Normothermic Ex Vivo levermaskinperfusion i mus
Summary
Ett normotermiskt ex vivo leverperfusionssystem (NEVLP) skapades för muslever. Detta system kräver erfarenhet av mikrokirurgi men möjliggör reproducerbara perfusionsresultat. Möjligheten att använda muslever underlättar undersökningen av molekylära vägar för att identifiera nya perfusattillsatser och möjliggör utförande av experiment med fokus på organreparation.
Abstract
Detta protokoll presenterar ett optimerat erytrocytfritt NEVLP-system med muslever. Ex vivo-konservering av muslever uppnåddes genom att använda modifierade kanyler och tekniker anpassade från konventionell kommersiell ex vivo-perfusionsutrustning. Systemet användes för att utvärdera bevaranderesultaten efter 12 timmars perfusion. C57BL/6J-möss fungerade som leverdonatorer, och levern explanterades genom kanylering av portalvenen (PV) och gallgången (BD) och därefter spolning av organet med varm (37 °C) hepariniserad saltlösning. Därefter överfördes de explanterade leverna till perfusionskammaren och utsattes för normotermisk syresatt maskinperfusion (NEVLP). Inlopps- och utloppsperfusatprover samlades in med 3 timmars intervall för perfusatanalys. Efter avslutad perfusion erhölls leverprover för histologisk analys, med morfologisk integritet bedömd med modifierad Suzuki-Score genom hematoxylin-Eosin (HE) färgning. Optimeringsexperimenten gav följande resultat: (1) möss som vägde över 30 g ansågs mer lämpliga för experimentet på grund av den större storleken på deras gallgång (BD). (2) en 2 Fr (ytterdiameter = 0,66 mm) polyuretankanyl var bättre lämpad för kanylering av portalvenen (PV) jämfört med en polypropenkanyl. Detta tillskrevs polyuretanmaterialets förbättrade grepp, vilket resulterade i minskad kateterglidning under överföringen från kroppen till organkammaren. (3) för kanylering av gallgången (BD) visade sig en 1 Fr (ytterdiameter = 0,33 mm) polyuretankanyl vara effektivare jämfört med polypropen UT – 03 (ytterdiameter = 0,30 mm) kanyl. Med detta optimerade protokoll bevarades muslever framgångsrikt under en varaktighet av 12 timmar utan signifikant inverkan på den histologiska strukturen. Hematoxylin-Eosin (HE) färgning avslöjade en välbevarad morfologisk arkitektur i levern, kännetecknad av övervägande livskraftiga hepatocyter med tydligt synliga kärnor och mild utvidgning av leverbihåleoider.
Introduction
Levertransplantation representerar guldstandardbehandlingen för personer med leversjukdom i slutstadiet. Tyvärr överstiger efterfrågan på donerade organ det tillgängliga utbudet, vilket leder till en betydande brist. År 2021 stod cirka 24 936 patienter på väntelistan för ett levertransplantat, medan endast 9 234 transplantationer framgångsrikt utfördes1. Den betydande skillnaden mellan utbud och efterfrågan på levertransplantat belyser det pressande behovet av att undersöka alternativa strategier för att bredda givarpoolen och förbättra tillgängligheten av levertransplantat. Ett sätt att utöka donatorpoolen är att använda marginella givare2. Marginella givare inkluderar de med hög ålder, måttlig eller svår steatos. Även om transplantation av marginella organ kan ge gynnsamma resultat, förblir de övergripande resultaten suboptimala. Som ett resultat pågår för närvarande utvecklingen av terapeutiska strategier som syftar till att förbättra funktionen hos marginella givare 3,4.
En av strategierna är att använda maskinperfusion, särskilt normotermisk syresatt maskinperfusion, för att förbättra funktionen hos dessa marginella organ5. Det finns dock fortfarande en begränsad förståelse för de molekylära mekanismer som ligger till grund för de fördelaktiga effekterna av normotermisk syresatt maskinperfusion (NEVLP). Möss, med sin rikliga tillgång på genetiskt modifierade stammar, fungerar som värdefulla modeller för att undersöka molekylära vägar. Till exempel har betydelsen av autofagivägar för att mildra hepatisk ischemi-reperfusionsskada alltmer erkänts 6,7. En viktig molekylär väg i leverischemi-reperfusionsskadan är miR-20b-5p / ATG7-vägen8. För närvarande finns det ett antal ATG-knockout- och villkorade knock-out-musstammar tillgängliga men inga motsvarande råttstammar9.
