Нормотермическая перфузия печени ex vivo у мышей
Summary
Для печени мышей была создана нормотермическая система перфузии печени ex vivo (NEVLP). Эта система требует опыта в микрохирургии, но позволяет получить воспроизводимые результаты перфузии. Возможность использования печени мышей облегчает исследование молекулярных путей для выявления новых добавок перфузата и позволяет проводить эксперименты, направленные на восстановление органов.
Abstract
Этот протокол представляет собой оптимизированную систему NEVLP без эритроцитов с использованием печени мышей. Сохранение печени мышей ex vivo было достигнуто за счет использования модифицированных канюль и методов, адаптированных из обычного коммерческого перфузионного оборудования ex vivo . Система была использована для оценки результатов сохранения после 12 часов перфузии. Мыши C57BL/6J служили донорами печени, а печень эксплантировали путем канюляции воротной вены (PV) и желчного протока (BD) и последующего промывания органа теплым (37 °C) гепаринизированным физиологическим раствором. Затем эксплантированную печень переносили в перфузионную камеру и подвергали нормотермической оксигенированной машинной перфузии (NEVLP). Образцы перфузата на входе и выходе отбирали с интервалом в 3 часа для анализа перфузата. После завершения перфузии были получены образцы печени для гистологического анализа, при этом морфологическая целостность оценивалась с использованием модифицированной шкалы Suzuki-Score путем окрашивания гематоксилин-эозином (HE). Эксперименты по оптимизации дали следующие результаты: (1) мыши весом более 30 г были признаны более подходящими для эксперимента из-за большего размера их желчного протока (BD). (2) полиуретановая канюля 2 Fr (наружный диаметр = 0,66 мм) лучше подходила для канюляции воротной вены (PV) по сравнению с полипропиленовой канюлей. Это было связано с улучшенным сцеплением полиуретанового материала, что привело к уменьшению проскальзывания катетера при переносе из тела в камеру органа. (3) для канюляции желчного протока (BD) полиуретановая канюля 1 Fr (наружный диаметр = 0,33 мм) оказалась более эффективной по сравнению с полипропиленовой канюлей UT – 03 (наружный диаметр = 0,30 мм). С помощью этого оптимизированного протокола печень мышей была успешно сохранена в течение 12 часов без существенного влияния на гистологическую структуру. Окрашивание гематоксилин-эозином (ГЭ) выявило хорошо сохранившуюся морфологическую архитектуру печени, характеризующуюся преимущественно жизнеспособными гепатоцитами с хорошо видимыми ядрами и легкой дилатацией печеночных синусоидов.
Introduction
Трансплантация печени представляет собой золотой стандарт лечения людей с терминальной стадией заболевания печени. К сожалению, спрос на донорские органы превышает имеющееся предложение, что приводит к значительному дефициту. В 2021 году около 24 936 пациентов находились в листе ожидания на пересадку печени, при этом было успешно выполнено только 9 234 трансплантации1. Значительное несоответствие между спросом и предложением на трансплантаты печени подчеркивает настоятельную необходимость изучения альтернативных стратегий для расширения пула доноров и повышения доступности трансплантатов печени. Одним из путей расширения пула доноров является использование маргинальных доноров2. К маргинальным донорам относятся пожилые люди, с умеренным или тяжелым стеатозом. Хотя трансплантация маргинальных органов может дать благоприятные результаты, общие результаты остаются неоптимальными. В результате в настоящеевремя ведется разработка терапевтических стратегий, направленных на усиление функции маргинальных доноров3,4.
Одна из стратегий состоит в том, чтобы использовать машинную перфузию, особенно нормотермическую кислородированную машинную перфузию, для улучшения функции этих маргинальных органов5. Тем не менее, все еще существует ограниченное понимание молекулярных механизмов, лежащих в основе благотворного воздействия нормотермической оксигенированной машинной перфузии (NEVLP). Мыши, с их обильной доступностью генетически модифицированных штаммов, служат ценными моделями для исследования молекулярных путей. Например, значение путей аутофагии в смягчении ишемии-реперфузионного повреждения печени все чаще признается 6,7. Одним из важных молекулярных путей при ишемии-реперфузии печени является путь miR-20b-5p/ATG78. В настоящее время существует ряд штаммов мышей с нокаутом АТГ и условным нокаутом, но нет соответствующих штаммов крыс9.
