Et normoterm ex vivo leverperfusjonssystem (NEVLP) ble opprettet for muselever. Dette systemet krever erfaring innen mikrokirurgi, men gir mulighet for reproduserbare perfusjonsresultater. Evnen til å bruke muselever letter undersøkelsen av molekylære veier for å identifisere nye perfusatadditiver og muliggjør utførelse av eksperimenter fokusert på organreparasjon.
Denne protokollen presenterer et optimalisert erytrocyttfritt NEVLP-system ved hjelp av muselever. Ex vivo bevaring av muselever ble oppnådd ved å bruke modifiserte kanyler og teknikker tilpasset konvensjonelt kommersielt ex vivo perfusjonsutstyr. Systemet ble brukt til å evaluere bevaringsresultatene etter 12 timers perfusjon. C57BL/6J-mus fungerte som leverdonorer, og leveren ble eksplantet ved kanylering av portvenen (PV) og gallegangen (BD), og deretter skylling av organet med varmt (37 °C) heparinisert saltvann. Deretter ble de eksplanterte leverene overført til perfusjonskammeret og utsatt for normoterm oksygenert maskinperfusjon (NEVLP). Innløps- og utløpsperfusatprøver ble samlet med 3 timers intervaller for perfusatanalyse. Etter fullført perfusjon ble leverprøver tatt for histologisk analyse, med morfologisk integritet vurdert ved hjelp av modifisert Suzuki-Score gjennom Hematoksylin-Eosin (HE) farging. Optimaliseringsforsøkene ga følgende funn: (1) mus som veide over 30 g ble ansett som mer egnet for forsøket på grunn av den større størrelsen på gallekanalen (BD). (2) en 2 Fr (ytre diameter = 0,66 mm) polyuretankanyle var bedre egnet til kanylering av portvenen (PV) sammenlignet med en polypropylenkanyle. Dette ble tilskrevet polyuretanmaterialets forbedrede grep, noe som resulterte i redusert kateterglidning under overføringen fra kroppen til organkammeret. (3) for kanylering av gallegangen (BD) ble en 1 Fr (ytre diameter = 0,33 mm) polyuretankanyle funnet å være mer effektiv sammenlignet med polypropylen UT – 03 (ytre diameter = 0,30 mm) kanyle. Med denne optimaliserte protokollen ble muselever bevart i en varighet på 12 timer uten signifikant innvirkning på den histologiske strukturen. Farging av hematoksylin-eosin (HE) avslørte en godt bevart morfologisk arkitektur i leveren, karakterisert ved overveiende levedyktige hepatocytter med tydelig synlige kjerner og mild utvidelse av leversinusoider.
Levertransplantasjon representerer gullstandardbehandlingen for personer med leversykdom i sluttstadiet. Dessverre overgår etterspørselen etter donororganer det tilgjengelige tilbudet, noe som fører til en betydelig mangel. I 2021 sto ca. 24 936 pasienter på venteliste for levertransplantasjon, mens kun 9 234 transplantasjoner ble utført1. Den betydelige forskjellen mellom tilbud og etterspørsel av levertransplantater fremhever den presserende nødvendigheten av å undersøke alternative strategier for å utvide donorbassenget og forbedre tilgjengeligheten av levertransplantater. En måte å utvide donorpoolen på er å bruke marginale donorer2. Marginale givere inkluderer de med avansert alder, moderat eller alvorlig steatose. Selv om transplantasjon av marginale organer kan gi gunstige resultater, forblir de samlede resultatene suboptimale. Som et resultat er utviklingen av terapeutiske strategier rettet mot å styrke funksjonen til marginale donorer for tiden i gang 3,4.
En av strategiene er å bruke maskinperfusjon, spesielt normoterm oksygenert maskinperfusjon, for å forbedre funksjonen til disse marginale organene5. Imidlertid er det fortsatt en begrenset forståelse av de molekylære mekanismene som ligger til grunn for de gunstige effektene av normoterm oksygenert maskinperfusjon (NEVLP). Mus, med sin rikelig tilgjengelighet av genetisk modifiserte stammer, tjener som verdifulle modeller for å undersøke molekylære veier. For eksempel har betydningen av autofagibaner for å redusere leveriskemi-reperfusjonsskade blitt stadig mer anerkjent 6,7. En viktig molekylær vei i leveriskemi-reperfusjonsskade er miR-20b-5p / ATG7-banen8. For tiden er det en rekke ATG knockout og betingede knock-out musestammer tilgjengelig, men ingen tilsvarende rottestammer9.
Basert på denne bakgrunnen var målet å generere en miniatyrisert NEVLP-plattform for muselevertransplantater. Denne plattformen vil legge til rette for utforskning og evaluering av potensielle genmodifiserte strategier for å forbedre funksjonaliteten til donorens lever. I tillegg var det viktig at systemet var egnet for langvarig perfusjon, noe som muliggjorde ex vivo-behandling av leveren, ofte referert til som “organreparasjon”.
Tatt i betraktning den begrensede tilgjengeligheten av relevante in vitro-data om perfusjon hos mus, fokuserte litteraturgjennomgangen på studier utført på rotter. Et systematisk litteratursøk fra 2010 til 2022 ble utført med søkeord som «normoterm leverperfusjon», «ex vivo eller in vitro» og «rotter». Dette søket hadde som mål å identifisere optimale forhold hos gnagere, slik at vi kunne bestemme den mest hensiktsmessige tilnærmingen.
