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Engineering

マウスにおけるノルマザーミック Ex vivo 肝臓機械灌流

Published: September 25, 2023
doi:
10.3791/65363
, , , ,
1Experimental Transplantation Surgery, Department of General, Visceral and Vascular Surgery,Jena University Hospital, 2Institute of Pathology,Klinikum Chemnitz GmbH, 3Department of Pathology, Faculty of Veterinary Medicine,Menoufia University

Summary

マウス肝臓用に正常体温 外生体外 肝灌流(NEVLP)システムが作成されました。このシステムはマイクロサージャリーの経験が必要ですが、再現性のある灌流結果を可能にします。マウスの肝臓を利用することで、分子経路の探索が容易になり、新規灌流液添加物が同定され、臓器修復に重点を置いた実験が可能になります。

Abstract

このプロトコルは、マウス肝臓を用いた最適化された赤血球フリーNEVLPシステムを提示します。マウス肝臓の 生体外 保存は、改変カニューレおよび従来の市販 のex vivo 灌流装置から適応された技術を採用することによって達成された。このシステムは、12時間の灌流後の保存結果を評価するために利用されました。C57BL/6Jマウスを肝ドナーとし、門脈(PV)と胆管(BD)をカニューレ挿入し、その後、温かい(37°C)ヘパリン化生理食塩水で臓器を洗い流すことによって肝臓を移植しました。次いで、移植した肝臓を灌流チャンバーに移し、正常体温酸素化機械灌流(NEVLP)に供した。流入口および出口灌流液サンプルを、灌流液分析のために3時間間隔で収集した。灌流が完了すると、組織学的分析のために肝臓サンプルが取得され、ヘマトキシリン-エオシン(HE)染色による修正スズキスコアを使用して形態学的完全性が評価されました。最適化実験の結果、(1)体重が30gを超えるマウスは、胆管(BD)のサイズが大きいため、実験に適していると見なされました。(2) 2 Fr(外径=0.66 mm)ポリウレタンカニューレは, ポリプロピレンカニューレと比較して門脈カニューレ挿入(PV)に適していた.これは、ポリウレタン素材のグリップ力が向上し、体から臓器室への移動中のカテーテルの滑りが減少したことに起因していました。(3)胆管カニューレ挿入術(BD)では,ポリプロピレンUT-03(外径=0.30mm)カニューレに比べて1Fr(外径=0.33mm)ポリウレタンカニューレの方が有効であることがわかった。この最適化されたプロトコルにより、マウスの肝臓は、組織学的構造に大きな影響を与えることなく、12時間の間首尾よく保存されました。ヘマトキシリン-エオシン(HE)染色により、肝臓のよく保存された形態学的構造が明らかになり、核がはっきりと見える主に生存肝細胞と肝類洞の軽度の拡張が特徴でした。

Introduction

肝移植は、末期肝疾患のある個人のゴールドスタンダード治療です。残念ながら、ドナー臓器の需要は利用可能な供給を上回り、大幅な不足につながっています。2021年には、約24,936人の患者が肝移植の順番待ちリストに載っていましたが、成功した移植は9,234件だけでした1。肝移植片の需要と供給の著しい格差は、ドナープールを拡大し、肝移植片のアクセシビリティを高めるための代替戦略を調査する差し迫った必要性を浮き彫りにしています。ドナープールを拡大する1つの方法は、限界ドナー2を使用することです。限界ドナーには、高齢、中等度または重度の脂肪症のドナーが含まれます。辺縁臓器の移植は好ましい結果をもたらすかもしれませんが、全体的な結果は最適ではないままです。その結果、限界ドナーの機能を高めることを目的とした治療戦略の開発が現在進行中です3,4。

戦略の1つは、機械灌流、特に正常体温酸素化機械灌流を使用して、これらの辺縁器官の機能を改善することです5。しかし、正常体温酸素化機械灌流(NEVLP)の有益な効果の根底にある分子メカニズムについての理解はまだ限られています。マウスは、遺伝子組み換え株が豊富に利用できるため、分子経路を調べるための貴重なモデルとして機能します。例えば、肝虚血再灌流障害の緩和におけるオートファジー経路の重要性は、ますます認識されています6,7。肝虚血再灌流障害における重要な分子経路の1つは、miR-20b-5p/ATG7経路8です。現在、ATGノックアウトおよび条件付きノックアウトマウス系統が多数入手可能であるが、対応するラット系統は存在しない9。

このような背景から、マウス肝移植片用の小型NEVLPプラットフォームを作製することを目的としていました。このプラットフォームは、ドナーの肝臓の機能を改善することを目的とした潜在的な遺伝子組み換え戦略の調査と評価を容易にします。さらに、システムが長期灌流に適していることが不可欠であり、一般に「臓器修復」と呼ばれる肝臓の 生体外 治療を可能にしました。

マウス肝灌流に関する関連する in vitro データの入手可能性が限られていることを考慮して、文献レビューはラットで実施された研究に焦点を当てた。2010年から2022年までの文献を「正常熱肝灌流」「ex vivo または in vitro」「ラット」などのキーワードを用いて系統的検索を行った。この検索は、げっ歯類の最適条件を特定することを目的としており、最も適切なアプローチを決定することができました。