Исходя из этого, цель состояла в том, чтобы создать миниатюрную платформу NEVLP для трансплантатов печени мышей. Эта платформа облегчит изучение и оценку потенциальных генетически модифицированных стратегий, направленных на улучшение функциональности печени донора. Кроме того, было важно, чтобы система была пригодна для длительной перфузии, что позволяло проводить лечение печени ex vivo , обычно называемое «восстановлением органов».
Учитывая ограниченную доступность соответствующих данных in vitro о перфузии печени мышей, обзор литературы был сосредоточен на исследованиях, проведенных на крысах. Систематический поиск литературы за период с 2010 по 2022 год проводился с использованием таких ключевых слов, как «нормотермическая перфузия печени», «ex vivo или in vitro» и «крысы». Этот поиск был направлен на выявление оптимальных условий у грызунов, что позволило определить наиболее подходящий подход.
Перфузионная система состоит из герметичного стеклянного буферного резервуара с водяной рубашкой, перистальтического роликового насоса, оксигенатора, пузырьковой ловушки, теплообменника, камеры органа и замкнутой системы циклических трубок (рис. 1). Система обеспечивает точное поддержание постоянной температуры перфузии 37 °C с помощью специальной термостатической машины. Перистальтический роликовый насос приводит в движение поток перфузата по всему контуру. Перфузионный контур начинается в изолированном резервуаре с водяной рубашкой. Затем перфузат направляется через оксигенатор, который получает газовую смесь из 95% кислорода и 5% углекислого газа из специального газового баллона. После оксигенации перфузат проходит через пузырьковую ловушку, в которой любые захваченные пузырьки перенаправляются обратно в резервуар перистальтическим насосом. Оставшийся перфузат проходит через теплообменник и поступает в камеру органа, откуда возвращается в резервуар.
Здесь мы сообщаем о нашем опыте создания NEVLP для печени мышей и делимся многообещающими результатами пилотного эксперимента, проведенного с использованием оксигенированной среды без переносчиков кислорода.
Protocol
Representative Results
Discussion
Критические шаги в протоколе
Двумя важнейшими этапами эксплантации печени являются канюляция воротной вены (PV) и последующая канюляция желчного протока (BD). Эти шаги имеют первостепенное значение для обеспечения успешного извлечения органов и последующих процедур перфузии…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
На протяжении всего периода написания этой статьи я получал большую поддержку и помощь. Я особенно хотел бы поблагодарить моего товарища по команде Синьпэй Чена за его прекрасное сотрудничество и терпеливую поддержку во время моей операции.
Materials
| 0.5 ml Micro Tube PP | Sarstedt | 72699 | |
| 1 Fr Rubber Cannula | Vygon | Sample Cannula | |
| 10 µL Micro Syringe | Hamilton | 701N | |
| 2 Fr Rubber Cannula | Vygon | Sample Cannula | |
| 24 G Butterfly Cannula | Terumo | SR+OF2419 | |
| 26 G Butterfly Cannula | Terumo | SR+DU2619WX | |
| 30 G Hypodermic Needle | Sterican | 100246 | |
| 50 ml Syringe Pump | Braun | 110356 | |
| 6-0 Perma-Hand Seide | Ethicon | 639H | |
| Arterial Clip | Braun | BH014R | |
| Autoclavable Moist Chamber | Hugo Sachs Elektronik | 73-4733 | |
| Big Cotton Applicator | NOBA Verbandmittel Danz GmbH | 974018 | |
| Bubble Trap | Hugo-Sachs-Elektronik | V83163 | |
| Buprenovet (0.3 mg / ml) | Elanco | / | |
| CIDEX OPA solution (2 L) | Cilag GmbH | 20391 | |
| Electrosurgical Unit for Monopolar Cutting VIO® 50 C | ERBE | / | |
| Fetal Bovine Serum(500 ml) | Sigma-Aldrich | F7524-500ML | |
| Gas Mixture (95 % oxygen & 5 % carbon dioxide) | House Supply | / | |
| Heating Circulating Baths | Harvard-Apparatus | 75-0310 | |
