Mitokondriyal DNA Sentezi ve Dağılımının Yüksek Verimli Görüntü Tabanlı Nicelleştirilmesi
Summary
mtDNA sentezini ve dağılımını tespit etmek ve ölçmek için çok kuyucuklu bir plaka formatı ve otomatik immünofloresan görüntüleme kullanarak hücrelerdeki mitokondriyal DNA (mtDNA) metabolizmasının dinamiklerini incelemek için bir prosedür açıklanmaktadır. Bu, çeşitli inhibitörlerin, hücresel streslerin ve gen susturmanın mtDNA metabolizması üzerindeki etkilerini araştırmak için de kullanılabilir.
Abstract
Hücresel süreçlerin büyük çoğunluğu, en yaygın taşıyıcısı ATP molekülü olan sürekli bir enerji kaynağı gerektirir. Ökaryotik hücreler ATP’lerinin çoğunu mitokondride oksidatif fosforilasyon ile üretirler. Mitokondri eşsiz organellerdir, çünkü kopyalanan ve yeni nesil hücrelere aktarılan kendi genomlarına sahiptirler. Nükleer genomun aksine, hücrede mitokondriyal genomun birden fazla kopyası vardır. Mitokondriyal genomun replikasyonu, onarımı ve bakımından sorumlu mekanizmaların ayrıntılı olarak incelenmesi, mitokondri ve tüm hücrelerin hem normal hem de hastalık koşulları altında düzgün çalışmasını anlamak için gereklidir. Burada, in vitro kültürlenmiş insan hücrelerinde mitokondriyal DNA’nın (mtDNA) sentezinin ve dağılımının yüksek verimli nicelleştirilmesine izin veren bir yöntem sunulmaktadır. Bu yaklaşım, 5-bromo-2′-deoksiüridin (BrdU) katılımı ile etiketlenmiş aktif olarak sentezlenmiş DNA moleküllerinin immünofloresan tespitine ve tüm mtDNA moleküllerinin anti-DNA antikorları ile eşzamanlı olarak tespit edilmesine dayanmaktadır. Ek olarak, mitokondri spesifik boyalar veya antikorlarla görselleştirilir. Hücrelerin çok kuyucuklu bir formatta kültürlenmesi ve otomatik bir floresan mikroskobunun kullanılması, mtDNA’nın dinamiklerini ve mitokondrinin morfolojisini nispeten kısa sürede çeşitli deneysel koşullar altında incelemeyi kolaylaştırır.
Introduction
Çoğu ökaryotik hücre için mitokondri, çok sayıda hücresel süreçte çok önemli bir rol oynadıkları için temel organellerdir. Her şeyden önce, mitokondri, hücre1’in kilit enerji tedarikçileridir. Mitokondri ayrıca hücresel homeostazın (örneğin, hücre içi redoks2 ve kalsiyum dengesi3), hücre sinyalizasyonu 4,5, apoptoz6, farklı biyokimyasal bileşiklerin sentezi 7,8 ve doğuştan gelen bağışıklık tepkisi9’un düzenlenmesinde rol oynar. Mitokondriyal disfonksiyon çeşitli patolojik durumlar ve insan hastalıkları ile ilişkilidir10.
Mitokondrinin işleyişi iki ayrı genomda bulunan genetik bilgiye bağlıdır: nükleer ve mitokondriyal genomlar. Mitokondriyal genom, nükleer genoma kıyasla az sayıda geni kodlar, ancak mtDNA ile kodlanmış tüm genler insan yaşamı için gereklidir. MtDNA’yı korumak için gerekli mitokondriyal protein mekanizması nDNA tarafından kodlanır. Mitokondriyal replisomenin temel bileşenleri ve bazı mitokondriyal biyogenez faktörleri zaten tanımlanmıştır (önceki araştırmalarda gözden geçirilmiştir11,12). Bununla birlikte, mitokondriyal DNA replikasyonu ve bakım mekanizmaları hala anlaşılmaktan uzaktır. nDNA’nın aksine, mitokondriyal genom, mitokondriyal gen ekspresyonunu düzenlemek için ek bir katman sağlayan çoklu kopyalarda bulunur. Şu anda mtDNA’nın organeller içindeki dağılımı ve ayrışması, bu süreçlerin ne ölçüde düzenlendiği ve eğer öyleyse, hangi proteinlerin dahil olduğu hakkında çok daha az şey bilinmektedir13. Ayrışma paterni, hücreler karışık bir vahşi tip ve mutasyona uğramış mtDNA popülasyonu içerdiğinde çok önemlidir. Eşit olmayan dağılımları, zararlı miktarda mutasyona uğramış mtDNA’ya sahip hücrelerin oluşumuna yol açabilir.
