High-throughput bildebasert kvantifisering av mitokondriell DNA-syntese og distribusjon
Summary
En prosedyre for å studere dynamikken i mitokondriell DNA (mtDNA) metabolisme i celler ved hjelp av et multi-brønn plateformat og automatisert immunfluorescensavbildning for å oppdage og kvantifisere mtDNA-syntese og distribusjon er beskrevet. Dette kan videre brukes til å undersøke effekten av ulike hemmere, cellulære påkjenninger og geninaktivering på mtDNA-metabolismen.
Abstract
De aller fleste cellulære prosesser krever kontinuerlig tilførsel av energi, den vanligste bæreren er ATP-molekylet. Eukaryote celler produserer mesteparten av deres ATP i mitokondriene ved oksidativ fosforylering. Mitokondrier er unike organeller fordi de har sitt eget genom som replikeres og overføres til neste generasjon celler. I motsetning til det nukleære genomet er det flere kopier av mitokondriegenomet i cellen. Den detaljerte studien av mekanismene som er ansvarlige for replikasjon, reparasjon og vedlikehold av mitokondriegenomet er avgjørende for å forstå riktig funksjon av mitokondrier og hele celler under både normale og sykdomsforhold. Her presenteres en metode som tillater høy gjennomstrømningskvantifisering av syntesen og fordelingen av mitokondrielt DNA (mtDNA) i humane celler dyrket in vitro . Denne tilnærmingen er basert på immunfluorescensdeteksjon av aktivt syntetiserte DNA-molekyler merket ved 5-brom-2′-deoksyuridin (BrdU) inkorporering og samtidig påvisning av alle mtDNA-molekylene med anti-DNA-antistoffer. I tillegg visualiseres mitokondriene med spesifikke fargestoffer eller antistoffer. Dyrking av celler i et multibrønnformat og bruk av et automatisert fluorescensmikroskop gjør det lettere å studere dynamikken til mtDNA og mitokondrienes morfologi under en rekke eksperimentelle forhold på relativt kort tid.
Introduction
For de fleste eukaryote celler er mitokondrier essensielle organeller, da de spiller en avgjørende rolle i mange cellulære prosesser. Først og fremst er mitokondrier de viktigste energileverandørene til celler1. Mitokondrier er også involvert i regulering av cellulær homeostase (for eksempel intracellulær redoks-2 og kalsiumbalanse3), cellesignalering4,5, apoptose6, syntesen av forskjellige biokjemiske forbindelser 7,8 og den medfødte immunresponsen9. Mitokondriell dysfunksjon er forbundet med ulike patologiske tilstander og menneskelige sykdommer10.
Funksjonen av mitokondrier avhenger av den genetiske informasjonen som ligger i to separate genomer: kjernefysiske og mitokondrielle genomer. Mitokondriegenomet koder for et lite antall gener sammenlignet med kjernegenomet, men alle mtDNA-kodede gener er essensielle for menneskeliv. Det mitokondrielle proteinmaskineriet som er nødvendig for å opprettholde mtDNA, er kodet av nDNA. De grunnleggende komponentene i mitokondriell replisome, samt noen mitokondrielle biogenesefaktorer, er allerede identifisert (gjennomgått i tidligere forskning11,12). Imidlertid er mitokondriell DNA-replikasjon og vedlikeholdsmekanismer fortsatt langt fra å bli forstått. I motsetning til nDNA eksisterer mitokondriegenomet i flere kopier, noe som gir et ekstra lag for å regulere mitokondriell genuttrykk. Mye mindre er for tiden kjent om distribusjon og segregering av mtDNA i organeller, i hvilken grad disse prosessene er regulert, og hvis de er, hvilke proteiner som er involvert13. Segregeringsmønsteret er avgjørende når celler inneholder en blandet populasjon av villtype og mutert mtDNA. Deres ulik fordeling kan føre til generering av celler med en skadelig mengde mutert mtDNA.
