Perfusione della macchina epatica Normothermic Ex Vivo nel topo
Summary
È stato creato un sistema di perfusione epatica normotermica ex vivo (NEVLP) per i fegati di topo. Questo sistema richiede esperienza in microchirurgia, ma consente risultati di perfusione riproducibili. La capacità di utilizzare fegati di topo facilita lo studio dei percorsi molecolari per identificare nuovi additivi perfufulati e consente l’esecuzione di esperimenti incentrati sulla riparazione degli organi.
Abstract
Questo protocollo presenta un sistema NEVLP ottimizzato privo di eritrociti utilizzando fegati di topo. La conservazione ex vivo dei fegati di topo è stata ottenuta impiegando cannule modificate e tecniche adattate dalle tradizionali apparecchiature commerciali di perfusione ex vivo . Il sistema è stato utilizzato per valutare i risultati di conservazione dopo 12 ore di perfusione. I topi C57BL / 6J sono serviti come donatori di fegato e i fegati sono stati espiantati inannulando la vena porta (PV) e il dotto biliare (BD), e successivamente lavando l’organo con soluzione salina eparinizzata calda (37 ° C). Quindi, i fegati espiantati sono stati trasferiti nella camera di perfusione e sottoposti a perfusione normotermica ossigenata (NEVLP). I campioni di perfusato in ingresso e in uscita sono stati raccolti a intervalli di 3 ore per l’analisi del perfusato. Al termine della perfusione, sono stati ottenuti campioni di fegato per l’analisi istologica, con integrità morfologica valutata utilizzando Suzuki-Score modificato attraverso la colorazione dell’ematossilina-eosina (HE). Gli esperimenti di ottimizzazione hanno prodotto i seguenti risultati: (1) i topi di peso superiore a 30 g sono stati ritenuti più adatti per l’esperimento a causa delle maggiori dimensioni del loro dotto biliare (BD). (2) una cannula in poliuretano da 2 Fr (diametro esterno = 0,66 mm) era più adatta per l’incannulamento della vena porta (PV) rispetto a una cannula in polipropilene. Ciò è stato attribuito alla maggiore presa del materiale poliuretanico, con conseguente riduzione dello slittamento del catetere durante il trasferimento dal corpo alla camera dell’organo. (3) per l’incannulamento del dotto biliare (BD), una cannula in poliuretano da 1 Fr (diametro esterno = 0,33 mm) è risultata più efficace rispetto alla cannula in polipropilene UT – 03 (diametro esterno = 0,30 mm). Con questo protocollo ottimizzato, i fegati di topo sono stati conservati con successo per una durata di 12 ore senza un impatto significativo sulla struttura istologica. La colorazione dell’ematossilina-eosina (HE) ha rivelato un’architettura morfologica ben conservata del fegato, caratterizzata da epatociti prevalentemente vitali con nuclei chiaramente visibili e lieve dilatazione delle sinusoidi epatiche.
Introduction
Il trapianto di fegato rappresenta il trattamento gold standard per gli individui con malattia epatica allo stadio terminale. Purtroppo, la domanda di organi da donatore supera l’offerta disponibile, portando a una carenza significativa. Nel 2021, circa 24.936 pazienti erano in lista d’attesa per un trapianto di fegato, mentre solo 9.234 trapianti sono stati eseguiti con successo1. La significativa disparità tra l’offerta e la domanda di innesti di fegato evidenzia la pressante necessità di studiare strategie alternative per ampliare il pool di donatori e migliorare l’accessibilità degli innesti di fegato. Un modo per espandere il pool di donatori consiste nell’utilizzare donatori marginali2. I donatori marginali includono quelli con età avanzata, steatosi moderata o grave. Sebbene il trapianto di organi marginali possa produrre risultati favorevoli, i risultati complessivi rimangono non ottimali. Di conseguenza, è attualmente in corso lo sviluppo di strategie terapeutiche volte a migliorare la funzione dei donatori marginali 3,4.
Una delle strategie è quella di utilizzare la perfusione della macchina, in particolare la perfusione della macchina ossigenata normotermica, per migliorare la funzione di questi organi marginali5. Tuttavia, esiste ancora una comprensione limitata dei meccanismi molecolari che sono alla base degli effetti benefici della perfusione normotermica ossigenata (NEVLP). I topi, con la loro abbondante disponibilità di ceppi geneticamente modificati, servono come modelli preziosi per studiare i percorsi molecolari. Ad esempio, l’importanza delle vie autofagiche nel mitigare il danno da ischemia-riperfusione epatica è stata sempre più riconosciuta 6,7. Un’importante via molecolare nel danno da ischemia-riperfusione epatica è la via 8 di miR-20b-5p/ATG7. Attualmente, sono disponibili un certo numero di ceppi di topi knockout ATG e knock-out condizionali, ma nessun ceppo di ratto corrispondente9.