Perfusjonssystemet består av et forseglet vannkappet glassbufferreservoar, en peristaltisk rullepumpe, en oksygenator, en boblefelle, en varmeveksler, et orgelkammer og et lukket sykkelslangesystem (figur 1). Systemet sikrer presist vedlikehold av en konstant perfusjonstemperatur på 37 °C ved hjelp av en dedikert termostatmaskin. Den peristaltiske rullepumpen driver strømmen av perfusatet gjennom hele kretsløpet. Perfusjonskretsen starter ved det isolerte vannkappede reservoaret. Deretter ledes perfusatet gjennom oksygenatoren, som mottar en gassblanding av 95% oksygen og 5% karbondioksid fra en dedikert gassflaske. Etter oksygenering passerer perfusatet gjennom boblefellen, hvor eventuelle innesluttede bobler blir omdirigert tilbake til reservoaret av den peristaltiske pumpen. Det gjenværende perfusatet strømmer gjennom varmeveksleren og kommer inn i orgelkammeret, hvorfra det vender tilbake til reservoaret.
Her rapporterer vi våre erfaringer med å etablere en NEVLP for muselever og deler de lovende resultatene av et piloteksperiment utført ved bruk av det oksygenerte mediet uten oksygenbærere.
Kritiske trinn i protokollen
De to avgjørende trinnene i levereksplantasjon er kanylering av portalvenen (PV) og den påfølgende kanylering av gallekanalen (BD). Disse trinnene er av avgjørende betydning for å sikre vellykket organuthenting og påfølgende perfusjons- eller transplantasjonsprosedyrer.
Utfordringer og løsninger
PV-kanylering gir tre utfordringer: skade på karveggen, forskyvning av kateteret og gjennomførbarhet av innføringsprosess…
The authors have nothing to disclose.
Gjennom skrivingen av denne artikkelen har jeg fått mye støtte og hjelp. Jeg vil spesielt takke min lagkamerat XinPei Chen for hans fantastiske samarbeid og tålmodige støtte under operasjonen.
0.5 ml Micro Tube PP | Sarstedt | 72699 | |
1 Fr Rubber Cannula | Vygon | Sample Cannula | |
10 µL Micro Syringe | Hamilton | 701N | |
2 Fr Rubber Cannula | Vygon | Sample Cannula | |
24 G Butterfly Cannula | Terumo | SR+OF2419 | |
26 G Butterfly Cannula | Terumo | SR+DU2619WX | |
30 G Hypodermic Needle | Sterican | 100246 | |
50 ml Syringe Pump | Braun | 110356 | |
6-0 Perma-Hand Seide | Ethicon | 639H | |
Arterial Clip | Braun | BH014R | |
Autoclavable Moist Chamber | Hugo Sachs Elektronik | 73-4733 | |
Big Cotton Applicator | NOBA Verbandmittel Danz GmbH | 974018 | |
Bubble Trap | Hugo-Sachs-Elektronik | V83163 | |
Buprenovet (0.3 mg / ml) | Elanco | / | |
CIDEX OPA solution (2 L) | Cilag GmbH | 20391 | |
Electrosurgical Unit for Monopolar Cutting VIO® 50 C | ERBE | / | |
Fetal Bovine Serum(500 ml) | Sigma-Aldrich | F7524-500ML | |
Gas Mixture (95 % oxygen & 5 % carbon dioxide) | House Supply | / | |
Heating Circulating Baths | Harvard-Apparatus | 75-0310 | |
Heparin 5000 (I.E. /5 ml) | Braun | 1708.00.00 | |
Hydrocortisone (100 mg / 2 ml) | Pfizer | 15427276 | |
Insulin(100 IE / ml) | Sigma | I0516-5ML | |
Iris Scissors | Fine Science Instruments | 15000-03 | |
Isofluran (250 ml) | Cp-Pharma | 1214 | |
Membrane Oxygenator | Hugo Sachs Elektronik | T18728 | |
Microsurgery Microscope | Leica | M60 | |
Mouse Retractor Set | Carfil Quality | 180000056 | |
NanoZoomer 2.0 HT | Hamamatsu | / | |
Non-Woven Sponges | Kompressen | 866110 | |
Penicillin Streptomycin (1 mg / ml) | C.C.Pro | Z-13-M | |
Perfusion Extension Tube (30 cm) | Braun | 4256000 | |
Peristaltic Pump | Harvard-Apparatus | P-70 | |
Petri Dishc 100×15 mm | VWR® | 391-0578 | |
Povidon-Jod (Vet-Sep Spray) | Livisto | 799-416 | |
Pressure Transducer Simulator | UTAH Medical Products | 650-950 | |
Reusable Blood Pressure Transducers | AD Instruments | MLT-0380/D | |
S & T Vessel Cannulation Forceps | Fine Science Instruments | 00608-11 | |
Small Cotton Applicator | NOBA Verbandmittel Danz GmbH | 974116 | |
Straight Forceps 10 cm | Fine Science Instruments | 00632-11 | |
Suture Tying Forceps | Fine Science Instruments | 11063-07 | |
Syringe 50ml Original Perfusor | Braun | 8728810F-06 | |
UT – 03 Cannula | Unique Medical, Japan | / | |
Vannas Spring Scissors | Fine Science Instruments | 15018-10 | |
Veterinary Saline (500 ml) | WDT | 18X1807 | |
Water Jacketed Reservoir 2 L | Harvard-Apparatus | 73-3441 | |
William's E Medium (500 ML) | Thermofischer Scientific | A1217601 |