माउस में नॉर्मोथर्मिक एक्स विवो लिवर मशीन छिड़काव
Summary
माउस लिवर के लिए एक नॉर्मोथर्मिक एक्स विवो लिवर परफ्यूजन (एनईवीएलपी) सिस्टम बनाया गया था। इस प्रणाली को माइक्रोसर्जरी में अनुभव की आवश्यकता होती है लेकिन प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य छिड़काव परिणामों की अनुमति देता है। माउस लिवर का उपयोग करने की क्षमता आणविक मार्गों की जांच की सुविधा प्रदान करती है ताकि नए पर्फ्यूसेट एडिटिव्स की पहचान की जा सके और अंग की मरम्मत पर केंद्रित प्रयोगों के निष्पादन को सक्षम बनाया जा सके।
Abstract
यह प्रोटोकॉल माउस लिवर का उपयोग करके एक अनुकूलित एरिथ्रोसाइट्स-मुक्त एनईवीएलपी प्रणाली प्रस्तुत करता है। माउस लिवर का पूर्व विवो संरक्षण संशोधित कैनुला और पारंपरिक वाणिज्यिक पूर्व विवो छिड़काव उपकरण से अनुकूलित तकनीकों को नियोजित करके हासिल किया गया था। छिड़काव के 12 घंटे के बाद संरक्षण परिणामों का मूल्यांकन करने के लिए सिस्टम का उपयोग किया गया था। सी 57बीएल / 6 जे चूहों ने यकृत दाताओं के रूप में कार्य किया, और यकृत को पोर्टल नस (पीवी) और पित्त नली (बीडी) को प्रवेशनी करके खोजा गया, और बाद में अंग को गर्म (37 डिग्री सेल्सियस) हेपरिनाइज्ड खारा के साथ फ्लश किया गया। फिर, खोज किए गए यकृत को छिड़काव कक्ष में स्थानांतरित कर दिया गया और नॉर्मोथर्मिक ऑक्सीजन युक्त मशीन छिड़काव (एनईवीएलपी) के अधीन किया गया। इनलेट और आउटलेट परफ्यूसेट नमूने 3 घंटे के अंतराल पर एकत्र किए गए थे ताकि पर्फ्यूसेट विश्लेषण किया जा सके। छिड़काव के पूरा होने पर, यकृत के नमूने हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण के लिए प्राप्त किए गए थे, जिसमें हेमटोक्सिलिन-ईओसिन (एचई) धुंधला होने के माध्यम से संशोधित सुजुकी-स्कोर का उपयोग करके रूपात्मक अखंडता का मूल्यांकन किया गया था। अनुकूलन प्रयोगों ने निम्नलिखित निष्कर्ष प्राप्त किए: (1) 30 ग्राम से अधिक वजन वाले चूहों को उनके पित्त नली (बीडी) के बड़े आकार के कारण प्रयोग के लिए अधिक उपयुक्त माना गया। (2) पॉलीप्रोपाइलीन कैनुला की तुलना में 2 एफआर (बाहरी व्यास = 0.66 मिमी) पॉलीयुरेथेन कैनुला पोर्टल नस (पीवी) को प्रवेशनी करने के लिए बेहतर अनुकूल था। यह पॉलीयुरेथेन सामग्री की बढ़ी हुई पकड़ के लिए जिम्मेदार ठहराया गया था, जिसके परिणामस्वरूप शरीर से अंग कक्ष में स्थानांतरण के दौरान कैथेटर फिसलन कम हो गई थी। (3) पित्त नली (बीडी) के प्रवेशनी के लिए, पॉलीप्रोपाइलीन यूटी – 03 (बाहरी व्यास = 0.30 मिमी) कैनुला की तुलना में 1 एफआर (बाहरी व्यास = 0.33 मिमी) पॉलीयुरेथेन कैनुला अधिक प्रभावी पाया गया। इस अनुकूलित प्रोटोकॉल के साथ, माउस लिवर को हिस्टोलॉजिकल संरचना पर महत्वपूर्ण प्रभाव के बिना 12 घंटे की अवधि के लिए सफलतापूर्वक संरक्षित किया गया था। हेमटोक्सीलिन-ईओसिन (एचई) धुंधला होने से यकृत की एक अच्छी तरह से संरक्षित रूपात्मक वास्तुकला का पता चला, जो स्पष्ट रूप से दिखाई देने वाले नाभिक और यकृत साइनसोइड के हल्के फैलाव के साथ मुख्य रूप से व्यवहार्य हेपेटोसाइट्स की विशेषता है।
Introduction
यकृत प्रत्यारोपण अंतिम चरण के यकृत रोग वाले व्यक्तियों के लिए स्वर्ण मानक उपचार का प्रतिनिधित्व करता है। अफसोस की बात है, दाता अंगों की मांग उपलब्ध आपूर्ति से अधिक है, जिससे एक महत्वपूर्ण कमी हो जाती है। 2021 में, लगभग 24,936 रोगी लिवर ग्राफ्ट के लिए प्रतीक्षा सूची में थे, जबकि केवल 9,234 प्रत्यारोपणसफलतापूर्वक किए गए थे। लिवर ग्राफ्ट की आपूर्ति और मांग के बीच महत्वपूर्ण असमानता दाता पूल को व्यापक बनाने और लिवर ग्राफ्ट की पहुंच बढ़ाने के लिए वैकल्पिक रणनीतियों की जांच करने की आवश्यकता पर प्रकाश डालती है। दाता पूल का विस्तार करने का एक तरीका सीमांत दाताओं का उपयोग करनाहै। सीमांत दाताओं में उन्नत आयु, मध्यम या गंभीर स्टीटोसिस वाले लोग शामिल हैं। यद्यपि सीमांत अंगों के प्रत्यारोपण से अनुकूल परिणाम मिल सकते हैं, लेकिन समग्र परिणाम उप-मानक बने हुए हैं। नतीजतन, सीमांत दाताओं के कार्य को बढ़ाने के उद्देश्य से चिकित्सीय रणनीतियों का विकास वर्तमान मेंचल रहा है।