Baserat på denna bakgrund var målet att skapa en miniatyriserad NEVLP-plattform för levertransplantat från möss. Denna plattform skulle underlätta utforskning och utvärdering av potentiella genetiskt modifierade strategier som syftar till att förbättra funktionaliteten hos donatorns lever. Dessutom var det viktigt att systemet var lämpligt för långvarig perfusion, vilket möjliggjorde ex vivo-behandling av levern, vanligen kallad “organreparation”.
Med tanke på den begränsade tillgången på relevanta in vitro-data om leverperfusion på möss fokuserade litteraturgenomgången på studier utförda på råtta. En systematisk sökning av litteratur som sträckte sig från 2010 till 2022 utfördes med hjälp av nyckelord som “normotermisk leverperfusion”, “ex vivo eller in vitro” och “råttor“. Denna sökning syftade till att identifiera optimala förhållanden hos gnagare, så att vi kunde bestämma det lämpligaste tillvägagångssättet.
Perfusionssystemet består av en förseglad vattenmantlad glasbuffertbehållare, en peristaltisk rullpump, en oxygenator, en bubbelfälla, en värmeväxlare, en orgelkammare och ett slutet cykelrörsystem (figur 1). Systemet säkerställer exakt underhåll av en konstant perfusionstemperatur på 37 °C med hjälp av en särskild termostatisk maskin. Den peristaltiska rullpumpen driver perfusatets flöde genom hela kretsen. Perfusionskretsen initieras vid den isolerade vattenmantlade behållaren. Därefter riktas perfusatet genom oxygenatorn, som mottar en gasblandning av 95% syre och 5% koldioxid från en dedikerad gasflaska. Efter syresättning passerar perfusatet genom bubbelfällan, varvid eventuella fångade bubblor omdirigeras tillbaka till behållaren av den peristaltiska pumpen. Det återstående perfusatet strömmar genom värmeväxlaren och går in i orgelkammaren, varifrån det återvänder till behållaren.
Här rapporterar vi våra erfarenheter av att etablera en NEVLP för muslever och delar de lovande resultaten av ett pilotexperiment utfört med det syresatta mediet utan syrebärare.
Protocol
Representative Results
Discussion
Kritiska steg i protokollet
De två avgörande stegen i leverexplantation är kanylering av portalvenen (PV) och efterföljande kanylering av gallgången (BD). Dessa steg är av yttersta vikt för att säkerställa framgångsrik organhämtning och efterföljande perfusions- eller transplantationsförfaranden.
Utmaningar och lösningar
PV-kanylering innebär tre utmaningar: skada på kärlväggen, förskjutning av katetern och genomförbarhet av införing…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Under skrivandet av detta dokument har jag fått mycket stöd och hjälp. Jag vill särskilt tacka min lagkamrat XinPei Chen för hans underbara samarbete och tålmodiga stöd under min operation.
Materials
| 0.5 ml Micro Tube PP | Sarstedt | 72699 | |
| 1 Fr Rubber Cannula | Vygon | Sample Cannula | |
| 10 µL Micro Syringe | Hamilton | 701N | |
| 2 Fr Rubber Cannula | Vygon | Sample Cannula | |
| 24 G Butterfly Cannula | Terumo | SR+OF2419 | |
| 26 G Butterfly Cannula | Terumo | SR+DU2619WX | |
| 30 G Hypodermic Needle | Sterican | 100246 | |
| 50 ml Syringe Pump | Braun | 110356 | |
| 6-0 Perma-Hand Seide | Ethicon | 639H | |
| Arterial Clip | Braun | BH014R | |
| Autoclavable Moist Chamber | Hugo Sachs Elektronik | 73-4733 | |
| Big Cotton Applicator | NOBA Verbandmittel Danz GmbH | 974018 | |
| Bubble Trap | Hugo-Sachs-Elektronik | V83163 | |
| Buprenovet (0.3 mg / ml) | Elanco | / | |
| CIDEX OPA solution (2 L) | Cilag GmbH | 20391 | |
| Electrosurgical Unit for Monopolar Cutting VIO® 50 C | ERBE | / | |
| Fetal Bovine Serum(500 ml) | Sigma-Aldrich | F7524-500ML | |