Så langt har proteinfaktorene som er nødvendige for mtDNA-vedlikehold blitt identifisert hovedsakelig ved biokjemiske metoder, bioinformatiske analyser eller gjennom sykdomsassosierte studier. For å sikre stor sjanse for å identifisere faktorer som tidligere har unnsluppet identifisering, beskrives en annen strategi i dette arbeidet. Metoden er basert på merking av mtDNA under replikasjon eller reparasjon med 5-brom-2′-deoksyuridin (BrdU), en nukleosidanalog av tymidin. BrdU er lett innlemmet i begynnende DNA-tråder under DNA-syntese og brukes generelt til å overvåke replikasjonen av nukleært DNA14. Imidlertid har prosedyren utviklet her blitt optimalisert for å oppdage BrdU innlemmet i mtDNA ved bruk av immunfluorescens av anti-BrdU-antistoffer.
Tilnærmingen muliggjør høy gjennomstrømningskvantifisering av mtDNA-syntese og distribusjon i humane celler dyrket in vitro. En strategi med høy gjennomstrømning er nødvendig for å gjennomføre tester under forskjellige eksperimentelle forhold på relativt kort tid; Derfor foreslås det i protokollen å benytte et multibrønnformat for celledyrking og automatisert fluorescensmikroskopi for avbildning. Protokollen inkluderer transfeksjon av humane HeLa-celler med et siRNA-bibliotek og den påfølgende overvåking av mtDNA-replikasjon eller reparasjon ved bruk av metabolsk merking av nylig syntetisert DNA med BrdU. Denne tilnærmingen kombineres med immunfarging av DNA ved hjelp av anti-DNA-antistoffer. Begge parametrene analyseres ved hjelp av kvantitativ fluorescensmikroskopi. I tillegg visualiseres mitokondrier med et bestemt fargestoff. For å demonstrere protokollens spesifisitet ble BrdU-farging testet på celler uten mtDNA (rho0-celler), på HeLa-celler ved deaktivering av kjente mtDNA-vedlikeholdsfaktorer, og på HeLa-celler etter behandling med en mtDNA-replikasjonshemmer. mtDNA-nivåene ble også målt med en uavhengig metode, nemlig qPCR.
Protocol
Representative Results
Discussion
Historisk har DNA-merking ved BrdU-inkorporering og antistoffdeteksjon blitt brukt i kjernefysisk DNA-replikasjon og cellesyklusforskning 14,27,28. Så langt har alle protokollene for å oppdage BrdU-merket DNA inkludert et DNA-denatureringstrinn (surt eller termisk) eller enzymfordøyelse (DNase eller proteinase) for å muliggjøre epitopeksponering og lette antistoffpenetrasjon. Disse protokollene ble utviklet for tettpakket k…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av National Science Centre, Polen (Grant / Award Number: 2018/31/D/NZ2/03901).
Materials
| 2′,3′-Dideoxycytidine (ddC) | Sigma-Aldrich | D5782 | |
| 384 Well Cell Culture Microplates, black | Greiner Bio-One | #781946 | |
| 5-Bromo-2′-deoxyuridine (BrdU) | Sigma-Aldrich | B5002-1G | Dissolve BrdU powder in water to 20 mM stock solution and aliquot. Use 20 µM BrdU solution for labeling. |
| Adhesive sealing film | Nerbe Plus | 04-095-0060 | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG1 secondary antibody | Thermo Fisher Scientific | A-21121 | |
| Alexa Fluor 555 goat anti-mouse IgM secondary antibody | Thermo Fisher Scientific | A-21426 | |
| BioTek 405 LS microplate washer | Agilent | ||
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A4503 | |
| Cell counting chamber Thoma | Heinz Herenz | REF:1080339 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Cytiva | SH30243.01 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Thermo Fisher Scientific | 41965-062 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific | 10270-106 | |