रणनीतियों में से एक इन सीमांत अंगों के कार्य में सुधार करने के लिए मशीन छिड़काव, विशेष रूप से नॉर्मोथर्मिक ऑक्सीजन युक्त मशीन छिड़काव का उपयोग करनाहै। हालांकि, आणविक तंत्र की अभी भी सीमित समझ है जो नॉर्मोथर्मिक ऑक्सीजन युक्त मशीन छिड़काव (एनईवीएलपी) के लाभकारी प्रभावों को रेखांकित करती है। चूहे, आनुवंशिक रूप से संशोधित उपभेदों की प्रचुर मात्रा में उपलब्धता के साथ, आणविक मार्गों की जांच के लिए मूल्यवान मॉडल के रूप में काम करते हैं। उदाहरण के लिए, हेपेटिक इस्किमिया-रीपरफ्यूजन चोट को कम करने में ऑटोफैगी मार्गों के महत्व को तेजी से मान्यता दी गईहै। हेपेटिक इस्किमिया-रीपरफ्यूजन चोट में एक महत्वपूर्ण आणविक मार्ग एमआईआर -20 बी -5 पी / एटीजी 7 मार्ग8 है। वर्तमान में, कई एटीजी नॉकआउट और सशर्त नॉक-आउट माउस उपभेद उपलब्ध हैं लेकिन कोई संबंधित चूहे उपभेद9 नहीं हैं।
इस पृष्ठभूमि के आधार पर, इसका उद्देश्य माउस लिवर ग्राफ्ट के लिए एक छोटा एनईवीएलपी प्लेटफॉर्म तैयार करना था। यह मंच दाता के यकृत की कार्यक्षमता में सुधार के उद्देश्य से संभावित आनुवंशिक रूप से संशोधित रणनीतियों की खोज और मूल्यांकन की सुविधा प्रदान करेगा। इसके अतिरिक्त, सिस्टम के लिए दीर्घकालिक छिड़काव के लिए उपयुक्त होना आवश्यक था, जिससे यकृत के पूर्व विवो उपचार को सक्षम किया जा सके, जिसे आमतौर पर “अंग मरम्मत” कहा जाता है।
माउस लिवर छिड़काव पर प्रासंगिक इन विट्रो डेटा की सीमित उपलब्धता को ध्यान में रखते हुए, साहित्य समीक्षा ने चूहों में किए गए अध्ययनों पर ध्यान केंद्रित किया। 2010 से 2022 तक फैले साहित्य की एक व्यवस्थित खोज “नॉर्मोथर्मिक लिवर छिड़काव,” “एक्स विवो या इन विट्रो“, और “चूहों” जैसे कीवर्ड का उपयोग करके की गई थी। इस खोज का उद्देश्य कृन्तकों में इष्टतम स्थितियों की पहचान करना था, जिससे हमें सबसे उपयुक्त दृष्टिकोण निर्धारित करने की अनुमति मिलती है।
छिड़काव प्रणाली में एक सील पानी-जैकेट ग्लास बफर जलाशय, एक पेरिस्टालिक रोलर पंप, एक ऑक्सीजनेटर, एक बुलबुला जाल, एक हीट एक्सचेंजर, एक अंग कक्ष और एक बंद साइक्लिंग ट्यूबिंग सिस्टम होता है (चित्रा 1)। सिस्टम एक समर्पित थर्मो-स्टेटिक मशीन का उपयोग करके 37 डिग्री सेल्सियस के निरंतर छिड़काव तापमान का सटीक रखरखाव सुनिश्चित करता है। पेरिस्टालिक रोलर पंप पूरे सर्किट में परफ्यूसेट के प्रवाह को चलाता है। छिड़काव सर्किट इंसुलेटेड वाटर-जैकेट जलाशय में शुरू होता है। इसके बाद, परफ्यूसेट को ऑक्सीजनेटर के माध्यम से निर्देशित किया जाता है, जो एक समर्पित गैस बोतल से 95% ऑक्सीजन और 5% कार्बन डाइऑक्साइड का गैस मिश्रण प्राप्त करता है। ऑक्सीकरण के बाद, परफ्यूसेट बुलबुले जाल से गुजरता है, जिसमें किसी भी फंसे बुलबुले को पेरिस्टालिक पंप द्वारा जलाशय में वापस निर्देशित किया जाता है। शेष पर्फ्यूसेट हीट एक्सचेंजर के माध्यम से बहता है और अंग कक्ष में प्रवेश करता है, जहां से यह जलाशय में लौटता है।
यहां, हम माउस लिवर के लिए एनईवीएलपी स्थापित करने के अपने अनुभवों की रिपोर्ट करते हैं और ऑक्सीजन वाहक के बिना ऑक्सीजन युक्त माध्यम का उपयोग करके किए गए पायलट प्रयोग के आशाजनक परिणामों को साझा करते हैं।
Protocol
Representative Results