| Heparin 5000 (I.E. /5 ml) | Braun | 1708.00.00 | |
| Hydrocortisone (100 mg / 2 ml) | Pfizer | 15427276 | |
| Insulin(100 IE / ml) | Sigma | I0516-5ML | |
| Iris Scissors | Fine Science Instruments | 15000-03 | |
| Isofluran (250 ml) | Cp-Pharma | 1214 | |
| Membrane Oxygenator | Hugo Sachs Elektronik | T18728 | |
| Microsurgery Microscope | Leica | M60 | |
| Mouse Retractor Set | Carfil Quality | 180000056 | |
| NanoZoomer 2.0 HT | Hamamatsu | / | |
| Non-Woven Sponges | Kompressen | 866110 | |
| Penicillin Streptomycin (1 mg / ml) | C.C.Pro | Z-13-M | |
| Perfusion Extension Tube (30 cm) | Braun | 4256000 | |
| Peristaltic Pump | Harvard-Apparatus | P-70 | |
| Petri Dishc 100×15 mm | VWR® | 391-0578 | |
| Povidon-Jod (Vet-Sep Spray) | Livisto | 799-416 | |
| Pressure Transducer Simulator | UTAH Medical Products | 650-950 | |
| Reusable Blood Pressure Transducers | AD Instruments | MLT-0380/D | |
| S & T Vessel Cannulation Forceps | Fine Science Instruments | 00608-11 | |
| Small Cotton Applicator | NOBA Verbandmittel Danz GmbH | 974116 | |
| Straight Forceps 10 cm | Fine Science Instruments | 00632-11 | |
| Suture Tying Forceps | Fine Science Instruments | 11063-07 | |
| Syringe 50ml Original Perfusor | Braun | 8728810F-06 | |
| UT – 03 Cannula | Unique Medical, Japan | / | |
| Vannas Spring Scissors | Fine Science Instruments | 15018-10 | |
| Veterinary Saline (500 ml) | WDT | 18X1807 | |
| Water Jacketed Reservoir 2 L | Harvard-Apparatus | 73-3441 | |
| William's E Medium (500 ML) | Thermofischer Scientific | A1217601 |
References
- Kwong, A. J., et al. OPTN/SRTR 2021 Annual data report: liver. American Journal of Transplantation. 23 (2), S178-S263 (2023).
- Linares, I., Hamar, M., Selzner, N., Selzner, M. Steatosis in Liver Transplantation: Current Limitations and Future Strategies. Transplantation. 103 (1), 78-90 (2019).
- Cheng, N., et al. Pharmacological activating transcription factor 6 activation is beneficial for liver retrieval with ex vivo normothermic mechanical perfusion from cardiac dead donor rats. Frontiers in Surgery. 8, 665260 (2021).
- Porte, R. J. Improved organ recovery after oxygen deprivation. Nature. 608 (7922), 273-274 (2022).
- Goumard, C., et al. Ex-Vivo Pharmacological Defatting of the Liver: A Review. Journal of Clinical Medicine. 10 (6), 1253 (2021).
- Mao, B., Yuan, W., Wu, F., Yan, Y., Wang, B. Autophagy in hepatic ischemia-reperfusion injury. Cell Death Discovery. 9 (1), 115 (2023).
- Hale, A. N., Ledbetter, D. J., Gawriluk, T. R., Rucker, E. B. Autophagy: regulation and role in development. Autophagy. 9 (7), 951-972 (2013).
- Tang, B., Bao, N., He, G., Wang, J. Long noncoding RNA HOTAIR regulates autophagy via the miR-20b-5p/ATG7 axis in hepatic ischemia/reperfusion injury. Gene. 686, 56-62 (2019).
- Kuma, A., Komatsu, M., Mizushima, N. Autophagy-monitoring and autophagy-deficient mice. Autophagy. 13 (10), 1619-1628 (2017).
- van der, V. a. l. k. . J. Fetal bovine serum-A cell culture dilemma. Science. 375 (6577), 143-144 (2022).
- Haque, O., et al. Twenty-four hour ex-vivo normothermic machine perfusion in rat livers. Technology (Singapore World Science). 8 (1-2), 27-36 (2020).
- Op den Dries, S., et al. Normothermic machine perfusion reduces bile duct injury and improves biliary epithelial function in rat donor livers. Liver Transplantation. 22 (7), 994-1005 (2016).
- Izamis, M. L., et al. Machine perfusion enhances hepatocyte isolation yields from ischemic livers. Cryobiology. 71 (2), 244-255 (2015).
- Gassner, J. M. G. V., et al. Improvement of normothermic ex vivo machine perfusion of rat liver grafts by dialysis and kupffer cell inhibition with glycine. Liver Transplantation. 25 (2), 275-287 (2019).