Sulla base di questo background, l’obiettivo era quello di generare una piattaforma NEVLP miniaturizzata per innesti di fegato di topo. Questa piattaforma faciliterebbe l’esplorazione e la valutazione di potenziali strategie geneticamente modificate volte a migliorare la funzionalità del fegato del donatore. Inoltre, era essenziale che il sistema fosse adatto alla perfusione a lungo termine, consentendo il trattamento ex vivo del fegato, comunemente indicato come “riparazione d’organo”.
Considerando la limitata disponibilità di dati in vitro rilevanti sulla perfusione epatica di topo, la revisione della letteratura si è concentrata su studi condotti sui ratti. Una ricerca sistematica della letteratura che va dal 2010 al 2022 è stata eseguita utilizzando parole chiave come “perfusione epatica normotermica”, “ex vivo o in vitro” e “ratti“. Questa ricerca mirava a identificare le condizioni ottimali nei roditori, permettendoci di determinare l’approccio più appropriato.
Il sistema di perfusione è costituito da un serbatoio tampone di vetro sigillato con camicia d’acqua, una pompa a rulli peristaltica, un ossigenatore, una trappola a bolle, uno scambiatore di calore, una camera d’organo e un sistema di tubi ciclici chiusi (Figura 1). Il sistema garantisce il mantenimento preciso di una temperatura di perfusione costante di 37 °C utilizzando una macchina termostatica dedicata. La pompa a rulli peristaltici guida il flusso del perfusato in tutto il circuito. Il circuito di perfusione inizia nel serbatoio isolato con camicia d’acqua. Successivamente, il perfusato viene diretto attraverso l’ossigenatore, che riceve una miscela di gas del 95% di ossigeno e del 5% di anidride carbonica da una bombola di gas dedicata. Dopo l’ossigenazione, il perfusato passa attraverso la trappola a bolle, in cui eventuali bolle intrappolate vengono reindirizzate al serbatoio dalla pompa peristaltica. Il perfusato rimanente scorre attraverso lo scambiatore di calore ed entra nella camera dell’organo, da dove ritorna al serbatoio.
Qui, riportiamo le nostre esperienze nella creazione di un NEVLP per fegati di topo e condividiamo i risultati promettenti di un esperimento pilota eseguito utilizzando il mezzo ossigenato senza vettori di ossigeno.
Protocol
Representative Results
Discussion
Passaggi critici nel protocollo
I due passaggi cruciali nell’espianto di fegato sono l’incannulamento della vena porta (PV) e il successivo incannulamento del dotto biliare (BD). Questi passaggi sono di fondamentale importanza per garantire il successo del prelievo degli organi e delle successive procedure di perfusione o trapianto.
Sfide e soluzioni
L’incannulamento fotovoltaico presenta tre sfide: lesione della parete del vaso, spostamento del catetere…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Durante la stesura di questo documento, ho ricevuto un grande sostegno e assistenza. Vorrei ringraziare in particolare il mio compagno di squadra XinPei Chen per la sua meravigliosa collaborazione e il supporto paziente durante la mia operazione.
