为小鼠肝脏创建了常温 离体 肝灌注(NEVLP)系统。该系统需要显微外科手术经验,但允许可重复的灌注结果。利用小鼠肝脏的能力有助于研究分子途径以鉴定新型灌注添加剂,并能够执行专注于器官修复的实验。
该协议提出了使用小鼠肝脏的优化的无红细胞NEVLP系统。小鼠肝脏的 离 体保存是通过采用改良的插管和改编自传统商业 离体 灌注设备的技术来实现的。该系统用于评估灌注12 h后的保存结果。C57BL / 6J小鼠作为肝脏供体,通过插管门静脉(PV)和胆管(BD)排出肝脏,随后用温(37°C)肝素化盐水冲洗器官。然后,将移出的肝脏转移到灌注室并进行常温氧合机灌注(NEVLP)。每隔3小时收集入口和出口灌注液样品进行灌注分析。灌注完成后,获得肝脏样本进行组织学分析,并通过苏木精 – 伊红(HE)染色使用改良的铃木评分评估形态完整性。优化实验得出以下结果:(1)体重超过30g的小鼠由于其胆管(BD)的尺寸较大,被认为更适合实验。(2) 与聚丙烯插管相比,2 Fr(外径 = 0.66 mm)聚氨酯插管更适合插管门静脉 (PV)。这归因于聚氨酯材料增强了抓地力,从而减少了从身体转移到器官室过程中导管打滑。(3)对于胆管(BD)的插管,发现1Fr(外径= 0.33mm)聚氨酯套管比聚丙烯UT-03(外径= 0.30mm)套管更有效。通过这种优化的方案,小鼠肝脏成功保存了12小时,对组织学结构没有显着影响。苏木精-伊红 (HE) 染色显示肝脏形态结构保存完好,其特征是主要存活的肝细胞,具有清晰可见的细胞核和肝窦的轻度扩张。
肝移植是终末期肝病患者的金标准治疗。令人遗憾的是,对捐献器官的需求超过了现有供应,导致严重短缺。2021 年,约有 24,936 名患者在等待肝移植的名单上,而只有 9,234 例移植成功进行1。肝移植物供需之间的巨大差异凸显了研究替代策略以扩大供体库和提高肝移植物可及性的迫切需要。扩大捐助者库的一种方法是使用边际捐助者2.边缘捐赠者包括高龄、中度或重度脂肪变性的人。尽管边缘器官移植可能会产生有利的结果,但总体结果仍然不理想。因此,目前正在制定旨在增强边际捐赠者功能的治疗策略3,4。
其中一种策略是利用机器灌注,特别是常温氧合机灌注,来改善这些边缘器官的功能5。然而,对常温氧合机灌注(NEVLP)有益作用的分子机制仍然了解有限。小鼠具有丰富的转基因菌株,是研究分子途径的宝贵模型。例如,自噬途径在减轻肝缺血再灌注损伤中的重要性已得到越来越多的认可6,7。肝缺血再灌注损伤中一条重要的分子途径是 miR-20b-5p/ATG7 途径8。目前,有许多ATG敲除和条件敲除小鼠品系可用,但没有相应的大鼠品系9。
基于这一背景,目的是为小鼠肝脏移植物生成小型化的NEVLP平台。该平台将有助于探索和评估旨在改善供体肝脏功能的潜在转基因策略。此外,该系统必须适合长期灌注,使肝脏能够 离体 治疗,通常称为“器官修复”。
考虑到小鼠肝脏灌注的相关 体外 数据有限,文献综述侧重于在大鼠中进行的研究。使用“正常体温肝灌注”、“体外 或 体外”和“大鼠”等关键词对 2010 年至 2022 年的文献进行了系统检索。该搜索旨在确定啮齿动物的最佳条件,使我们能够确定最合适的方法。
灌注系统由密封的水套玻璃缓冲储液罐、蠕动辊泵、氧合器、气泡阱、热交换器、风琴室和封闭循环管系统组成(图 1)。该系统确保使用专用的恒温机器精确保持 37 °C 的恒定灌注温度。蠕动辊泵驱动灌注液在整个回路中的流动。灌注回路在绝缘水套储液罐处启动。随后,灌注液被引导通过氧合器,氧合器从专用气瓶中接收95%氧气和5%二氧化碳的气体混合物。充氧后,灌注液通过气泡阱,其中任何被困住的气泡都通过蠕动泵重定向回储液器。剩余的灌注液流经热交换器并进入器官室,从那里返回储液器。
在这里,我们报告了我们为小鼠肝脏建立NEVLP的经验,并分享了使用不含氧载体的含氧培养基进行的试点实验的有希望的结果。
协议中的关键步骤
肝植的两个关键步骤是门静脉插管(PV)和随后的胆管插管(BD)。这些步骤对于确保成功的器官取回和随后的灌注或移植程序至关重要。
挑战和解决方案
PV插管存在三个挑战:血管壁的损伤,导管的移位和插入过程的实用性。PV血管壁的脆弱性质使其在插管过程中不小心处理,容易被刺穿和随后的出血。此外,PV的任何失血都?…
The authors have nothing to disclose.
