Summary

כימות מבוסס תמונה בתפוקה גבוהה של סינתזה והפצה של DNA מיטוכונדריאלי

Published: May 05, 2023
doi:

Summary

מתואר הליך לחקר הדינמיקה של מטבוליזם של דנ”א מיטוכונדריאלי (mtDNA) בתאים באמצעות פורמט צלחת מרובת בארות והדמיה אימונופלואורסצנטית אוטומטית כדי לזהות ולכמת סינתזה והפצה של mtDNA. זה יכול לשמש גם כדי לחקור את ההשפעות של מעכבים שונים, לחצים תאיים והשתקת גנים על חילוף החומרים mtDNA.

Abstract

הרוב המכריע של תהליכים תאיים דורשים אספקה רציפה של אנרגיה, המוביל הנפוץ ביותר של אשר הוא מולקולת ATP. תאים אאוקריוטים מייצרים את רוב ה-ATP שלהם במיטוכונדריה על ידי זרחן חמצוני. מיטוכונדריה הם אברונים ייחודיים מכיוון שיש להם גנום משלהם המשוכפל ומועבר לדור הבא של התאים. בניגוד לגנום הגרעיני, ישנם עותקים רבים של הגנום המיטוכונדריאלי בתא. המחקר המפורט של המנגנונים האחראים לשכפול, תיקון ותחזוקה של הגנום המיטוכונדריאלי חיוני להבנת תפקודם התקין של מיטוכונדריה ותאים שלמים בתנאי נורמליות ומחלות כאחד. כאן מוצגת שיטה המאפשרת כימות בתפוקה גבוהה של סינתזה והפצה של DNA מיטוכונדריאלי (mtDNA) בתאים אנושיים בתרבית חוץ גופית . גישה זו מבוססת על זיהוי אימונופלואורסצנטי של מולקולות DNA מסונתזות באופן פעיל המסומנות על ידי שילוב 5-bromo-2′-deoxyuridine (BrdU) וזיהוי בו זמנית של כל מולקולות mtDNA עם נוגדנים נגד DNA. נוסף על כך, מדמיינים את המיטוכונדריה בעזרת צבעים או נוגדנים ספציפיים. גידול תאים בפורמט רב-באר ושימוש במיקרוסקופ פלואורסצנטי אוטומטי מקלים על חקר הדינמיקה של mtDNA והמורפולוגיה של המיטוכונדריה במגוון תנאי ניסוי בזמן קצר יחסית.

Introduction

עבור רוב התאים האיקריוטים, מיטוכונדריה הם אברונים חיוניים, שכן הם ממלאים תפקיד מכריע בתהליכים תאיים רבים. בראש ובראשונה, מיטוכונדריה הם ספקי האנרגיה העיקריים של תאים1. מיטוכונדריה מעורבים גם בוויסות הומאוסטזיס תאי (לדוגמה, חמצון-חיזור תוך-תאי2 ומאזן הסידן3), איתות תאי 4,5, אפופטוזיס6, סינתזה של תרכובות ביוכימיות שונות7,8, והתגובה החיסונית המולדת9. תפקוד לקוי של המיטוכונדריה קשור למצבים פתולוגיים שונים ולמחלות אנושיות10.

תפקוד המיטוכונדריה תלוי במידע הגנטי הנמצא בשני גנומים נפרדים: הגנום הגרעיני והמיטוכונדריאלי. הגנום המיטוכונדריאלי מקודד מספר קטן של גנים בהשוואה לגנום הגרעיני, אך כל הגנים המקודדים ב-mtDNA חיוניים לחיי האדם. מנגנון החלבונים המיטוכונדריאליים הדרוש לשמירה על mtDNA מקודד על ידי nDNA. המרכיבים הבסיסיים של הרפליזום המיטוכונדריאלי, כמו גם כמה גורמים ביוגנזה מיטוכונדריאלית, כבר זוהו (נסקרו במחקר קודם11,12). עם זאת, מנגנוני השכפול והתחזוקה של הדנ”א המיטוכונדריאלי עדיין רחוקים מלהיות מובנים. בניגוד ל-nDNA, הגנום המיטוכונדריאלי קיים במספר עותקים, מה שמספק שכבה נוספת לוויסות ביטוי גנים מיטוכונדריאליים. הרבה פחות ידוע כיום על התפלגות והפרדה של mtDNA בתוך אברונים, באיזו מידה תהליכים אלה מוסדרים, ואם כן, אילו חלבונים מעורבים13. דפוס ההפרדה הוא חיוני כאשר תאים מכילים אוכלוסייה מעורבת של mtDNA מסוג בר ומוטציה. התפלגות לא שוויונית שלהם עלולה להוביל ליצירת תאים עם כמות מזיקה של mtDNA מוטציה.