Materials
| 0.5 ml Micro Tube PP | Sarstedt | 72699 | |
| 1 Fr Rubber Cannula | Vygon | Sample Cannula | |
| 10 µL Micro Syringe | Hamilton | 701N | |
| 2 Fr Rubber Cannula | Vygon | Sample Cannula | |
| 24 G Butterfly Cannula | Terumo | SR+OF2419 | |
| 26 G Butterfly Cannula | Terumo | SR+DU2619WX | |
| 30 G Hypodermic Needle | Sterican | 100246 | |
| 50 ml Syringe Pump | Braun | 110356 | |
| 6-0 Perma-Hand Seide | Ethicon | 639H | |
| Arterial Clip | Braun | BH014R | |
| Autoclavable Moist Chamber | Hugo Sachs Elektronik | 73-4733 | |
| Big Cotton Applicator | NOBA Verbandmittel Danz GmbH | 974018 | |
| Bubble Trap | Hugo-Sachs-Elektronik | V83163 | |
| Buprenovet (0.3 mg / ml) | Elanco | / | |
| CIDEX OPA solution (2 L) | Cilag GmbH | 20391 | |
| Electrosurgical Unit for Monopolar Cutting VIO® 50 C | ERBE | / | |
| Fetal Bovine Serum(500 ml) | Sigma-Aldrich | F7524-500ML | |
| Gas Mixture (95 % oxygen & 5 % carbon dioxide) | House Supply | / | |
| Heating Circulating Baths | Harvard-Apparatus | 75-0310 | |
| Heparin 5000 (I.E. /5 ml) | Braun | 1708.00.00 | |
| Hydrocortisone (100 mg / 2 ml) | Pfizer | 15427276 | |
| Insulin(100 IE / ml) | Sigma | I0516-5ML | |
| Iris Scissors | Fine Science Instruments | 15000-03 | |
| Isofluran (250 ml) | Cp-Pharma | 1214 | |
| Membrane Oxygenator | Hugo Sachs Elektronik | T18728 | |
| Microsurgery Microscope | Leica | M60 | |
| Mouse Retractor Set | Carfil Quality | 180000056 | |
| NanoZoomer 2.0 HT | Hamamatsu | / | |
| Non-Woven Sponges | Kompressen | 866110 | |
| Penicillin Streptomycin (1 mg / ml) | C.C.Pro | Z-13-M | |
| Perfusion Extension Tube (30 cm) | Braun | 4256000 | |
| Peristaltic Pump | Harvard-Apparatus | P-70 | |
| Petri Dishc 100×15 mm | VWR® | 391-0578 | |
| Povidon-Jod (Vet-Sep Spray) | Livisto | 799-416 | |
| Pressure Transducer Simulator | UTAH Medical Products | 650-950 | |
| Reusable Blood Pressure Transducers | AD Instruments | MLT-0380/D | |
| S & T Vessel Cannulation Forceps | Fine Science Instruments | 00608-11 | |
| Small Cotton Applicator | NOBA Verbandmittel Danz GmbH | 974116 | |
| Straight Forceps 10 cm | Fine Science Instruments | 00632-11 | |
| Suture Tying Forceps | Fine Science Instruments | 11063-07 | |
| Syringe 50ml Original Perfusor | Braun | 8728810F-06 | |
| UT – 03 Cannula | Unique Medical, Japan | / | |
| Vannas Spring Scissors | Fine Science Instruments | 15018-10 | |
| Veterinary Saline (500 ml) | WDT | 18X1807 | |
| Water Jacketed Reservoir 2 L | Harvard-Apparatus | 73-3441 | |
| William's E Medium (500 ML) | Thermofischer Scientific | A1217601 |
References
- Kwong, A. J., et al. OPTN/SRTR 2021 Annual data report: liver. American Journal of Transplantation. 23 (2), S178-S263 (2023).
- Linares, I., Hamar, M., Selzner, N., Selzner, M. Steatosis in Liver Transplantation: Current Limitations and Future Strategies. Transplantation. 103 (1), 78-90 (2019).
- Cheng, N., et al. Pharmacological activating transcription factor 6 activation is beneficial for liver retrieval with ex vivo normothermic mechanical perfusion from cardiac dead donor rats. Frontiers in Surgery. 8, 665260 (2021).
- Porte, R. J. Improved organ recovery after oxygen deprivation. Nature. 608 (7922), 273-274 (2022).
- Goumard, C., et al. Ex-Vivo Pharmacological Defatting of the Liver: A Review. Journal of Clinical Medicine. 10 (6), 1253 (2021).
- Mao, B., Yuan, W., Wu, F., Yan, Y., Wang, B. Autophagy in hepatic ischemia-reperfusion injury. Cell Death Discovery. 9 (1), 115 (2023).
- Hale, A. N., Ledbetter, D. J., Gawriluk, T. R., Rucker, E. B. Autophagy: regulation and role in development. Autophagy. 9 (7), 951-972 (2013).
- Tang, B., Bao, N., He, G., Wang, J. Long noncoding RNA HOTAIR regulates autophagy via the miR-20b-5p/ATG7 axis in hepatic ischemia/reperfusion injury. Gene. 686, 56-62 (2019).
- Kuma, A., Komatsu, M., Mizushima, N. Autophagy-monitoring and autophagy-deficient mice. Autophagy. 13 (10), 1619-1628 (2017).
- van der, V. a. l. k. . J. Fetal bovine serum-A cell culture dilemma. Science. 375 (6577), 143-144 (2022).
- Haque, O., et al. Twenty-four hour ex-vivo normothermic machine perfusion in rat livers. Technology (Singapore World Science). 8 (1-2), 27-36 (2020).
