Centre, Polen unterstützt (Grant/Award Number: 2018/31/D/NZ2/03901).

Materials

2′,3′-Dideoxycytidine (ddC) Sigma-Aldrich D5782
384  Well Cell Culture Microplates, black Greiner Bio-One #781946
5-Bromo-2′-deoxyuridine (BrdU) Sigma-Aldrich B5002-1G Dissolve BrdU powder in water to 20 mM stock solution and aliquot. Use 20 µM BrdU solution for labeling.
Adhesive sealing film Nerbe Plus 04-095-0060
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG1 secondary antibody Thermo Fisher Scientific A-21121
Alexa Fluor 555 goat anti-mouse IgM secondary antibody Thermo Fisher Scientific A-21426
BioTek 405 LS microplate washer Agilent
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma-Aldrich A4503
Cell counting chamber Thoma Heinz Herenz REF:1080339
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Cytiva SH30243.01
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Thermo Fisher Scientific 41965-062
Fetal Bovine Serum (FBS) Thermo Fisher Scientific 10270-106
Formaldehyde solution Sigma-Aldrich F1635 Formaldehyde is toxic; please read the safety data sheet carefully.
Hoechst 33342 Thermo Fisher Scientific H3570
IgG1 mouse monoclonal anti-BrdU (IIB5) primary antibody Santa Cruz Biotechnology sc-32323
IgM mouse monoclonal anti-DNA (AC-30-10) primary antibody Progen #61014
LightCycler 480 System Roche
Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent Thermo Fisher Scientific #13778150
MitoTracker Deep Red FM Thermo Fisher Scientific M22426 Mitochondria tracking dye 
Multidrop Combi Reagent Dispenser Thermo Fisher Scientific
Opti-MEM Thermo Fisher Scientific 51985-042
Orca-R2 (C10600) CCD Camera Hamamatsu
Penicillin-Streptomycin  Sigma-Aldrich P0781-100ML
Phosphate buffered saline (PBS) Sigma-Aldrich P4417-100TAB
PowerUp SYBR Green Master Mix Thermo Fisher Scientific A25742
qPCR primer Fw B2M (reference) CAGGTACTCCAAAGATTCAGG 
qPCR primer Fw GPI (reference gene) GACCTTTACTACCCAGGAGA
qPCR primer Fw MT-ND1  TAGCAGAGACCAACCGAACC 
qPCR primer Fw POLG TGGAAGGCAGGCATGGTCAAACC
qPCR primer Fw TFAM GATGAGTTCTGCCTGCTTTAT
qPCR primer Fw TWNK GCCATGTGACACTGGTCATT
qPCR primer Rev B2M (reference) GTCAACTTCAATGTCGGATGG 
qPCR primer Rev GPI (reference gene) AGTAGACAGGGCAACAAAGT
qPCR primer Rev MT-ND1  ATGAAGAATAGGGCGAAGGG 
qPCR primer Rev POLG GGAGTCAGAACACCTGGCTTTGG
qPCR primer Rev TFAM GGACTTCTGCCAGCATAATA
qPCR primer Rev TWNK AACATTGTCTGCTTCCTGGC
ScanR microscope Olympus
siRNA Ctrl Dharmacon D-001810-10-5
siRNA POLG Invitrogen POLGHSS108223
siRNA TFAM Invitrogen TFAMHSS144252
siRNA TWNK Invitrogen C10orf2HSS125597
Suction device NeoLab 2-9335 Suction device for cell culture
Triton X-100 Sigma-Aldrich T9284-500ML
Trypsin Biowest L0931-500
UPlanSApo 20x 0.75 NA objective Olympus

References

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Borowski, L. S., Kasztelan, K., Czerwinska-Kostrzewska, J., Szczesny, R. J. High-Throughput Image-Based Quantification of Mitochondrial DNA Synthesis and Distribution. J. Vis. Exp. (195), e65236, doi:10.3791/65236 (2023).

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