- Casado, J., et al. Rat splanchnic net oxygen consumption, energy implications. The Journal of Physiology. 431, 557-569 (1990).
- Tolboom, H., et al. A model for normothermic preservation of the rat liver. Tissue Engineering. 13 (8), 2143-2151 (2007).
- Yamada, S., et al. Effects of short-term normothermic and subnormothermic perfusion after cold preservation on liver transplantation from donors after cardiac death. Transplantation Proceedings. 52 (6), 1639-1642 (2020).
- Behrends, M., et al. Acute hyperglycemia worsens hepatic ischemia/reperfusion injury in rats. Journal of Gastrointestinal Surgery. 14 (3), 528-535 (2010).
- Tolboom, H., et al. Sequential cold storage and normothermic perfusion of the ischemic rat liver. Transplant Proceeding. 40 (5), 1306-1309 (2008).
- Daemen, M. J., et al. Liver blood flow measurement in the rat. The electromagnetic versus the microsphere and the clearance methods. Journal of Pharmacological Methods. 21 (4), 287-297 (1989).
- Koo, A., Liang, I. Y. Microvascular filling pattern in rat liver sinusoids during vagal stimulation. The Journal of physiology. 295, 191-199 (1979).
- Beal, E. W., et al. [D-Ala2, D-Leu5] Enkephalin improves liver preservation during normothermic ex vivo perfusion. Journal of Surgical Research. 241, 323-335 (2019).
- Birnie, J. H., Grayson, J. Observations on temperature distribution and liver blood flow in the rat. The Journal of Physiology. 116 (2), 189-201 (1952).
- Silitonga, M., Silitonga, P. M. Haematological profile of rats (Rattus norvegicus) induced BCG and provided leaf extract of Plectranthus amboinicus Lour Spreng). AIP Conference Proceedings. 1868, 090008090008 (2017).
- Jacob Filho, W., et al. Reference database of hematological parameters for growing and aging rats. Aging Male. 21 (2), 145-148 (2018).
- Tian, X., et al. Heme oxygenase-1-modified bone marrow mesenchymal stem cells combined with normothermic machine perfusion repairs bile duct injury in a rat model of DCD liver transplantation via activation of peribiliary glands through the Wnt pathway. Stem Cells International. 2021, 9935370 (2021).
- Yang, L., et al. Normothermic machine perfusion combined with bone marrow mesenchymal stem cells improves the oxidative stress response and mitochondrial function in rat donation after circulatory death livers. Stem Cells Development. 29 (13), 835-852 (2020).
- Wang, L., He, H. W., Zhou, X., Long, Y. Ursodeoxycholic Acid (UDCA) promotes lactate metabolism in mouse hepatocytes through cholic acid (CA) – farnesoid x receptor (FXR) pathway. Current Molecular Medicine. 20 (8), 661-666 (2020).
- Akateh, C., Beal, E. W., Whitson, B. A., Black, S. M. Normothermic ex-vivo liver perfusion and the clinical implications for liver transplantation. Journal of Clinical and Translational Hepatology. 6 (3), 276-282 (2018).
- Westerkamp, A. C., et al. Metformin preconditioning improves hepatobiliary function and reduces injury in a rat model of normothermic machine perfusion and orthotopic transplantation. Transplantation. 104 (9), e271-e280 (2020).
- Nösser, M., et al. Development of a rat liver machine perfusion system for normothermic and subnormothermic conditions. Tissue Engineering. Part A. 26 (1-2), 57-65 (2020).
- Yao, J., et al. Extracellular vesicles derived from human umbilical cord mesenchymal stem cells alleviate rat hepatic ischemia-reperfusion injury by suppressing oxidative stress and neutrophil inflammatory response. FASEB Journal. 33 (2), 1695-1710 (2019).
- Haque, O., et al. The effect of blood cells retained in rat livers during static cold storage on viability outcomes during normothermic machine perfusion. Scientific Reports. 11 (1), 23128 (2021).
- Gillooly, A. R., Perry, J., Martins, P. N. First report of siRNA uptake (for RNA interference) during ex vivo hypothermic and normothermic liver machine perfusion. Transplantation. 103 (3), e56-e57 (2019).