- Op den Dries, S., et al. Normothermic machine perfusion reduces bile duct injury and improves biliary epithelial function in rat donor livers. Liver Transplantation. 22 (7), 994-1005 (2016).
- Izamis, M. L., et al. Machine perfusion enhances hepatocyte isolation yields from ischemic livers. Cryobiology. 71 (2), 244-255 (2015).
- Gassner, J. M. G. V., et al. Improvement of normothermic ex vivo machine perfusion of rat liver grafts by dialysis and kupffer cell inhibition with glycine. Liver Transplantation. 25 (2), 275-287 (2019).
- Casado, J., et al. Rat splanchnic net oxygen consumption, energy implications. The Journal of Physiology. 431, 557-569 (1990).
- Tolboom, H., et al. A model for normothermic preservation of the rat liver. Tissue Engineering. 13 (8), 2143-2151 (2007).
- Yamada, S., et al. Effects of short-term normothermic and subnormothermic perfusion after cold preservation on liver transplantation from donors after cardiac death. Transplantation Proceedings. 52 (6), 1639-1642 (2020).
- Behrends, M., et al. Acute hyperglycemia worsens hepatic ischemia/reperfusion injury in rats. Journal of Gastrointestinal Surgery. 14 (3), 528-535 (2010).
- Tolboom, H., et al. Sequential cold storage and normothermic perfusion of the ischemic rat liver. Transplant Proceeding. 40 (5), 1306-1309 (2008).
- Daemen, M. J., et al. Liver blood flow measurement in the rat. The electromagnetic versus the microsphere and the clearance methods. Journal of Pharmacological Methods. 21 (4), 287-297 (1989).
- Koo, A., Liang, I. Y. Microvascular filling pattern in rat liver sinusoids during vagal stimulation. The Journal of physiology. 295, 191-199 (1979).
- Beal, E. W., et al. [D-Ala2, D-Leu5] Enkephalin improves liver preservation during normothermic ex vivo perfusion. Journal of Surgical Research. 241, 323-335 (2019).
- Birnie, J. H., Grayson, J. Observations on temperature distribution and liver blood flow in the rat. The Journal of Physiology. 116 (2), 189-201 (1952).
- Silitonga, M., Silitonga, P. M. Haematological profile of rats (Rattus norvegicus) induced BCG and provided leaf extract of Plectranthus amboinicus Lour Spreng). AIP Conference Proceedings. 1868, 090008090008 (2017).
- Jacob Filho, W., et al. Reference database of hematological parameters for growing and aging rats. Aging Male. 21 (2), 145-148 (2018).
- Tian, X., et al. Heme oxygenase-1-modified bone marrow mesenchymal stem cells combined with normothermic machine perfusion repairs bile duct injury in a rat model of DCD liver transplantation via activation of peribiliary glands through the Wnt pathway. Stem Cells International. 2021, 9935370 (2021).
- Yang, L., et al. Normothermic machine perfusion combined with bone marrow mesenchymal stem cells improves the oxidative stress response and mitochondrial function in rat donation after circulatory death livers. Stem Cells Development. 29 (13), 835-852 (2020).
- Wang, L., He, H. W., Zhou, X., Long, Y. Ursodeoxycholic Acid (UDCA) promotes lactate metabolism in mouse hepatocytes through cholic acid (CA) – farnesoid x receptor (FXR) pathway. Current Molecular Medicine. 20 (8), 661-666 (2020).
- Akateh, C., Beal, E. W., Whitson, B. A., Black, S. M. Normothermic ex-vivo liver perfusion and the clinical implications for liver transplantation. Journal of Clinical and Translational Hepatology. 6 (3), 276-282 (2018).
- Westerkamp, A. C., et al. Metformin preconditioning improves hepatobiliary function and reduces injury in a rat model of normothermic machine perfusion and orthotopic transplantation. Transplantation. 104 (9), e271-e280 (2020).
- Nösser, M., et al. Development of a rat liver machine perfusion system for normothermic and subnormothermic conditions. Tissue Engineering. Part A. 26 (1-2), 57-65 (2020).
- Yao, J., et al. Extracellular vesicles derived from human umbilical cord mesenchymal stem cells alleviate rat hepatic ischemia-reperfusion injury by suppressing oxidative stress and neutrophil inflammatory response. FASEB Journal. 33 (2), 1695-1710 (2019).
- Haque, O., et al. The effect of blood cells retained in rat livers during static cold storage on viability outcomes during normothermic machine perfusion. Scientific Reports. 11 (1), 23128 (2021).