Discussion
प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण कदम
लिवर एक्सप्लांटेशन में दो महत्वपूर्ण कदम पोर्टल नस (पीवी) का कैनुलाशन और पित्त नली (बीडी) के बाद के प्रवेशनी हैं। सफल अंग पुनर्प्राप्ति और बाद में छिड़काव या प्रत्?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस पत्र के लेखन के दौरान, मुझे बहुत समर्थन और सहायता मिली है। मैं विशेष रूप से अपने टीम के साथी शिनपेई चेन को मेरे ऑपरेशन के दौरान उनके अद्भुत सहयोग और रोगी समर्थन के लिए स्वीकार करना चाहता हूं।
Materials
| 0.5 ml Micro Tube PP | Sarstedt | 72699 | |
| 1 Fr Rubber Cannula | Vygon | Sample Cannula | |
| 10 µL Micro Syringe | Hamilton | 701N | |
| 2 Fr Rubber Cannula | Vygon | Sample Cannula | |
| 24 G Butterfly Cannula | Terumo | SR+OF2419 | |
| 26 G Butterfly Cannula | Terumo | SR+DU2619WX | |
| 30 G Hypodermic Needle | Sterican | 100246 | |
| 50 ml Syringe Pump | Braun | 110356 | |
| 6-0 Perma-Hand Seide | Ethicon | 639H | |
| Arterial Clip | Braun | BH014R | |
| Autoclavable Moist Chamber | Hugo Sachs Elektronik | 73-4733 | |
| Big Cotton Applicator | NOBA Verbandmittel Danz GmbH | 974018 | |
| Bubble Trap | Hugo-Sachs-Elektronik | V83163 | |
| Buprenovet (0.3 mg / ml) | Elanco | / | |
| CIDEX OPA solution (2 L) | Cilag GmbH | 20391 | |
| Electrosurgical Unit for Monopolar Cutting VIO® 50 C | ERBE | / | |
| Fetal Bovine Serum(500 ml) | Sigma-Aldrich | F7524-500ML | |
| Gas Mixture (95 % oxygen & 5 % carbon dioxide) | House Supply | / | |
| Heating Circulating Baths | Harvard-Apparatus | 75-0310 | |
| Heparin 5000 (I.E. /5 ml) | Braun | 1708.00.00 | |
| Hydrocortisone (100 mg / 2 ml) | Pfizer | 15427276 | |
| Insulin(100 IE / ml) | Sigma | I0516-5ML | |
| Iris Scissors | Fine Science Instruments | 15000-03 | |
| Isofluran (250 ml) | Cp-Pharma | 1214 | |
| Membrane Oxygenator | Hugo Sachs Elektronik | T18728 | |
| Microsurgery Microscope | Leica | M60 | |
| Mouse Retractor Set | Carfil Quality | 180000056 | |
| NanoZoomer 2.0 HT | Hamamatsu | / | |
| Non-Woven Sponges | Kompressen | 866110 | |
| Penicillin Streptomycin (1 mg / ml) | C.C.Pro | Z-13-M | |
| Perfusion Extension Tube (30 cm) | Braun | 4256000 | |
| Peristaltic Pump | Harvard-Apparatus | P-70 | |
| Petri Dishc 100×15 mm | VWR® | 391-0578 | |
| Povidon-Jod (Vet-Sep Spray) | Livisto | 799-416 | |
| Pressure Transducer Simulator | UTAH Medical Products | 650-950 | |
| Reusable Blood Pressure Transducers | AD Instruments | MLT-0380/D | |
| S & T Vessel Cannulation Forceps | Fine Science Instruments | 00608-11 | |
| Small Cotton Applicator | NOBA Verbandmittel Danz GmbH | 974116 | |
| Straight Forceps 10 cm | Fine Science Instruments | 00632-11 | |
| Suture Tying Forceps | Fine Science Instruments | 11063-07 | |
| Syringe 50ml Original Perfusor | Braun | 8728810F-06 | |
| UT – 03 Cannula | Unique Medical, Japan | / | |
| Vannas Spring Scissors | Fine Science Instruments | 15018-10 | |
| Veterinary Saline (500 ml) | WDT | 18X1807 | |
| Water Jacketed Reservoir 2 L | Harvard-Apparatus | 73-3441 | |
| William's E Medium (500 ML) | Thermofischer Scientific | A1217601 |
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