在撰写本文的整个过程中,我得到了大量的支持和帮助。我特别要感谢我的队友陈新培,感谢他在我手术过程中的出色合作和耐心支持。
0.5 ml Micro Tube PP | Sarstedt | 72699 | |
1 Fr Rubber Cannula | Vygon | Sample Cannula | |
10 µL Micro Syringe | Hamilton | 701N | |
2 Fr Rubber Cannula | Vygon | Sample Cannula | |
24 G Butterfly Cannula | Terumo | SR+OF2419 | |
26 G Butterfly Cannula | Terumo | SR+DU2619WX | |
30 G Hypodermic Needle | Sterican | 100246 | |
50 ml Syringe Pump | Braun | 110356 | |
6-0 Perma-Hand Seide | Ethicon | 639H | |
Arterial Clip | Braun | BH014R | |
Autoclavable Moist Chamber | Hugo Sachs Elektronik | 73-4733 | |
Big Cotton Applicator | NOBA Verbandmittel Danz GmbH | 974018 | |
Bubble Trap | Hugo-Sachs-Elektronik | V83163 | |
Buprenovet (0.3 mg / ml) | Elanco | / | |
CIDEX OPA solution (2 L) | Cilag GmbH | 20391 | |
Electrosurgical Unit for Monopolar Cutting VIO® 50 C | ERBE | / | |
Fetal Bovine Serum(500 ml) | Sigma-Aldrich | F7524-500ML | |
Gas Mixture (95 % oxygen & 5 % carbon dioxide) | House Supply | / | |
Heating Circulating Baths | Harvard-Apparatus | 75-0310 | |
Heparin 5000 (I.E. /5 ml) | Braun | 1708.00.00 | |
Hydrocortisone (100 mg / 2 ml) | Pfizer | 15427276 | |
Insulin(100 IE / ml) | Sigma | I0516-5ML | |
Iris Scissors | Fine Science Instruments | 15000-03 | |
Isofluran (250 ml) | Cp-Pharma | 1214 | |
Membrane Oxygenator | Hugo Sachs Elektronik | T18728 | |
Microsurgery Microscope | Leica | M60 | |
Mouse Retractor Set | Carfil Quality | 180000056 | |
NanoZoomer 2.0 HT | Hamamatsu | / | |
Non-Woven Sponges | Kompressen | 866110 | |
Penicillin Streptomycin (1 mg / ml) | C.C.Pro | Z-13-M | |
Perfusion Extension Tube (30 cm) | Braun | 4256000 | |
Peristaltic Pump | Harvard-Apparatus | P-70 | |
Petri Dishc 100×15 mm | VWR® | 391-0578 | |
Povidon-Jod (Vet-Sep Spray) | Livisto | 799-416 | |
Pressure Transducer Simulator | UTAH Medical Products | 650-950 | |
Reusable Blood Pressure Transducers | AD Instruments | MLT-0380/D | |
S & T Vessel Cannulation Forceps | Fine Science Instruments | 00608-11 | |
Small Cotton Applicator | NOBA Verbandmittel Danz GmbH | 974116 | |
Straight Forceps 10 cm | Fine Science Instruments | 00632-11 | |
Suture Tying Forceps | Fine Science Instruments | 11063-07 | |
Syringe 50ml Original Perfusor | Braun | 8728810F-06 | |
UT – 03 Cannula | Unique Medical, Japan | / | |
Vannas Spring Scissors | Fine Science Instruments | 15018-10 | |
Veterinary Saline (500 ml) | WDT | 18X1807 | |
Water Jacketed Reservoir 2 L | Harvard-Apparatus | 73-3441 | |
William's E Medium (500 ML) | Thermofischer Scientific | A1217601 |