माइटोकॉन्ड्रियल डीएनए संश्लेषण और वितरण की उच्च-थ्रूपुट छवि-आधारित परिमाणीकरण
Summary
एमटीडीएनए संश्लेषण और वितरण का पता लगाने और मात्रा निर्धारित करने के लिए एक मल्टी-वेल प्लेट प्रारूप और स्वचालित इम्यूनोफ्लोरेसेंस इमेजिंग का उपयोग करके कोशिकाओं में माइटोकॉन्ड्रियल डीएनए (एमटीडीएनए) चयापचय की गतिशीलता का अध्ययन करने की एक प्रक्रिया का वर्णन किया गया है। इसका उपयोग एमटीडीएनए चयापचय पर विभिन्न अवरोधकों, सेलुलर तनाव और जीन साइलेंसिंग के प्रभावों की जांच करने के लिए किया जा सकता है।
Abstract
सेलुलर प्रक्रियाओं के विशाल बहुमत को ऊर्जा की निरंतर आपूर्ति की आवश्यकता होती है, जिनमें से सबसे आम वाहक एटीपी अणु है। यूकेरियोटिक कोशिकाएं ऑक्सीडेटिव फॉस्फोराइलेशन द्वारा माइटोकॉन्ड्रिया में अपने अधिकांश एटीपी का उत्पादन करती हैं। माइटोकॉन्ड्रिया अद्वितीय अंग हैं क्योंकि उनके पास अपना जीनोम है जिसे अगली पीढ़ी की कोशिकाओं में दोहराया और पारित किया जाता है। परमाणु जीनोम के विपरीत, कोशिका में माइटोकॉन्ड्रियल जीनोम की कई प्रतियां होती हैं। माइटोकॉन्ड्रियल जीनोम की प्रतिकृति, मरम्मत और रखरखाव के लिए जिम्मेदार तंत्र का विस्तृत अध्ययन सामान्य और रोग दोनों स्थितियों के तहत माइटोकॉन्ड्रिया और पूरी कोशिकाओं के उचित कामकाज को समझने के लिए आवश्यक है। यहां, एक विधि जो विट्रो में सुसंस्कृत मानव कोशिकाओं में माइटोकॉन्ड्रियल डीएनए (एमटीडीएनए) के संश्लेषण और वितरण के उच्च-थ्रूपुट परिमाणीकरण की अनुमति देती है, प्रस्तुत की गई है। यह दृष्टिकोण 5-ब्रोमो-2′-डीऑक्सीयूरिडीन (बीआरडीयू) निगमन द्वारा लेबल सक्रिय रूप से संश्लेषित डीएनए अणुओं के इम्यूनोफ्लोरेसेंस का पता लगाने और एंटी-डीएनए एंटीबॉडी के साथ सभी एमटीडीएनए अणुओं की समवर्ती पहचान पर आधारित है। इसके अतिरिक्त, माइटोकॉन्ड्रिया को विशिष्ट रंगों या एंटीबॉडी के साथ देखा जाता है। एक बहु-अच्छी तरह से प्रारूप में कोशिकाओं का संवर्धन और एक स्वचालित प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप का उपयोग अपेक्षाकृत कम समय में विभिन्न प्रयोगात्मक स्थितियों के तहत एमटीडीएनए की गतिशीलता और माइटोकॉन्ड्रिया की आकृति विज्ञान का अध्ययन करना आसान बनाता है।
Introduction
अधिकांश यूकेरियोटिक कोशिकाओं के लिए माइटोकॉन्ड्रिया आवश्यक अंग हैं, क्योंकि वे कई सेलुलर प्रक्रियाओं में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। सबसे पहले और सबसे महत्वपूर्ण, माइटोकॉन्ड्रिया कोशिकाओं के प्रमुख ऊर्जा आपूर्तिकर्ता हैं1. माइटोकॉन्ड्रिया सेलुलर होमियोस्टैसिस (उदाहरण के लिए, इंट्रासेल्युलर रेडॉक्स2 और कैल्शियम बैलेंस3), सेल सिग्नलिंग4,5, एपोप्टोसिस6, विभिन्न जैव रासायनिक यौगिकों के संश्लेषण7,8, और जन्मजात प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया9 को विनियमित करने में भी शामिल हैं। माइटोकॉन्ड्रियल डिसफंक्शन विभिन्न पैथोलॉजिकल राज्यों औरमानव रोगों से जुड़ा हुआ है।
माइटोकॉन्ड्रिया का कामकाज दो अलग-अलग जीनोम में स्थित आनुवंशिक जानकारी पर निर्भर करता है: परमाणु और माइटोकॉन्ड्रियल जीनोम। माइटोकॉन्ड्रियल जीनोम परमाणु जीनोम की तुलना में जीन की एक छोटी संख्या को एन्कोड करता है, लेकिन सभी एमटीडीएनए-एन्कोडेड जीन मानव जीवन के लिए आवश्यक हैं। एमटीडीएनए को बनाए रखने के लिए आवश्यक माइटोकॉन्ड्रियल प्रोटीन मशीनरी एनडीएनए द्वारा एन्कोड की गई है। माइटोकॉन्ड्रियल रिप्लिसोम के मूल घटकों, साथ ही कुछ माइटोकॉन्ड्रियल बायोजेनेसिस कारकों की पहले ही पहचान की जा चुकी है (पिछले शोध 11,12 में समीक्षा की गई)। हालांकि, माइटोकॉन्ड्रियल डीएनए