| Formaldehyde solution | Sigma-Aldrich | F1635 | Formaldehyde is toxic; please read the safety data sheet carefully. |
| Hoechst 33342 | Thermo Fisher Scientific | H3570 | |
| IgG1 mouse monoclonal anti-BrdU (IIB5) primary antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-32323 | |
| IgM mouse monoclonal anti-DNA (AC-30-10) primary antibody | Progen | #61014 | |
| LightCycler 480 System | Roche | ||
| Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent | Thermo Fisher Scientific | #13778150 | |
| MitoTracker Deep Red FM | Thermo Fisher Scientific | M22426 | Mitochondria tracking dye |
| Multidrop Combi Reagent Dispenser | Thermo Fisher Scientific | ||
| Opti-MEM | Thermo Fisher Scientific | 51985-042 | |
| Orca-R2 (C10600) CCD Camera | Hamamatsu | ||
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P0781-100ML | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | P4417-100TAB | |
| PowerUp SYBR Green Master Mix | Thermo Fisher Scientific | A25742 | |
| qPCR primer Fw B2M (reference) | CAGGTACTCCAAAGATTCAGG | ||
| qPCR primer Fw GPI (reference gene) | GACCTTTACTACCCAGGAGA | ||
| qPCR primer Fw MT-ND1 | TAGCAGAGACCAACCGAACC | ||
| qPCR primer Fw POLG | TGGAAGGCAGGCATGGTCAAACC | ||
| qPCR primer Fw TFAM | GATGAGTTCTGCCTGCTTTAT | ||
| qPCR primer Fw TWNK | GCCATGTGACACTGGTCATT | ||
| qPCR primer Rev B2M (reference) | GTCAACTTCAATGTCGGATGG | ||
| qPCR primer Rev GPI (reference gene) | AGTAGACAGGGCAACAAAGT | ||
| qPCR primer Rev MT-ND1 | ATGAAGAATAGGGCGAAGGG | ||
| qPCR primer Rev POLG | GGAGTCAGAACACCTGGCTTTGG | ||
| qPCR primer Rev TFAM | GGACTTCTGCCAGCATAATA | ||
| qPCR primer Rev TWNK | AACATTGTCTGCTTCCTGGC | ||
| ScanR microscope | Olympus | ||
| siRNA Ctrl | Dharmacon | D-001810-10-5 | |
| siRNA POLG | Invitrogen | POLGHSS108223 | |
| siRNA TFAM | Invitrogen | TFAMHSS144252 | |
| siRNA TWNK | Invitrogen | C10orf2HSS125597 | |
| Suction device | NeoLab | 2-9335 | Suction device for cell culture |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284-500ML | |
| Trypsin | Biowest | L0931-500 | |
| UPlanSApo 20x 0.75 NA objective | Olympus |
References
- Brown, G. C. Control of respiration and ATP synthesis in mammalian mitochondria and cells. The Biochemical Journal. 284, 1-13 (1992).
- Zhang, L., et al. Biochemical basis and metabolic interplay of redox regulation). Redox Biology. 26, 101284 (2019).
- Pizzo, P., Drago, I., Filadi, R., Pozzan, T. Mitochondrial Ca2+ homeostasis: Mechanism, role, and tissue specificities. Pflugers Archiv: European Journal of Physiology. 464 (1), 3-17 (2012).
- Shadel, G. S., Horvath, T. L. Mitochondrial ROS signaling in organismal homeostasis. Cell. 163 (3), 560-569 (2015).
- Martínez-Reyes, I., Chandel, N. S. Mitochondrial TCA cycle metabolites control physiology and disease. Nature Communications. 11 (1), 102 (2020).
- Galluzzi, L., Kepp, O., Trojel-Hansen, C., Kroemer, G. Mitochondrial control of cellular life, stress, and death. Circulation Research. 111 (9), 1198-1207 (2012).
- Rone, M. B., Fan, J., Papadopoulos, V. Cholesterol transport in steroid biosynthesis: role of protein-protein interactions and implications in disease states. Biochimica Et Biophysica Acta. 1791 (7), 646-658 (2009).
- Swenson, S. A., et al. From synthesis to utilization: The ins and outs of mitochondrial heme. Cells. 9 (3), 579 (2020).