Şimdiye kadar, mtDNA’nın korunması için gerekli protein faktörleri esas olarak biyokimyasal yöntemler, biyoinformatik analizler veya hastalıkla ilişkili çalışmalar yoluyla tanımlanmıştır. Bu çalışmada, daha önce tanımlamadan kaçan faktörleri belirleme şansının yüksek olmasını sağlamak için farklı bir strateji tanımlanmıştır. Yöntem, timidinin bir nükleozid analoğu olan 5-bromo-2′-deoksiüridin (BrdU) ile replikasyon veya onarım sırasında mtDNA’nın etiketlenmesine dayanır. BrdU, DNA sentezi sırasında ortaya çıkan DNA iplikçiklerine kolayca dahil edilir ve genel olarak nükleer DNA14’ün replikasyonunu izlemek için kullanılır. Bununla birlikte, burada geliştirilen prosedür, anti-BrdU antikorlarının immünofloresansını kullanarak mtDNA’ya dahil edilen BrdU’yu tespit etmek için optimize edilmiştir.
Bu yaklaşım, in vitro kültürlenmiş insan hücrelerinde mtDNA sentezinin ve dağılımının yüksek verimli nicelleştirilmesine izin verir. Farklı deney koşulları altında testleri nispeten kısa sürede yapmak için yüksek verimli bir strateji gereklidir; Bu nedenle, protokolde hücre kültürü için çok kuyucuklu bir format ve görüntüleme için otomatik floresan mikroskobu kullanılması önerilmektedir. Protokol, insan HeLa hücrelerinin bir siRNA kütüphanesi ile transfeksiyonunu ve daha sonra BrdU ile yeni sentezlenen DNA’nın metabolik etiketlenmesini kullanarak mtDNA replikasyonunun veya onarımının izlenmesini içerir. Bu yaklaşım, anti-DNA antikorlarının yardımıyla DNA’nın immün boyanması ile birleştirilir. Her iki parametre de kantitatif floresan mikroskobu kullanılarak analiz edilir. Ek olarak, mitokondri belirli bir boya ile görselleştirilir. Protokolün özgüllüğünü göstermek için, BrdU boyaması, mtDNA’dan (rho0 hücreleri) yoksun hücrelerde, iyi bilinen mtDNA bakım faktörlerinin susturulması üzerine HeLa hücrelerinde ve bir mtDNA replikasyon inhibitörü ile tedaviden sonra HeLa hücrelerinde test edildi. MtDNA seviyeleri ayrıca bağımsız bir yöntemle, yani qPCR ile ölçüldü.
Protocol
Representative Results
Discussion
Tarihsel olarak, BrdU birleştirme ve antikor tespiti ile DNA etiketleme, nükleer DNA replikasyonu ve hücre döngüsü araştırmalarında kullanılmıştır 14,27,28. Şimdiye kadar, BrdU etiketli DNA’yı tespit etmek için tüm protokoller, epitop maruziyetini sağlamak ve antikor penetrasyonunu kolaylaştırmak için bir DNA denatürasyon adımı (asidik veya termal) veya enzim sindirimi (DNaz veya proteinaz) içermektedir….
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma Polonya Ulusal Bilim Merkezi tarafından desteklenmiştir (Hibe/Ödül Numarası: 2018/31/D/NZ2/03901).