灌流システムは、密閉されたウォータージャケット付きガラスバッファーリザーバー、ペリスタルティックローラーポンプ、酸素発生器、バブルトラップ、熱交換器、臓器室、およびクローズドサイクリングチューブシステムで構成されています(図1)。このシステムは、専用のサーモスタットマシンを使用して、37°Cの一定の灌流温度を正確に維持します。蠕動ローラーポンプは、回路全体の灌流液の流れを駆動します。灌流回路は、絶縁されたウォータージャケットリザーバーで開始されます。続いて、灌流液は酸素発生器を通って導かれ、酸素発生器は専用のガスボトルから95%の酸素と5%の二酸化炭素のガス混合物を受け取る。酸素化に続いて、灌流液はバブルトラップを通過し、そこで閉じ込められた気泡は蠕動ポンプによってリザーバーにリダイレクトされます。残りの灌流液は熱交換器を通って流れ、臓器室に入り、そこからリザーバーに戻ります。

本稿では、マウス肝臓のNEVLPを確立した経験を報告し、酸素キャリアを含まない酸素化培地を用いて行ったパイロット実験の有望な結果を共有します。

Protocol

動物実験は、動物福祉に関する現在のドイツの規制とガイドライン、および動物研究の報告に関するARRIVEガイドラインに従って実施されました。動物実験プロトコルは、ドイツ、テューリンゲン州のテューリンガー州議会によって承認されました(承認番号:UKJ – 17 – 106)。 注:体重34 ± 4 g(平均[SEM]の平均±標準誤差)の雄C57BL / 6Jマウスを肝臓ドナーとして使用しました。それ?…

Representative Results

手術手技の確立合計17匹の動物がこの実験に利用されました:門脈(PV)と胆管(BD)のカニューレ挿入を含む臓器調達プロセスを最適化するために14匹のマウスが使用され、3匹のマウスが手順を検証するために使用されました(表1)。組織学的結果(図3)を、最適な灌流条件の同定を容易にするために比較した。 灌流液の選?…

Discussion

プロトコルの重要なステップ
肝移植における2つの重要なステップは、門脈のカニューレ挿入(PV)とそれに続く胆管のカニューレ挿入(BD)です。これらのステップは、臓器摘出とその後の灌流または移植手順を成功させる上で最も重要です。

課題と解決策
PVカニュレーションには、血管壁の損傷、カテーテルの変位、挿入プロセスの実用性の3?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

この論文の執筆を通して、私は多くの支援と支援を受けました。特に、チームメイトのXinPei Chenの素晴らしい協力と私の手術中の忍耐強いサポートに感謝したいと思います。

Materials

0.5 ml Micro Tube PP Sarstedt 72699
1 Fr Rubber Cannula Vygon Sample Cannula
10 µL Micro Syringe Hamilton 701N
2 Fr Rubber Cannula Vygon Sample Cannula
24 G Butterfly Cannula Terumo SR+OF2419
26 G Butterfly Cannula Terumo SR+DU2619WX
30 G Hypodermic Needle Sterican 100246
50 ml Syringe Pump Braun 110356
6-0 Perma-Hand Seide Ethicon 639H
Arterial Clip Braun BH014R
Autoclavable Moist Chamber Hugo Sachs Elektronik 73-4733
Big Cotton Applicator  NOBA Verbandmittel Danz GmbH 974018
Bubble Trap Hugo-Sachs-Elektronik V83163
Buprenovet (0.3 mg / ml) Elanco /
CIDEX OPA solution (2 L) Cilag GmbH 20391
Electrosurgical Unit for Monopolar Cutting VIO® 50 C ERBE /
Fetal Bovine Serum(500 ml)  Sigma-Aldrich F7524-500ML
Gas Mixture (95 % oxygen & 5 % carbon dioxide) House Supply /
Heating Circulating Baths Harvard-Apparatus 75-0310
Heparin 5000 (I.E. /5 ml) Braun 1708.00.00
Hydrocortisone (100 mg / 2 ml) Pfizer 15427276
Insulin(100 IE / ml) Sigma I0516-5ML
Iris Scissors  Fine Science Instruments 15000-03
Isofluran (250 ml) Cp-Pharma 1214
Membrane Oxygenator Hugo Sachs Elektronik T18728
Microsurgery Microscope  Leica M60
Mouse Retractor Set  Carfil Quality 180000056
NanoZoomer 2.0 HT Hamamatsu /
Non-Woven Sponges  Kompressen 866110
Penicillin Streptomycin (1 mg / ml)  C.C.Pro Z-13-M
Perfusion Extension Tube (30 cm) Braun 4256000
Peristaltic Pump Harvard-Apparatus P-70
Petri Dishc 100×15 mm VWR® 391-0578
Povidon-Jod (Vet-Sep Spray) Livisto 799-416
Pressure Transducer Simulator UTAH Medical Products 650-950
Reusable Blood Pressure Transducers AD Instruments MLT-0380/D
S & T Vessel Cannulation Forceps Fine Science Instruments 00608-11
Small Cotton Applicator NOBA Verbandmittel Danz GmbH 974116
Straight Forceps 10 cm  Fine Science Instruments 00632-11
Suture Tying Forceps Fine Science Instruments 11063-07
Syringe 50ml Original Perfusor Braun 8728810F-06
UT – 03 Cannula Unique Medical, Japan /
Vannas Spring Scissors Fine Science Instruments 15018-10
Veterinary Saline (500 ml) WDT 18X1807
Water Jacketed Reservoir  2 L Harvard-Apparatus 73-3441
William's E Medium (500 ML) Thermofischer Scientific A1217601
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Chen, H., Dirsch, O., Albadry, M., Ana, P. H., Dahmen, U. Normothermic Ex Vivo Liver Machine Perfusion in Mouse. J. Vis. Exp. (199), e65363, doi:10.3791/65363 (2023).
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