עד כה, הגורמים החלבוניים הדרושים לתחזוקת mtDNA זוהו בעיקר בשיטות ביוכימיות, ניתוחים ביואינפורמטיים או באמצעות מחקרים הקשורים למחלות. בעבודה זו, על מנת להבטיח סיכוי גבוה לזיהוי גורמים שחמקו בעבר מזיהוי, מתוארת אסטרטגיה שונה. השיטה מבוססת על תיוג של mtDNA במהלך שכפול או תיקון עם 5-bromo-2′-deoxyuridine (BrdU), אנלוג נוקלאוזיד של תימידין. BrdU משולב בקלות בגדילי דנ”א מתהווים במהלך סינתזת דנ”א, ובאופן כללי, משמש לניטור שכפול דנ”א גרעיני14. עם זאת, ההליך שפותח כאן הותאם לאיתור BrdU המשולב ב- mtDNA באמצעות אימונופלואורסנציה של נוגדנים נגד BrdU.

הגישה מאפשרת כימות בתפוקה גבוהה של סינתזת mtDNA והפצה בתאים אנושיים בתרבית חוץ גופית. יש צורך באסטרטגיית תפוקה גבוהה כדי לבצע בדיקות בתנאי ניסוי שונים בזמן קצר יחסית; לכן, מוצע בפרוטוקול להשתמש בפורמט רב בארות לתרבית תאים ומיקרוסקופ פלואורסצנטי אוטומטי להדמיה. הפרוטוקול כולל העברה של תאי HeLa אנושיים עם ספריית siRNA וניטור עוקב של שכפול או תיקון mtDNA באמצעות תיוג מטבולי של DNA מסונתז חדש עם BrdU. גישה זו משולבת עם immunostaining של ה- DNA בעזרת נוגדנים anti DNA. שני הפרמטרים מנותחים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי כמותי. נוסף על כך, מדמיינים מיטוכונדריה באמצעות צבע מסוים. כדי להדגים את הספציפיות של הפרוטוקול, צביעת BrdU נבדקה על תאים נטולי mtDNA (תאי rho0), על תאי HeLa על השתקה של גורמי תחזוקה ידועים של mtDNA, ועל תאי HeLa לאחר טיפול במעכב שכפול mtDNA. רמות mtDNA נמדדו גם בשיטה עצמאית, כלומר qPCR.

Protocol

1. הכנת תערובת siRNA יום לפני תחילת הניסוי, תאי זרע (למשל, HeLa) על צלחת של 100 מ”מ, כך שהם מגיעים למפגש של 70%-90% למחרת.הערה: כל הפעולות חייבות להתבצע בתנאים סטריליים בתא זרימה למינרי. הכינו את הכמות המתאימה של siRNA מדולל לריכוז של 140 ננומטר בתווך Opti-MEM (ראו טבלת חומרים). צלח…

Representative Results

סכימה של ההליך לחקר התפוקה הגבוהה של הדינמיקה של סינתזה והפצה של mtDNA מוצגת באיור 1. השימוש בפורמט של צלחת מרובת בארות מאפשר ניתוח סימולטני של תנאי ניסוי רבים ושונים, כגון השתקה של גנים שונים באמצעות ספריית siRNA. התנאים המשמשים לתיוג של מולקולות דנ”א מסונתזות חדשות עם BrdU מאפשר?…

Discussion

מבחינה היסטורית, תיוג DNA על ידי שילוב BrdU וזיהוי נוגדנים שימש בשכפול DNA גרעיני ומחקר מחזור התא 14,27,28. עד כה, כל הפרוטוקולים לזיהוי DNA המסומן ב- BrdU כללו שלב דנטורציה של DNA (חומצי או תרמי) או עיכול אנזים (DNase או פרוטאינאז) כדי לאפשר חשיפה לאפיטופים …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה על ידי המרכז הלאומי למדע, פולין (מספר מענק/פרס: 2018/31/D/NZ2/03901).