प्रतिकृति और रखरखाव तंत्र अभी भी समझने से बहुत दूर हैं। एनडीएनए के विपरीत, माइटोकॉन्ड्रियल जीनोम कई प्रतियों में मौजूद है, जो माइटोकॉन्ड्रियल जीन अभिव्यक्ति को विनियमित करने के लिए एक अतिरिक्त परत प्रदान करता है। वर्तमान में ऑर्गेनेल के भीतर एमटीडीएनए के वितरण और पृथक्करण के बारे में बहुत कम जाना जाता है, इन प्रक्रियाओं को किस हद तक विनियमित किया जाता है, और यदि वे हैं, तो कौन सेप्रोटीन शामिल हैं। अलगाव पैटर्न महत्वपूर्ण है जब कोशिकाओं में जंगली-प्रकार और उत्परिवर्तित एमटीडीएनए की मिश्रित आबादी होती है। उनके असमान वितरण से उत्परिवर्तित एमटीडीएनए की हानिकारक मात्रा के साथ कोशिकाओं की पीढ़ी हो सकती है।
अब तक, एमटीडीएनए रखरखाव के लिए आवश्यक प्रोटीन कारकों की पहचान मुख्य रूप से जैव रासायनिक विधियों, जैव सूचना विज्ञान विश्लेषण, या रोग से जुड़े अध्ययनों के माध्यम से की गई है। इस काम में, उन कारकों की पहचान करने का एक उच्च मौका सुनिश्चित करने के लिए जो पहले पहचान से बच गए हैं, एक अलग रणनीति का वर्णन किया गया है। विधि 5-ब्रोमो-2′-डीऑक्सीयूरिडीन (बीआरडीयू), थाइमिडीन के न्यूक्लियोसाइड एनालॉग के साथ प्रतिकृति या मरम्मत के दौरान एमटीडीएनए के लेबलिंग पर आधारित है। बीआरडीयू को डीएनए संश्लेषण के दौरान नवजात डीएनए किस्में में आसानी से शामिल किया जाता है और सामान्य तौर पर, परमाणु डीएनए14 की प्रतिकृति की निगरानी के लिए उपयोग किया जाता है। हालांकि, यहां विकसित प्रक्रिया को एंटी-बीआरडीयू एंटीबॉडी के इम्यूनोफ्लोरेसेंस का उपयोग करके एमटीडीएनए में शामिल बीआरडीयू का पता लगाने के लिए अनुकूलित किया गया है।
यह दृष्टिकोण इन विट्रो में सुसंस्कृत मानव कोशिकाओं में एमटीडीएनए संश्लेषण और वितरण के उच्च-थ्रूपुट परिमाणीकरण की अनुमति देता है। अपेक्षाकृत कम समय में विभिन्न प्रयोगात्मक परिस्थितियों में परीक्षण करने के लिए एक उच्च-थ्रूपुट रणनीति आवश्यक है; इसलिए, प्रोटोकॉल में इमेजिंग के लिए सेल संवर्धन और स्वचालित फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी के लिए एक बहु-अच्छी प्रारूप का उपयोग करने का प्रस्ताव है। प्रोटोकॉल में एक सीआरएनए लाइब्रेरी के साथ मानव हेला कोशिकाओं का अभिकर्मक और बीआरडीयू के साथ नए संश्लेषित डीएनए के चयापचय लेबलिंग का उपयोग करके एमटीडीएनए प्रतिकृति या मरम्मत की बाद की निगरानी शामिल है। इस दृष्टिकोण को एंटी-डीएनए एंटीबॉडी की मदद से डीएनए के इम्यूनोस्टेनिंग के साथ जोड़ा जाता है। मात्रात्मक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके दोनों मापदंडों का विश्लेषण किया जाता है। इसके अतिरिक्त, माइटोकॉन्ड्रिया को एक विशिष्ट डाई के साथ देखा जाता है। प्रोटोकॉल की विशिष्टता को प्रदर्शित करने के लिए, बीआरडीयू धुंधला होने का परीक्षण एमटीडीएनए (आरएचओ0 कोशिकाओं) से रहित कोशिकाओं पर, प्रसिद्ध एमटीडीएनए रखरखाव कारकों को चुप कराने पर हेला कोशिकाओं पर और एमटीडीएनए प्रतिकृति अवरोधक के साथ उपचार के बाद हेला कोशिकाओं पर किया गया था। एमटीडीएनए के स्तर को एक स्वतंत्र विधि, अर्थात् क्यूपीसीआर द्वारा भी मापा गया था।
Protocol
Representative Results
Discussion
ऐतिहासिक रूप से, बीआरडीयू निगमन और एंटीबॉडी का पता लगाने द्वारा डीएनए लेबलिंग का उपयोग परमाणु डीएनए प्रतिकृति और सेल चक्र अनुसंधान 14,27,28 में किया गया है। अब तक, बीआरडी…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को राष्ट्रीय विज्ञान केंद्र, पोलैंड (अनुदान / पुरस्कार संख्या: 2018/31/ डी / एनजेड 2 / 03901) द्वारा समर्थित किया गया था।
Materials
| 2′,3′-Dideoxycytidine (ddC) | Sigma-Aldrich | D5782 | |