| Gas Mixture (95 % oxygen & 5 % carbon dioxide) | House Supply | / | |
| Heating Circulating Baths | Harvard-Apparatus | 75-0310 | |
| Heparin 5000 (I.E. /5 ml) | Braun | 1708.00.00 | |
| Hydrocortisone (100 mg / 2 ml) | Pfizer | 15427276 | |
| Insulin(100 IE / ml) | Sigma | I0516-5ML | |
| Iris Scissors | Fine Science Instruments | 15000-03 | |
| Isofluran (250 ml) | Cp-Pharma | 1214 | |
| Membrane Oxygenator | Hugo Sachs Elektronik | T18728 | |
| Microsurgery Microscope | Leica | M60 | |
| Mouse Retractor Set | Carfil Quality | 180000056 | |
| NanoZoomer 2.0 HT | Hamamatsu | / | |
| Non-Woven Sponges | Kompressen | 866110 | |
| Penicillin Streptomycin (1 mg / ml) | C.C.Pro | Z-13-M | |
| Perfusion Extension Tube (30 cm) | Braun | 4256000 | |
| Peristaltic Pump | Harvard-Apparatus | P-70 | |
| Petri Dishc 100×15 mm | VWR® | 391-0578 | |
| Povidon-Jod (Vet-Sep Spray) | Livisto | 799-416 | |
| Pressure Transducer Simulator | UTAH Medical Products | 650-950 | |
| Reusable Blood Pressure Transducers | AD Instruments | MLT-0380/D | |
| S & T Vessel Cannulation Forceps | Fine Science Instruments | 00608-11 | |
| Small Cotton Applicator | NOBA Verbandmittel Danz GmbH | 974116 | |
| Straight Forceps 10 cm | Fine Science Instruments | 00632-11 | |
| Suture Tying Forceps | Fine Science Instruments | 11063-07 | |
| Syringe 50ml Original Perfusor | Braun | 8728810F-06 | |
| UT – 03 Cannula | Unique Medical, Japan | / | |
| Vannas Spring Scissors | Fine Science Instruments | 15018-10 | |
| Veterinary Saline (500 ml) | WDT | 18X1807 | |
| Water Jacketed Reservoir 2 L | Harvard-Apparatus | 73-3441 | |
| William's E Medium (500 ML) | Thermofischer Scientific | A1217601 |
References
- Kwong, A. J., et al. OPTN/SRTR 2021 Annual data report: liver. American Journal of Transplantation. 23 (2), S178-S263 (2023).
- Linares, I., Hamar, M., Selzner, N., Selzner, M. Steatosis in Liver Transplantation: Current Limitations and Future Strategies. Transplantation. 103 (1), 78-90 (2019).
- Cheng, N., et al. Pharmacological activating transcription factor 6 activation is beneficial for liver retrieval with ex vivo normothermic mechanical perfusion from cardiac dead donor rats. Frontiers in Surgery. 8, 665260 (2021).
- Porte, R. J. Improved organ recovery after oxygen deprivation. Nature. 608 (7922), 273-274 (2022).
- Goumard, C., et al. Ex-Vivo Pharmacological Defatting of the Liver: A Review. Journal of Clinical Medicine. 10 (6), 1253 (2021).
- Mao, B., Yuan, W., Wu, F., Yan, Y., Wang, B. Autophagy in hepatic ischemia-reperfusion injury. Cell Death Discovery. 9 (1), 115 (2023).
- Hale, A. N., Ledbetter, D. J., Gawriluk, T. R., Rucker, E. B. Autophagy: regulation and role in development. Autophagy. 9 (7), 951-972 (2013).
- Tang, B., Bao, N., He, G., Wang, J. Long noncoding RNA HOTAIR regulates autophagy via the miR-20b-5p/ATG7 axis in hepatic ischemia/reperfusion injury. Gene. 686, 56-62 (2019).
- Kuma, A., Komatsu, M., Mizushima, N. Autophagy-monitoring and autophagy-deficient mice. Autophagy. 13 (10), 1619-1628 (2017).
- van der, V. a. l. k. . J. Fetal bovine serum-A cell culture dilemma. Science. 375 (6577), 143-144 (2022).
- Haque, O., et al. Twenty-four hour ex-vivo normothermic machine perfusion in rat livers. Technology (Singapore World Science). 8 (1-2), 27-36 (2020).
- Op den Dries, S., et al. Normothermic machine perfusion reduces bile duct injury and improves biliary epithelial function in rat donor livers. Liver Transplantation. 22 (7), 994-1005 (2016).
- Izamis, M. L., et al. Machine perfusion enhances hepatocyte isolation yields from ischemic livers. Cryobiology. 71 (2), 244-255 (2015).