- West, A. P., Shadel, G. S., Ghosh, S. Mitochondria in innate immune responses. Nature Reviews. Immunology. 11 (6), 389-402 (2011).
- Nunnari, J., Suomalainen, A. Mitochondria: In sickness and in health. Cell. 148 (6), 1145-1159 (2012).
- Pohjoismäki, J. L. O., Goffart, S. Of circles, forks and humanity: Topological organisation and replication of mammalian mitochondrial DNA. BioEssays. 33 (4), 290-299 (2011).
- Gustafsson, C. M., Falkenberg, M., Larsson, N. -. G. Maintenance and expression of mammalian mitochondrial DNA. Annual Review of Biochemistry. 85, 133-160 (2016).
- Nicholls, T. J., Gustafsson, C. M. Separating and segregating the human mitochondrial genome. Trends in Biochemical Sciences. 43 (11), 869-881 (2018).
- Gratzner, H. G. Monoclonal antibody to 5-bromo- and 5-iododeoxyuridine: A new reagent for detection of DNA replication. Science. 218 (4571), 474-475 (1982).
- Stirling, D. R., et al. CellProfiler 4: Improvements in speed, utility and usability. BMC Bioinformatics. 22 (1), 433 (2021).
- R Core Team. R: A Language and Environment for Statistical Computing. R Foundation for Statistical Computing. , (2021).
- . dplyr: A Grammar of Data Manipulation Available from: https://CRAN.R-project.org/package=dplyr (2021)
- . data.table: Extension of `data.frame Available from: https://CRAN.R-project.org/package=data.table (2020)
- . ggplot2: Elegant graphics for data analysis Available from: https://ggplot2.tidyverse.org (2016)
- . ggpubr: "ggplot2" based publication ready plots Available from: https://CRAN.R-project.org/package=ggpubr (2020)
- Hashiguchi, K., Zhang-Akiyama, Q. -. M. Establishment of human cell lines lacking mitochondrial DNA. Methods in Molecular Biology. 554, 383-391 (2009).
- Piechota, J., Szczesny, R., Wolanin, K., Chlebowski, A., Bartnik, E. Nuclear and mitochondrial genome responses in HeLa cells treated with inhibitors of mitochondrial DNA expression. Acta Biochimica Polonica. 53 (3), 485-495 (2006).
- Spelbrink, J. N., et al. Human mitochondrial DNA deletions associated with mutations in the gene encoding Twinkle, a phage T7 gene 4-like protein localized in mitochondria. Nature Genetics. 28 (3), 223-231 (2001).
- Campbell, C. T., Kolesar, J. E., Kaufman, B. A. Mitochondrial transcription factor A regulates mitochondrial transcription initiation, DNA packaging, and genome copy number. Biochimica et Biophysica Acta. 1819 (9-10), 921-929 (2012).
- Krasich, R., Copeland, W. C. DNA polymerases in the mitochondria: A critical review of the evidence. Frontiers in Bioscience. 22 (4), 692-709 (2017).
- Kotrys, A. V., et al. Quantitative proteomics revealed C6orf203/MTRES1 as a factor preventing stress-induced transcription deficiency in human mitochondria. Nucleic Acids Research. 47 (14), 7502-7517 (2019).
- Gratzner, H. G., Pollack, A., Ingram, D. J., Leif, R. C. Deoxyribonucleic acid replication in single cells and chromosomes by immunologic techniques. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 24 (1), 34-39 (1976).
- Leif, R. C., Stein, J. H., Zucker, R. M. A short history of the initial application of anti-5-BrdU to the detection and measurement of S phase. Cytometry. Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 58 (1), 45-52 (2004).
- Lentz, S. I., et al. Mitochondrial DNA (mtDNA) biogenesis: visualization and duel incorporation of BrdU and EdU into newly synthesized mtDNA in vitro. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 58 (2), 207-218 (2010).
- Liu, Y., et al. Multi-omic measurements of heterogeneity in HeLa cells across laboratories. Nature Biotechnology. 37 (3), 314-322 (2019).