- Gillooly, A. R., Perry, J., Martins, P. N. First report of siRNA uptake (for RNA interference) during ex vivo hypothermic and normothermic liver machine perfusion. Transplantation. 103 (3), e56-e57 (2019).
- Beal, E. W., et al. A small animal model of ex vivo normothermic liver perfusion. Journal of visualized experiments. (136), e57541 (2018).
- Claussen, F., et al. Dual versus single vessel normothermic ex vivo perfusion of rat liver grafts using metamizole for vasodilatation. PLoS One. 15 (7), (2020).
- Yang, L., et al. Bone marrow mesenchymal stem cells combine with normothermic machine perfusion to improve rat donor liver quality-the important role of hepatic microcirculation in donation after circulatory death. Cell and Tissue Research. 381 (2), 239-254 (2020).
- Wu, L., et al. Bone marrow mesenchymal stem cells modified with heme oxygenase-1 alleviate rejection of donation after circulatory death liver transplantation by inhibiting dendritic cell maturation in rats. International Immunopharmacology. 107, 108643 (2022).
- Lonati, C., et al. Quantitative Metabolomics of Tissue, Perfusate, and Bile from Rat Livers Subjected to Normothermic Machine Perfusion. Biomedicines. 10 (3), (2022).
- Oldani, G., et al. The impact of short-term machine perfusion on the risk of cancer recurrence after rat liver transplantation with donors after circulatory death. PLoS One. 14 (11), e0224890 (2019).
- Abraham, N., et al. Two compartment evaluation of liver grafts during acellular room temperature machine perfusion (acRTMP) in a rat liver transplant model. Frontiers in Medicine (Lausanne). 9, 804834 (2022).
- Scheuermann, U., et al. Sirtuin-1 expression and activity is diminished in aged liver grafts. Scientific Reports. 10 (1), 11860 (2020).
- Scheuermann, U., et al. Damage-associated molecular patterns induce inflammatory injury during machine preservation of the liver: potential targets to enhance a promising technology. Liver Transplantation. 25 (4), 610-626 (2019).
- Carnevale, M. E., et al. The novel N, N-bis-2-hydroxyethyl-2-aminoethanesulfonic acid-gluconate-polyethylene glycol-hypothermic machine perfusion solution improves static cold storage and reduces ischemia/reperfusion injury in rat liver transplant. Liver Transplantation. 25 (9), 1375-1386 (2019).
- Von, C., Horn, H., Zlatev, J., Pletz, B., Lüer, T., Minor, Comparison of thermal variations in post-retrieval graft conditioning on rat livers. Artificial Organs. 46 (2), 239-245 (2022).
- Tomizawa, M., et al. Oncostatin M in William’s E medium is suitable for initiation of hepatocyte differentiation in human induced pluripotent stem cells. Molecular Medicine Reports. 15 (5), 3088-3092 (2017).
- Dondossola, D., et al. Human red blood cells as oxygen carriers to improve ex-situ liver perfusion in a rat model. Journal of Clinical medicine. 8 (11), (2019).
- Jägers, J., Wrobeln, A., Ferenz, K. B. Perfluorocarbon-based oxygen carriers: from physics to physiology. European Journal of Physiology. 473 (2), 139-150 (2021).
- Jia, J., et al. A promising ex vivo liver protection strategy: machine perfusion and repair. Surgery and Nutrition. 8 (2), 142-143 (2019).
- Jennings, H., et al. The immunological effect of oxygen carriers on normothermic ex vivo liver perfusion. Frontiers in Immunology. 13, 833243 (2022).
- Kim, J. S., et al. Carbamazepine suppresses calpain-mediated autophagy impairment after ischemia/reperfusion in mouse livers. Toxicology and Applied Pharmacology. 273 (3), 600-610 (2013).
- Imber, C. J., et al. Advantages of normothermic perfusion over cold storage in liver preservation. Transplantation. 73 (5), 701-709 (2002).
- Tolboom, H., et al. Recovery of warm ischemic rat liver grafts by normothermic extracorporeal perfusion. Transplantation. 87 (2), 170-177 (2009).
- Rigo, F., Navarro-Tableros, V., De Stefano, N., Calleri, N., Romagnoli, A. Ex vivo normothermic hypoxic rat liver perfusion model: an experimental setting for organ recondition and pharmacological intervention. Methods in Molecular Biology. 2269, 139-150 (2021).
- van Dyk, J. C., Pieterse, G. M., van Vuren, J. H. Histological changes in the liver of Oreochromis mossambicus (Cichlidae) after exposure to cadmium and zinc. Ecotoxicology and Environmental Safety. 66 (3), 432-440 (2007).