Materials

2′,3′-Dideoxycytidine (ddC) Sigma-Aldrich D5782
384  Well Cell Culture Microplates, black Greiner Bio-One #781946
5-Bromo-2′-deoxyuridine (BrdU) Sigma-Aldrich B5002-1G Dissolve BrdU powder in water to 20 mM stock solution and aliquot. Use 20 µM BrdU solution for labeling.
Adhesive sealing film Nerbe Plus 04-095-0060
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG1 secondary antibody Thermo Fisher Scientific A-21121
Alexa Fluor 555 goat anti-mouse IgM secondary antibody Thermo Fisher Scientific A-21426
BioTek 405 LS microplate washer Agilent
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma-Aldrich A4503
Cell counting chamber Thoma Heinz Herenz REF:1080339
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Cytiva SH30243.01
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Thermo Fisher Scientific 41965-062
Fetal Bovine Serum (FBS) Thermo Fisher Scientific 10270-106
Formaldehyde solution Sigma-Aldrich F1635 Formaldehyde is toxic; please read the safety data sheet carefully.
Hoechst 33342 Thermo Fisher Scientific H3570
IgG1 mouse monoclonal anti-BrdU (IIB5) primary antibody Santa Cruz Biotechnology sc-32323
IgM mouse monoclonal anti-DNA (AC-30-10) primary antibody Progen #61014
LightCycler 480 System Roche
Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent Thermo Fisher Scientific #13778150
MitoTracker Deep Red FM Thermo Fisher Scientific M22426 Mitochondria tracking dye 
Multidrop Combi Reagent Dispenser Thermo Fisher Scientific
Opti-MEM Thermo Fisher Scientific 51985-042
Orca-R2 (C10600) CCD Camera Hamamatsu
Penicillin-Streptomycin  Sigma-Aldrich P0781-100ML
Phosphate buffered saline (PBS) Sigma-Aldrich P4417-100TAB
PowerUp SYBR Green Master Mix Thermo Fisher Scientific A25742
qPCR primer Fw B2M (reference) CAGGTACTCCAAAGATTCAGG 
qPCR primer Fw GPI (reference gene) GACCTTTACTACCCAGGAGA
qPCR primer Fw MT-ND1  TAGCAGAGACCAACCGAACC 
qPCR primer Fw POLG TGGAAGGCAGGCATGGTCAAACC
qPCR primer Fw TFAM GATGAGTTCTGCCTGCTTTAT
qPCR primer Fw TWNK GCCATGTGACACTGGTCATT
qPCR primer Rev B2M (reference) GTCAACTTCAATGTCGGATGG 
qPCR primer Rev GPI (reference gene) AGTAGACAGGGCAACAAAGT
qPCR primer Rev MT-ND1  ATGAAGAATAGGGCGAAGGG 
qPCR primer Rev POLG GGAGTCAGAACACCTGGCTTTGG
qPCR primer Rev TFAM GGACTTCTGCCAGCATAATA
qPCR primer Rev TWNK AACATTGTCTGCTTCCTGGC
ScanR microscope Olympus
siRNA Ctrl Dharmacon D-001810-10-5
siRNA POLG Invitrogen POLGHSS108223
siRNA TFAM Invitrogen TFAMHSS144252
siRNA TWNK Invitrogen C10orf2HSS125597
Suction device NeoLab 2-9335 Suction device for cell culture
Triton X-100 Sigma-Aldrich T9284-500ML
Trypsin Biowest L0931-500
UPlanSApo 20x 0.75 NA objective Olympus