- Beal, E. W., et al. A small animal model of ex vivo normothermic liver perfusion. Journal of visualized experiments. (136), e57541 (2018).
- Claussen, F., et al. Dual versus single vessel normothermic ex vivo perfusion of rat liver grafts using metamizole for vasodilatation. PLoS One. 15 (7), (2020).
- Yang, L., et al. Bone marrow mesenchymal stem cells combine with normothermic machine perfusion to improve rat donor liver quality-the important role of hepatic microcirculation in donation after circulatory death. Cell and Tissue Research. 381 (2), 239-254 (2020).
- Wu, L., et al. Bone marrow mesenchymal stem cells modified with heme oxygenase-1 alleviate rejection of donation after circulatory death liver transplantation by inhibiting dendritic cell maturation in rats. International Immunopharmacology. 107, 108643 (2022).
- Lonati, C., et al. Quantitative Metabolomics of Tissue, Perfusate, and Bile from Rat Livers Subjected to Normothermic Machine Perfusion. Biomedicines. 10 (3), (2022).
- Oldani, G., et al. The impact of short-term machine perfusion on the risk of cancer recurrence after rat liver transplantation with donors after circulatory death. PLoS One. 14 (11), e0224890 (2019).
- Abraham, N., et al. Two compartment evaluation of liver grafts during acellular room temperature machine perfusion (acRTMP) in a rat liver transplant model. Frontiers in Medicine (Lausanne). 9, 804834 (2022).
- Scheuermann, U., et al. Sirtuin-1 expression and activity is diminished in aged liver grafts. Scientific Reports. 10 (1), 11860 (2020).
- Scheuermann, U., et al. Damage-associated molecular patterns induce inflammatory injury during machine preservation of the liver: potential targets to enhance a promising technology. Liver Transplantation. 25 (4), 610-626 (2019).
- Carnevale, M. E., et al. The novel N, N-bis-2-hydroxyethyl-2-aminoethanesulfonic acid-gluconate-polyethylene glycol-hypothermic machine perfusion solution improves static cold storage and reduces ischemia/reperfusion injury in rat liver transplant. Liver Transplantation. 25 (9), 1375-1386 (2019).
- Von, C., Horn, H., Zlatev, J., Pletz, B., Lüer, T., Minor, Comparison of thermal variations in post-retrieval graft conditioning on rat livers. Artificial Organs. 46 (2), 239-245 (2022).
- Tomizawa, M., et al. Oncostatin M in William’s E medium is suitable for initiation of hepatocyte differentiation in human induced pluripotent stem cells. Molecular Medicine Reports. 15 (5), 3088-3092 (2017).
- Dondossola, D., et al. Human red blood cells as oxygen carriers to improve ex-situ liver perfusion in a rat model. Journal of Clinical medicine. 8 (11), (2019).
- Jägers, J., Wrobeln, A., Ferenz, K. B. Perfluorocarbon-based oxygen carriers: from physics to physiology. European Journal of Physiology. 473 (2), 139-150 (2021).
- Jia, J., et al. A promising ex vivo liver protection strategy: machine perfusion and repair. Surgery and Nutrition. 8 (2), 142-143 (2019).
- Jennings, H., et al. The immunological effect of oxygen carriers on normothermic ex vivo liver perfusion. Frontiers in Immunology. 13, 833243 (2022).
- Kim, J. S., et al. Carbamazepine suppresses calpain-mediated autophagy impairment after ischemia/reperfusion in mouse livers. Toxicology and Applied Pharmacology. 273 (3), 600-610 (2013).
- Imber, C. J., et al. Advantages of normothermic perfusion over cold storage in liver preservation. Transplantation. 73 (5), 701-709 (2002).
- Tolboom, H., et al. Recovery of warm ischemic rat liver grafts by normothermic extracorporeal perfusion. Transplantation. 87 (2), 170-177 (2009).
- Rigo, F., Navarro-Tableros, V., De Stefano, N., Calleri, N., Romagnoli, A. Ex vivo normothermic hypoxic rat liver perfusion model: an experimental setting for organ recondition and pharmacological intervention. Methods in Molecular Biology. 2269, 139-150 (2021).
- van Dyk, J. C., Pieterse, G. M., van Vuren, J. H. Histological changes in the liver of Oreochromis mossambicus (Cichlidae) after exposure to cadmium and zinc. Ecotoxicology and Environmental Safety. 66 (3), 432-440 (2007).
