Perfusion hépatique Ex vivo Ex Vivo Normothermic chez la souris
Summary
Un système de perfusion hépatique ex vivo normothermique (NEVLP) a été créé pour les foies de souris. Ce système nécessite de l’expérience en microchirurgie mais permet des résultats de perfusion reproductibles. La capacité d’utiliser des foies de souris facilite l’étude des voies moléculaires pour identifier de nouveaux additifs perfusats et permet l’exécution d’expériences axées sur la réparation d’organes.
Abstract
Ce protocole présente un système NEVLP optimisé sans érythrocytes utilisant des foies de souris. La préservation ex vivo des foies de souris a été réalisée en utilisant des canules modifiées et des techniques adaptées de l’équipement de perfusion ex vivo commercial conventionnel. Le système a été utilisé pour évaluer les résultats de la préservation après 12 heures de perfusion. Les souris C57BL / 6J ont servi de donneurs de foie, et les foies ont été explantés en canulant la veine porte (PV) et le canal biliaire (BD), puis en rinçant l’organe avec une solution saline héparinée chaude (37 ° C). Ensuite, les foies explantés ont été transférés dans la chambre de perfusion et soumis à une perfusion machine oxygénée normotherme (NEVLP). Des échantillons de perfusat à l’entrée et à la sortie ont été prélevés à intervalles de 3 heures pour analyse du perfusat. À la fin de la perfusion, des échantillons de foie ont été obtenus pour analyse histologique, l’intégrité morphologique étant évaluée à l’aide de Suzuki-Score modifié par coloration à l’hématoxyline-éosine (HE). Les expériences d’optimisation ont donné les résultats suivants: (1) les souris pesant plus de 30 g ont été jugées plus appropriées pour l’expérience en raison de la plus grande taille de leur canal biliaire (BD). (2) une canule en polyuréthane de 2 Fr (diamètre extérieur = 0,66 mm) était mieux adaptée à la canulation de la veine porte (PV) qu’une canule en polypropylène. Cela a été attribué à l’adhérence accrue du matériau polyuréthane, ce qui a réduit le glissement du cathéter lors du transfert du corps à la chambre de l’organe. (3) pour la canulation des voies biliaires (BD), une canule en polyuréthane de 1 Fr (diamètre extérieur = 0,33 mm) s’est avérée plus efficace que la canule en polypropylène UT – 03 (diamètre extérieur = 0,30 mm). Avec ce protocole optimisé, les foies de souris ont été préservés avec succès pendant une durée de 12 h sans impact significatif sur la structure histologique. La coloration à l’hématoxyline-éosine (HE) a révélé une architecture morphologique bien préservée du foie, caractérisée par des hépatocytes principalement viables avec des noyaux clairement visibles et une légère dilatation des sinusoïdes hépatiques.
Introduction
La transplantation hépatique représente le traitement de référence pour les personnes atteintes d’une maladie hépatique terminale. Malheureusement, la demande de donneurs d’organes dépasse l’offre disponible, ce qui entraîne une pénurie importante. En 2021, environ 24 936 patients étaient sur la liste d’attente pour une greffe de foie, alors que seulement 9 234 greffes ont été réalisées avec succès1. La disparité importante entre l’offre et la demande de greffons hépatiques souligne la nécessité urgente d’étudier des stratégies alternatives pour élargir le bassin de donneurs et améliorer l’accessibilité des greffes de foie. Une façon d’élargir le bassin de donneurs est d’utiliser des donneurs marginaux2. Les donneurs marginaux comprennent ceux qui ont un âge avancé, une stéatose modérée ou sévère. Bien que la transplantation d’organes marginaux puisse donner des résultats favorables, les résultats globaux restent sous-optimaux. En conséquence, l’élaboration de stratégies thérapeutiques visant à renforcer la fonction des donneurs marginaux est actuellement en cours 3,4.
L’une des stratégies consiste à utiliser la perfusion machine, en particulier la perfusion machine oxygénée normotherme, pour améliorer la fonction de ces organes marginaux5. Cependant, il existe encore une compréhension limitée des mécanismes moléculaires qui sous-tendent les effets bénéfiques de la perfusion oxygénée normothermique (NEVLP). Les souris, avec leur disponibilité abondante de souches génétiquement modifiées, servent de modèles précieux pour étudier les voies moléculaires. Par exemple, l’importance des voies d’autophagie dans l’atténuation des lésions d’ischémie-reperfusion hépatique est de plus en plus reconnue 6,7. Une voie moléculaire importante dans la lésion d’ischémie-reperfusion hépatique est la voie miR-20b-5p/ATG78. Actuellement, il existe un certain nombre de souches de souris knock-out ATG et knock-out conditionnelles disponibles, mais aucune souche de ratcorrespondante 9.
Sur la base de ce contexte, l’objectif était de générer une plate-forme NEVLP miniaturisée pour les greffes de foie de souris. Cette plateforme faciliterait l’exploration et l’évaluation de stratégies potentielles génétiquement modifiées visant à améliorer la fonctionnalité du foie du donneur. De plus, il était essentiel que le système soit adapté à la perfusion à long terme, permettant le traitement ex vivo du foie, communément appelé « réparation d’organes ».
Compte tenu de la disponibilité limitée de données in vitro pertinentes sur la perfusion du foie de souris, la revue de la littérature s’est concentrée sur des études menées chez le rat. Une recherche systématique dans la littérature couvrant la période de 2010 à 2022 a été effectuée à l’aide de mots clés tels que « perfusion hépatique normothermique », « ex vivo ou in vitro » et « rats ». Cette recherche visait à identifier les conditions optimales chez les rongeurs, nous permettant de déterminer l’approche la plus appropriée.