- Gassner, J. M. G. V., et al. Improvement of normothermic ex vivo machine perfusion of rat liver grafts by dialysis and kupffer cell inhibition with glycine. Liver Transplantation. 25 (2), 275-287 (2019).
- Casado, J., et al. Rat splanchnic net oxygen consumption, energy implications. The Journal of Physiology. 431, 557-569 (1990).
- Tolboom, H., et al. A model for normothermic preservation of the rat liver. Tissue Engineering. 13 (8), 2143-2151 (2007).
- Yamada, S., et al. Effects of short-term normothermic and subnormothermic perfusion after cold preservation on liver transplantation from donors after cardiac death. Transplantation Proceedings. 52 (6), 1639-1642 (2020).
- Behrends, M., et al. Acute hyperglycemia worsens hepatic ischemia/reperfusion injury in rats. Journal of Gastrointestinal Surgery. 14 (3), 528-535 (2010).
- Tolboom, H., et al. Sequential cold storage and normothermic perfusion of the ischemic rat liver. Transplant Proceeding. 40 (5), 1306-1309 (2008).
- Daemen, M. J., et al. Liver blood flow measurement in the rat. The electromagnetic versus the microsphere and the clearance methods. Journal of Pharmacological Methods. 21 (4), 287-297 (1989).
- Koo, A., Liang, I. Y. Microvascular filling pattern in rat liver sinusoids during vagal stimulation. The Journal of physiology. 295, 191-199 (1979).
- Beal, E. W., et al. [D-Ala2, D-Leu5] Enkephalin improves liver preservation during normothermic ex vivo perfusion. Journal of Surgical Research. 241, 323-335 (2019).
- Birnie, J. H., Grayson, J. Observations on temperature distribution and liver blood flow in the rat. The Journal of Physiology. 116 (2), 189-201 (1952).
- Silitonga, M., Silitonga, P. M. Haematological profile of rats (Rattus norvegicus) induced BCG and provided leaf extract of Plectranthus amboinicus Lour Spreng). AIP Conference Proceedings. 1868, 090008090008 (2017).
- Jacob Filho, W., et al. Reference database of hematological parameters for growing and aging rats. Aging Male. 21 (2), 145-148 (2018).
- Tian, X., et al. Heme oxygenase-1-modified bone marrow mesenchymal stem cells combined with normothermic machine perfusion repairs bile duct injury in a rat model of DCD liver transplantation via activation of peribiliary glands through the Wnt pathway. Stem Cells International. 2021, 9935370 (2021).
- Yang, L., et al. Normothermic machine perfusion combined with bone marrow mesenchymal stem cells improves the oxidative stress response and mitochondrial function in rat donation after circulatory death livers. Stem Cells Development. 29 (13), 835-852 (2020).
- Wang, L., He, H. W., Zhou, X., Long, Y. Ursodeoxycholic Acid (UDCA) promotes lactate metabolism in mouse hepatocytes through cholic acid (CA) – farnesoid x receptor (FXR) pathway. Current Molecular Medicine. 20 (8), 661-666 (2020).
- Akateh, C., Beal, E. W., Whitson, B. A., Black, S. M. Normothermic ex-vivo liver perfusion and the clinical implications for liver transplantation. Journal of Clinical and Translational Hepatology. 6 (3), 276-282 (2018).
- Westerkamp, A. C., et al. Metformin preconditioning improves hepatobiliary function and reduces injury in a rat model of normothermic machine perfusion and orthotopic transplantation. Transplantation. 104 (9), e271-e280 (2020).
- Nösser, M., et al. Development of a rat liver machine perfusion system for normothermic and subnormothermic conditions. Tissue Engineering. Part A. 26 (1-2), 57-65 (2020).
- Yao, J., et al. Extracellular vesicles derived from human umbilical cord mesenchymal stem cells alleviate rat hepatic ischemia-reperfusion injury by suppressing oxidative stress and neutrophil inflammatory response. FASEB Journal. 33 (2), 1695-1710 (2019).
- Haque, O., et al. The effect of blood cells retained in rat livers during static cold storage on viability outcomes during normothermic machine perfusion. Scientific Reports. 11 (1), 23128 (2021).
- Gillooly, A. R., Perry, J., Martins, P. N. First report of siRNA uptake (for RNA interference) during ex vivo hypothermic and normothermic liver machine perfusion. Transplantation. 103 (3), e56-e57 (2019).