| 384 Well Cell Culture Microplates, black | Greiner Bio-One | #781946 | |
| 5-Bromo-2′-deoxyuridine (BrdU) | Sigma-Aldrich | B5002-1G | Dissolve BrdU powder in water to 20 mM stock solution and aliquot. Use 20 µM BrdU solution for labeling. |
| Adhesive sealing film | Nerbe Plus | 04-095-0060 | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG1 secondary antibody | Thermo Fisher Scientific | A-21121 | |
| Alexa Fluor 555 goat anti-mouse IgM secondary antibody | Thermo Fisher Scientific | A-21426 | |
| BioTek 405 LS microplate washer | Agilent | ||
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A4503 | |
| Cell counting chamber Thoma | Heinz Herenz | REF:1080339 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Cytiva | SH30243.01 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Thermo Fisher Scientific | 41965-062 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific | 10270-106 | |
| Formaldehyde solution | Sigma-Aldrich | F1635 | Formaldehyde is toxic; please read the safety data sheet carefully. |
| Hoechst 33342 | Thermo Fisher Scientific | H3570 | |
| IgG1 mouse monoclonal anti-BrdU (IIB5) primary antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-32323 | |
| IgM mouse monoclonal anti-DNA (AC-30-10) primary antibody | Progen | #61014 | |
| LightCycler 480 System | Roche | ||
| Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent | Thermo Fisher Scientific | #13778150 | |
| MitoTracker Deep Red FM | Thermo Fisher Scientific | M22426 | Mitochondria tracking dye |
| Multidrop Combi Reagent Dispenser | Thermo Fisher Scientific | ||
| Opti-MEM | Thermo Fisher Scientific | 51985-042 | |
| Orca-R2 (C10600) CCD Camera | Hamamatsu | ||
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P0781-100ML | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | P4417-100TAB | |
| PowerUp SYBR Green Master Mix | Thermo Fisher Scientific | A25742 | |
| qPCR primer Fw B2M (reference) | CAGGTACTCCAAAGATTCAGG | ||
| qPCR primer Fw GPI (reference gene) | GACCTTTACTACCCAGGAGA | ||
| qPCR primer Fw MT-ND1 | TAGCAGAGACCAACCGAACC | ||
| qPCR primer Fw POLG | TGGAAGGCAGGCATGGTCAAACC | ||
| qPCR primer Fw TFAM | GATGAGTTCTGCCTGCTTTAT | ||
| qPCR primer Fw TWNK | GCCATGTGACACTGGTCATT | ||
| qPCR primer Rev B2M (reference) | GTCAACTTCAATGTCGGATGG | ||
| qPCR primer Rev GPI (reference gene) | AGTAGACAGGGCAACAAAGT | ||
| qPCR primer Rev MT-ND1 | ATGAAGAATAGGGCGAAGGG | ||
| qPCR primer Rev POLG | GGAGTCAGAACACCTGGCTTTGG | ||
| qPCR primer Rev TFAM | GGACTTCTGCCAGCATAATA | ||
| qPCR primer Rev TWNK | AACATTGTCTGCTTCCTGGC | ||
| ScanR microscope | Olympus | ||
| siRNA Ctrl | Dharmacon | D-001810-10-5 | |
| siRNA POLG | Invitrogen | POLGHSS108223 | |
| siRNA TFAM | Invitrogen | TFAMHSS144252 | |
| siRNA TWNK | Invitrogen | C10orf2HSS125597 | |
| Suction device | NeoLab | 2-9335 | Suction device for cell culture |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284-500ML | |
| Trypsin | Biowest | L0931-500 | |
| UPlanSApo 20x 0.75 NA objective | Olympus |
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