Le système de perfusion se compose d’un réservoir tampon en verre scellé à chemise d’eau, d’une pompe à rouleaux péristaltiques, d’un oxygénateur, d’un piège à bulles, d’un échangeur de chaleur, d’une chambre d’orgue et d’un système fermé de tubes de cyclage (figure 1). Le système assure le maintien précis d’une température de perfusion constante de 37 °C à l’aide d’une machine thermostatique dédiée. La pompe à rouleaux péristaltiques entraîne le flux du perfusat dans tout le circuit. Le circuit de perfusion commence au niveau du réservoir isolé à chemise d’eau. Par la suite, le perfusat est dirigé à travers l’oxygénateur, qui reçoit un mélange gazeux de 95% d’oxygène et 5% de dioxyde de carbone provenant d’une bouteille de gaz dédiée. Après l’oxygénation, le perfusat passe à travers le piège à bulles, dans lequel toutes les bulles piégées sont redirigées vers le réservoir par la pompe péristaltique. Le perfusat restant s’écoule à travers l’échangeur de chaleur et pénètre dans la chambre de l’orgue, d’où il retourne au réservoir.
Ici, nous rapportons nos expériences d’établissement d’un NEVLP pour les foies de souris et partageons les résultats prometteurs d’une expérience pilote réalisée en utilisant le milieu oxygéné sans transporteurs d’oxygène.
Protocol
Representative Results
Discussion
Étapes critiques du protocole
Les deux étapes cruciales de l’explantation hépatique sont la canulation de la veine porte (PV) et la canulation subséquente du canal biliaire (BD). Ces étapes sont d’une importance capitale pour assurer le succès du prélèvement d’organes et des procédures ultérieures de perfusion ou de transplantation.
Défis et solutions
La canulation PV présente trois défis : une blessure de la paroi du vaisseau, le dép…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Tout au long de la rédaction de cet article, j’ai reçu beaucoup de soutien et d’aide. Je tiens particulièrement à remercier mon coéquipier XinPei Chen pour sa merveilleuse collaboration et son soutien patient pendant mon opération.
Materials
| 0.5 ml Micro Tube PP | Sarstedt | 72699 | |
| 1 Fr Rubber Cannula | Vygon | Sample Cannula | |
| 10 µL Micro Syringe | Hamilton | 701N | |
| 2 Fr Rubber Cannula | Vygon | Sample Cannula | |
| 24 G Butterfly Cannula | Terumo | SR+OF2419 | |
| 26 G Butterfly Cannula | Terumo | SR+DU2619WX | |
| 30 G Hypodermic Needle | Sterican | 100246 | |
| 50 ml Syringe Pump | Braun | 110356 | |
| 6-0 Perma-Hand Seide | Ethicon | 639H | |
| Arterial Clip | Braun | BH014R | |
| Autoclavable Moist Chamber | Hugo Sachs Elektronik | 73-4733 | |
| Big Cotton Applicator | NOBA Verbandmittel Danz GmbH | 974018 | |
| Bubble Trap | Hugo-Sachs-Elektronik | V83163 | |
| Buprenovet (0.3 mg / ml) | Elanco | / | |
| CIDEX OPA solution (2 L) | Cilag GmbH | 20391 | |
| Electrosurgical Unit for Monopolar Cutting VIO® 50 C | ERBE | / | |
| Fetal Bovine Serum(500 ml) | Sigma-Aldrich | F7524-500ML | |
| Gas Mixture (95 % oxygen & 5 % carbon dioxide) | House Supply | / | |
| Heating Circulating Baths | Harvard-Apparatus | 75-0310 | |
| Heparin 5000 (I.E. /5 ml) | Braun | 1708.00.00 | |
| Hydrocortisone (100 mg / 2 ml) | Pfizer | 15427276 | |
| Insulin(100 IE / ml) | Sigma | I0516-5ML | |
| Iris Scissors | Fine Science Instruments | 15000-03 | |
| Isofluran (250 ml) | Cp-Pharma | 1214 | |
| Membrane Oxygenator | Hugo Sachs Elektronik | T18728 | |
| Microsurgery Microscope | Leica | M60 | |
| Mouse Retractor Set | Carfil Quality | 180000056 | |
| NanoZoomer 2.0 HT | Hamamatsu | / | |
| Non-Woven Sponges | Kompressen | 866110 | |
| Penicillin Streptomycin (1 mg / ml) | C.C.Pro | Z-13-M | |
| Perfusion Extension Tube (30 cm) | Braun | 4256000 | |
| Peristaltic Pump | Harvard-Apparatus | P-70 | |
| Petri Dishc 100×15 mm | VWR® | 391-0578 | |
| Povidon-Jod (Vet-Sep Spray) | Livisto | 799-416 | |
| Pressure Transducer Simulator | UTAH Medical Products | 650-950 | |
| Reusable Blood Pressure Transducers | AD Instruments | MLT-0380/D | |
| S & T Vessel Cannulation Forceps | Fine Science Instruments | 00608-11 | |
| Small Cotton Applicator | NOBA Verbandmittel Danz GmbH | 974116 | |
| Straight Forceps 10 cm | Fine Science Instruments | 00632-11 | |
| Suture Tying Forceps | Fine Science Instruments | 11063-07 | |
| Syringe 50ml Original Perfusor | Braun | 8728810F-06 | |
| UT – 03 Cannula | Unique Medical, Japan | / | |
| Vannas Spring Scissors | Fine Science Instruments | 15018-10 | |
| Veterinary Saline (500 ml) | WDT | 18X1807 | |
| Water Jacketed Reservoir 2 L | Harvard-Apparatus | 73-3441 | |
| William's E Medium (500 ML) | Thermofischer Scientific | A1217601 |
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