Materials
| 2′,3′-Dideoxycytidine (ddC) | Sigma-Aldrich | D5782 | |
| 384 Well Cell Culture Microplates, black | Greiner Bio-One | #781946 | |
| 5-Bromo-2′-deoxyuridine (BrdU) | Sigma-Aldrich | B5002-1G | Dissolve BrdU powder in water to 20 mM stock solution and aliquot. Use 20 µM BrdU solution for labeling. |
| Adhesive sealing film | Nerbe Plus | 04-095-0060 | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG1 secondary antibody | Thermo Fisher Scientific | A-21121 | |
| Alexa Fluor 555 goat anti-mouse IgM secondary antibody | Thermo Fisher Scientific | A-21426 | |
| BioTek 405 LS microplate washer | Agilent | ||
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A4503 | |
| Cell counting chamber Thoma | Heinz Herenz | REF:1080339 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Cytiva | SH30243.01 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Thermo Fisher Scientific | 41965-062 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific | 10270-106 | |
| Formaldehyde solution | Sigma-Aldrich | F1635 | Formaldehyde is toxic; please read the safety data sheet carefully. |
| Hoechst 33342 | Thermo Fisher Scientific | H3570 | |
| IgG1 mouse monoclonal anti-BrdU (IIB5) primary antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-32323 | |
| IgM mouse monoclonal anti-DNA (AC-30-10) primary antibody | Progen | #61014 | |
| LightCycler 480 System | Roche | ||
| Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent | Thermo Fisher Scientific | #13778150 | |
| MitoTracker Deep Red FM | Thermo Fisher Scientific | M22426 | Mitochondria tracking dye |
| Multidrop Combi Reagent Dispenser | Thermo Fisher Scientific | ||
| Opti-MEM | Thermo Fisher Scientific | 51985-042 | |
| Orca-R2 (C10600) CCD Camera | Hamamatsu | ||
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P0781-100ML | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | P4417-100TAB | |
| PowerUp SYBR Green Master Mix | Thermo Fisher Scientific | A25742 | |
| qPCR primer Fw B2M (reference) | CAGGTACTCCAAAGATTCAGG | ||
| qPCR primer Fw GPI (reference gene) | GACCTTTACTACCCAGGAGA | ||
| qPCR primer Fw MT-ND1 | TAGCAGAGACCAACCGAACC | ||
| qPCR primer Fw POLG | TGGAAGGCAGGCATGGTCAAACC | ||
| qPCR primer Fw TFAM | GATGAGTTCTGCCTGCTTTAT | ||
| qPCR primer Fw TWNK | GCCATGTGACACTGGTCATT | ||
| qPCR primer Rev B2M (reference) | GTCAACTTCAATGTCGGATGG | ||
| qPCR primer Rev GPI (reference gene) | AGTAGACAGGGCAACAAAGT | ||
| qPCR primer Rev MT-ND1 | ATGAAGAATAGGGCGAAGGG | ||
| qPCR primer Rev POLG | GGAGTCAGAACACCTGGCTTTGG | ||
| qPCR primer Rev TFAM | GGACTTCTGCCAGCATAATA | ||
| qPCR primer Rev TWNK | AACATTGTCTGCTTCCTGGC | ||
| ScanR microscope | Olympus | ||
| siRNA Ctrl | Dharmacon | D-001810-10-5 | |
| siRNA POLG | Invitrogen | POLGHSS108223 | |
| siRNA TFAM | Invitrogen | TFAMHSS144252 | |
| siRNA TWNK | Invitrogen | C10orf2HSS125597 | |
| Suction device | NeoLab | 2-9335 | Suction device for cell culture |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284-500ML | |
| Trypsin | Biowest | L0931-500 | |
| UPlanSApo 20x 0.75 NA objective | Olympus |
References
- Brown, G. C. Control of respiration and ATP synthesis in mammalian mitochondria and cells. The Biochemical Journal. 284, 1-13 (1992).
- Zhang, L., et al. Biochemical basis and metabolic interplay of redox regulation). Redox Biology. 26, 101284 (2019).
- Pizzo, P., Drago, I., Filadi, R., Pozzan, T. Mitochondrial Ca2+ homeostasis: Mechanism, role, and tissue specificities. Pflugers Archiv: European Journal of Physiology. 464 (1), 3-17 (2012).
- Shadel, G. S., Horvath, T. L. Mitochondrial ROS signaling in organismal homeostasis. Cell. 163 (3), 560-569 (2015).
- Martínez-Reyes, I., Chandel, N. S. Mitochondrial TCA cycle metabolites control physiology and disease. Nature Communications. 11 (1), 102 (2020).
- Galluzzi, L., Kepp, O., Trojel-Hansen, C., Kroemer, G. Mitochondrial control of cellular life, stress, and death. Circulation Research. 111 (9), 1198-1207 (2012).