- Beal, E. W., et al. A small animal model of ex vivo normothermic liver perfusion. Journal of visualized experiments. (136), e57541 (2018).
- Claussen, F., et al. Dual versus single vessel normothermic ex vivo perfusion of rat liver grafts using metamizole for vasodilatation. PLoS One. 15 (7), (2020).
- Yang, L., et al. Bone marrow mesenchymal stem cells combine with normothermic machine perfusion to improve rat donor liver quality-the important role of hepatic microcirculation in donation after circulatory death. Cell and Tissue Research. 381 (2), 239-254 (2020).
- Wu, L., et al. Bone marrow mesenchymal stem cells modified with heme oxygenase-1 alleviate rejection of donation after circulatory death liver transplantation by inhibiting dendritic cell maturation in rats. International Immunopharmacology. 107, 108643 (2022).
- Lonati, C., et al. Quantitative Metabolomics of Tissue, Perfusate, and Bile from Rat Livers Subjected to Normothermic Machine Perfusion. Biomedicines. 10 (3), (2022).
- Oldani, G., et al. The impact of short-term machine perfusion on the risk of cancer recurrence after rat liver transplantation with donors after circulatory death. PLoS One. 14 (11), e0224890 (2019).
- Abraham, N., et al. Two compartment evaluation of liver grafts during acellular room temperature machine perfusion (acRTMP) in a rat liver transplant model. Frontiers in Medicine (Lausanne). 9, 804834 (2022).
- Scheuermann, U., et al. Sirtuin-1 expression and activity is diminished in aged liver grafts. Scientific Reports. 10 (1), 11860 (2020).
- Scheuermann, U., et al. Damage-associated molecular patterns induce inflammatory injury during machine preservation of the liver: potential targets to enhance a promising technology. Liver Transplantation. 25 (4), 610-626 (2019).
- Carnevale, M. E., et al. The novel N, N-bis-2-hydroxyethyl-2-aminoethanesulfonic acid-gluconate-polyethylene glycol-hypothermic machine perfusion solution improves static cold storage and reduces ischemia/reperfusion injury in rat liver transplant. Liver Transplantation. 25 (9), 1375-1386 (2019).
- Von, C., Horn, H., Zlatev, J., Pletz, B., Lüer, T., Minor, Comparison of thermal variations in post-retrieval graft conditioning on rat livers. Artificial Organs. 46 (2), 239-245 (2022).
- Tomizawa, M., et al. Oncostatin M in William’s E medium is suitable for initiation of hepatocyte differentiation in human induced pluripotent stem cells. Molecular Medicine Reports. 15 (5), 3088-3092 (2017).
- Dondossola, D., et al. Human red blood cells as oxygen carriers to improve ex-situ liver perfusion in a rat model. Journal of Clinical medicine. 8 (11), (2019).
- Jägers, J., Wrobeln, A., Ferenz, K. B. Perfluorocarbon-based oxygen carriers: from physics to physiology. European Journal of Physiology. 473 (2), 139-150 (2021).
- Jia, J., et al. A promising ex vivo liver protection strategy: machine perfusion and repair. Surgery and Nutrition. 8 (2), 142-143 (2019).
- Jennings, H., et al. The immunological effect of oxygen carriers on normothermic ex vivo liver perfusion. Frontiers in Immunology. 13, 833243 (2022).
- Kim, J. S., et al. Carbamazepine suppresses calpain-mediated autophagy impairment after ischemia/reperfusion in mouse livers. Toxicology and Applied Pharmacology. 273 (3), 600-610 (2013).
- Imber, C. J., et al. Advantages of normothermic perfusion over cold storage in liver preservation. Transplantation. 73 (5), 701-709 (2002).
- Tolboom, H., et al. Recovery of warm ischemic rat liver grafts by normothermic extracorporeal perfusion. Transplantation. 87 (2), 170-177 (2009).
- Rigo, F., Navarro-Tableros, V., De Stefano, N., Calleri, N., Romagnoli, A. Ex vivo normothermic hypoxic rat liver perfusion model: an experimental setting for organ recondition and pharmacological intervention. Methods in Molecular Biology. 2269, 139-150 (2021).
- van Dyk, J. C., Pieterse, G. M., van Vuren, J. H. Histological changes in the liver of Oreochromis mossambicus (Cichlidae) after exposure to cadmium and zinc. Ecotoxicology and Environmental Safety. 66 (3), 432-440 (2007).