References

  1. Brown, G. C. Control of respiration and ATP synthesis in mammalian mitochondria and cells. The Biochemical Journal. 284, 1-13 (1992).
  2. Zhang, L., et al. Biochemical basis and metabolic interplay of redox regulation). Redox Biology. 26, 101284 (2019).
  3. Pizzo, P., Drago, I., Filadi, R., Pozzan, T. Mitochondrial Ca2+ homeostasis: Mechanism, role, and tissue specificities. Pflugers Archiv: European Journal of Physiology. 464 (1), 3-17 (2012).
  4. Shadel, G. S., Horvath, T. L. Mitochondrial ROS signaling in organismal homeostasis. Cell. 163 (3), 560-569 (2015).
  5. Martínez-Reyes, I., Chandel, N. S. Mitochondrial TCA cycle metabolites control physiology and disease. Nature Communications. 11 (1), 102 (2020).
  6. Galluzzi, L., Kepp, O., Trojel-Hansen, C., Kroemer, G. Mitochondrial control of cellular life, stress, and death. Circulation Research. 111 (9), 1198-1207 (2012).
  7. Rone, M. B., Fan, J., Papadopoulos, V. Cholesterol transport in steroid biosynthesis: role of protein-protein interactions and implications in disease states. Biochimica Et Biophysica Acta. 1791 (7), 646-658 (2009).
  8. Swenson, S. A., et al. From synthesis to utilization: The ins and outs of mitochondrial heme. Cells. 9 (3), 579 (2020).
  9. West, A. P., Shadel, G. S., Ghosh, S. Mitochondria in innate immune responses. Nature Reviews. Immunology. 11 (6), 389-402 (2011).
  10. Nunnari, J., Suomalainen, A. Mitochondria: In sickness and in health. Cell. 148 (6), 1145-1159 (2012).
  11. Pohjoismäki, J. L. O., Goffart, S. Of circles, forks and humanity: Topological organisation and replication of mammalian mitochondrial DNA. BioEssays. 33 (4), 290-299 (2011).
  12. Gustafsson, C. M., Falkenberg, M., Larsson, N. -. G. Maintenance and expression of mammalian mitochondrial DNA. Annual Review of Biochemistry. 85, 133-160 (2016).
  13. Nicholls, T. J., Gustafsson, C. M. Separating and segregating the human mitochondrial genome. Trends in Biochemical Sciences. 43 (11), 869-881 (2018).
  14. Gratzner, H. G. Monoclonal antibody to 5-bromo- and 5-iododeoxyuridine: A new reagent for detection of DNA replication. Science. 218 (4571), 474-475 (1982).
  15. Stirling, D. R., et al. CellProfiler 4: Improvements in speed, utility and usability. BMC Bioinformatics. 22 (1), 433 (2021).
  16. R Core Team. R: A Language and Environment for Statistical Computing. R Foundation for Statistical Computing. , (2021).
  17. . dplyr: A Grammar of Data Manipulation Available from: https://CRAN.R-project.org/package=dplyr (2021)
  18. . data.table: Extension of `data.frame Available from: https://CRAN.R-project.org/package=data.table (2020)
  19. . ggplot2: Elegant graphics for data analysis Available from: https://ggplot2.tidyverse.org (2016)
  20. . ggpubr: "ggplot2" based publication ready plots Available from: https://CRAN.R-project.org/package=ggpubr (2020)
  21. Hashiguchi, K., Zhang-Akiyama, Q. -. M. Establishment of human cell lines lacking mitochondrial DNA. Methods in Molecular Biology. 554, 383-391 (2009).
  22. Piechota, J., Szczesny, R., Wolanin, K., Chlebowski, A., Bartnik, E. Nuclear and mitochondrial genome responses in HeLa cells treated with inhibitors of mitochondrial DNA expression. Acta Biochimica Polonica. 53 (3), 485-495 (2006).
  23. Spelbrink, J. N., et al. Human mitochondrial DNA deletions associated with mutations in the gene encoding Twinkle, a phage T7 gene 4-like protein localized in mitochondria. Nature Genetics. 28 (3), 223-231 (2001).
  24. Campbell, C. T., Kolesar, J. E., Kaufman, B. A. Mitochondrial transcription factor A regulates mitochondrial transcription initiation, DNA packaging, and genome copy number. Biochimica et Biophysica Acta. 1819 (9-10), 921-929 (2012).
  25. Krasich, R., Copeland, W. C. DNA polymerases in the mitochondria: A critical review of the evidence. Frontiers in Bioscience. 22 (4), 692-709 (2017).
  26. Kotrys, A. V., et al. Quantitative proteomics revealed C6orf203/MTRES1 as a factor preventing stress-induced transcription deficiency in human mitochondria. Nucleic Acids Research. 47 (14), 7502-7517 (2019).
  27. Gratzner, H. G., Pollack, A., Ingram, D. J., Leif, R. C. Deoxyribonucleic acid replication in single cells and chromosomes by immunologic techniques. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 24 (1), 34-39 (1976).
  28. Leif, R. C., Stein, J. H., Zucker, R. M. A short history of the initial application of anti-5-BrdU to the detection and measurement of S phase. Cytometry. Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 58 (1), 45-52 (2004).
  29. Lentz, S. I., et al. Mitochondrial DNA (mtDNA) biogenesis: visualization and duel incorporation of BrdU and EdU into newly synthesized mtDNA in vitro. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 58 (2), 207-218 (2010).
  30. Liu, Y., et al. Multi-omic measurements of heterogeneity in HeLa cells across laboratories. Nature Biotechnology. 37 (3), 314-322 (2019).

Play Video

Cite This Article
Borowski, L. S., Kasztelan, K., Czerwinska-Kostrzewska, J., Szczesny, R. J. High-Throughput Image-Based Quantification of Mitochondrial DNA Synthesis and Distribution. J. Vis. Exp. (195), e65236, doi:10.3791/65236 (2023).

View Video