- Rone, M. B., Fan, J., Papadopoulos, V. Cholesterol transport in steroid biosynthesis: role of protein-protein interactions and implications in disease states. Biochimica Et Biophysica Acta. 1791 (7), 646-658 (2009).
- Swenson, S. A., et al. From synthesis to utilization: The ins and outs of mitochondrial heme. Cells. 9 (3), 579 (2020).
- West, A. P., Shadel, G. S., Ghosh, S. Mitochondria in innate immune responses. Nature Reviews. Immunology. 11 (6), 389-402 (2011).
- Nunnari, J., Suomalainen, A. Mitochondria: In sickness and in health. Cell. 148 (6), 1145-1159 (2012).
- Pohjoismäki, J. L. O., Goffart, S. Of circles, forks and humanity: Topological organisation and replication of mammalian mitochondrial DNA. BioEssays. 33 (4), 290-299 (2011).
- Gustafsson, C. M., Falkenberg, M., Larsson, N. -. G. Maintenance and expression of mammalian mitochondrial DNA. Annual Review of Biochemistry. 85, 133-160 (2016).
- Nicholls, T. J., Gustafsson, C. M. Separating and segregating the human mitochondrial genome. Trends in Biochemical Sciences. 43 (11), 869-881 (2018).
- Gratzner, H. G. Monoclonal antibody to 5-bromo- and 5-iododeoxyuridine: A new reagent for detection of DNA replication. Science. 218 (4571), 474-475 (1982).
- Stirling, D. R., et al. CellProfiler 4: Improvements in speed, utility and usability. BMC Bioinformatics. 22 (1), 433 (2021).
- R Core Team. R: A Language and Environment for Statistical Computing. R Foundation for Statistical Computing. , (2021).
- . dplyr: A Grammar of Data Manipulation Available from: https://CRAN.R-project.org/package=dplyr (2021)
- . data.table: Extension of `data.frame Available from: https://CRAN.R-project.org/package=data.table (2020)
- . ggplot2: Elegant graphics for data analysis Available from: https://ggplot2.tidyverse.org (2016)
- . ggpubr: "ggplot2" based publication ready plots Available from: https://CRAN.R-project.org/package=ggpubr (2020)
- Hashiguchi, K., Zhang-Akiyama, Q. -. M. Establishment of human cell lines lacking mitochondrial DNA. Methods in Molecular Biology. 554, 383-391 (2009).
- Piechota, J., Szczesny, R., Wolanin, K., Chlebowski, A., Bartnik, E. Nuclear and mitochondrial genome responses in HeLa cells treated with inhibitors of mitochondrial DNA expression. Acta Biochimica Polonica. 53 (3), 485-495 (2006).
- Spelbrink, J. N., et al. Human mitochondrial DNA deletions associated with mutations in the gene encoding Twinkle, a phage T7 gene 4-like protein localized in mitochondria. Nature Genetics. 28 (3), 223-231 (2001).
- Campbell, C. T., Kolesar, J. E., Kaufman, B. A. Mitochondrial transcription factor A regulates mitochondrial transcription initiation, DNA packaging, and genome copy number. Biochimica et Biophysica Acta. 1819 (9-10), 921-929 (2012).
- Krasich, R., Copeland, W. C. DNA polymerases in the mitochondria: A critical review of the evidence. Frontiers in Bioscience. 22 (4), 692-709 (2017).
- Kotrys, A. V., et al. Quantitative proteomics revealed C6orf203/MTRES1 as a factor preventing stress-induced transcription deficiency in human mitochondria. Nucleic Acids Research. 47 (14), 7502-7517 (2019).
- Gratzner, H. G., Pollack, A., Ingram, D. J., Leif, R. C. Deoxyribonucleic acid replication in single cells and chromosomes by immunologic techniques. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 24 (1), 34-39 (1976).
- Leif, R. C., Stein, J. H., Zucker, R. M. A short history of the initial application of anti-5-BrdU to the detection and measurement of S phase. Cytometry. Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 58 (1), 45-52 (2004).
- Lentz, S. I., et al. Mitochondrial DNA (mtDNA) biogenesis: visualization and duel incorporation of BrdU and EdU into newly synthesized mtDNA in vitro. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 58 (2), 207-218 (2010).
- Liu, Y., et al. Multi-omic measurements of heterogeneity in HeLa cells across laboratories. Nature Biotechnology. 37 (3), 314-322 (2019).
