तुलनीय क्षमता के साथ चूहे अस्थि मज्जा न्यूट्रोफिल को अलग करने के लिए अद्वितीय दृष्टिकोण
Summary
यह शोध चूहे अस्थि मज्जा से प्रचुर मात्रा में न्यूट्रोफिल बाह्य जाल (एनईटीएस) को अलग करने के लिए दो तकनीकों की रूपरेखा तैयार करता है। एक विधि घनत्व ढाल सेंट्रीफ्यूजेशन के साथ एक वाणिज्यिक न्यूट्रोफिल अलगाव किट को जोड़ती है, जबकि दूसरी केवल घनत्व ढाल सेंट्रीफ्यूजेशन को नियोजित करती है। दोनों दृष्टिकोण परिधीय रक्त न्यूट्रोफिल से उन लोगों को पार करते हुए कार्यात्मक एनईटीएस उत्पन्न करते हैं।
Abstract
इस शोध का प्राथमिक उद्देश्य चूहे अस्थि मज्जा से न्यूट्रोफिल बाह्य जाल (नेट) को अलग करने के लिए एक विश्वसनीय और कुशल दृष्टिकोण विकसित करना था। यह प्रयास परिधीय रक्त से एनईटीएस निकालने की पारंपरिक विधि से जुड़ी सीमाओं के कारण उत्पन्न हुआ, मुख्य रूप से अलगाव के लिए उपलब्ध न्यूट्रोफिल की कमी के कारण। अध्ययन में अस्थि मज्जा से चूहे न्यूट्रोफिल प्राप्त करने के लिए दो अलग-अलग तरीकों का पता चला: एक सुव्यवस्थित एक-चरण प्रक्रिया जो संतोषजनक शुद्धि स्तर प्राप्त करती है, और एक अधिक समय-गहन दो-चरण प्रक्रिया जो बढ़ी हुई शुद्धि दक्षता का प्रदर्शन करती है। महत्वपूर्ण रूप से, दोनों तकनीकों ने पर्याप्त मात्रा में व्यवहार्य न्यूट्रोफिल प्राप्त किए, जो प्रति चूहे 50 से 100 मिलियन के बीच थे। इस दक्षता ने मानव और मूत्र दोनों स्रोतों से न्यूट्रोफिल को अलग करने से प्राप्त परिणामों को प्रतिबिंबित किया। गौरतलब है कि चूहे के अस्थि मज्जा से प्राप्त न्यूट्रोफिल ने परिधीय रक्त से प्राप्त न्यूट्रोफिल की तुलना में एनईटी को छिड़कने के लिए तुलनीय क्षमताओं का प्रदर्शन किया। हालांकि, अस्थि मज्जा-आधारित विधि ने लगातार न्यूट्रोफिल और एनईटीएस दोनों की विशेष रूप से बड़ी मात्रा का उत्पादन किया। इस दृष्टिकोण ने आगे डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों के लिए इन सेलुलर घटकों की काफी अधिक मात्रा प्राप्त करने की क्षमता का प्रदर्शन किया। विशेष रूप से, ये पृथक एनईटी और न्यूट्रोफिल सूजन, संक्रमण और ऑटोइम्यून बीमारियों के दायरे में फैले अनुप्रयोगों की एक श्रृंखला के लिए वादा करते हैं।
Introduction
न्यूट्रोफिल ल्यूकोसाइट्स का एक महत्वपूर्ण उपसमूह है जो जन्मजात प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। उन्हें मल्टीलोबेड नाभिक और कणिकाओं की विशेषता है जिसमें विभिन्न प्रोटीज और रोगाणुरोधी पेप्टाइड्सहोते हैं 1. न्यूट्रोफिल मुख्य रूप से क्षरण, फागोसाइटोसिस और एनईटीएस के गठन के माध्यम से कार्य करते हैं। एनईटीएस का अवलोकन पहली बार टेकी एट अल द्वारा 1996 में एक प्रयोग के दौरान किया गया था जहां न्यूट्रोफिल को फोरबोल माइरिस्टेट एसीटेट (पीएमए)2के साथ उत्तेजित किया गया था। इसके बाद, नेट गठन की प्रक्रिया को 2004 में ब्रिंकमैन एट अल.3 द्वारा “नेटोसिस” गढ़ा गया था। उनके शोध ने न्यूट्रोफिल-मध्यस्थता रोगाणुरोधी प्रतिक्रियाओं में एनईटीएस की महत्वपूर्ण भूमिका को और उजागर किया। एनईटीएस क्रोमैटिन, हिस्टोन और रोगाणुरोधी प्रोटीन से बनी वेब जैसी संरचनाएं हैं जो संक्रामक और भड़काऊ उत्तेजनाओं के जवाब में सक्रिय न्यूट्रोफिल से जारी की जाती हैं। नेट उन्हें फंसाने और रोगाणुरोधी पेप्टाइड्स और प्रोटीज 1,3 की एक उच्च एकाग्रता के लिए उन्हें उजागर करके हमलावर रोगजनकों को स्थिर और मार सकते हैं। इसके अतिरिक्त, एनईटीएस एपोप्टोटिक कोशिकाओं की निकासी में योगदान करते हैं और सूजन संकल्प में भाग लेते हैं। हाल के अध्ययनों से यह भी संकेत मिलता है कि एनईटीएस या बिगड़ा हुआ शुद्ध गिरावट का अत्यधिक गठन ऊतक क्षति, ऑटोइम्यून विकार, थ्रोम्बोजेनेसिस, और बिगड़ा हुआ पुनरोद्धार 4,5,6,7,8,9,10 का कारण बन सकता है।
रोधगलन और वेंट्रिकुलर धमनीविस्फार के गठन के बाद अनियंत्रित फाइब्रोसिस में एनईटीएस की रोगजनक भूमिका पेरिवस्कुलर फाइब्रोसिस 4,11 के विस्तार के माध्यम से प्रदर्शित किया गया है। मायोकार्डियल रोधगलन मॉडल और चूहों में अस्थि मज्जा से न्यूट्रोफिल का अलगाव दोनों अच्छी तरह से स्थापित हैं। पॉलीमोर्फोन्यूक्लियर (पीएमएन) ल्यूकोसाइट्स, मानव रक्त में प्रचुर मात्रा में सफेद रक्त कोशिका का एक प्रकार, मानव न्यूट्रोफिल को अलग करने के लिए एक उत्कृष्ट स्रोत के रूप में काम करता है। यह विधि अस्थि मज्जा की कटाई की आवश्यकता को समाप्त करती है, इस प्रकार सुरक्षा और दक्षता को बढ़ाती है।
एनईटीएस कार्डियक रीमॉडेलिंग से जुड़े एट्रियल फाइब्रिलेशन में भी भूमिका निभाते हैं। हालांकि, कुत्तों और सूअरों जैसे बड़े जानवरों को एट्रियल फाइब्रिलेशन मॉडल करने के लिए उपयोग किया गया था, क्योंकि चूहों में एक पुन: प्रवेशी चक्र या वायुसेना मॉडल स्थापित करने के लिए पर्याप्त एट्रियम की कमी होती है, जब तक कि विशिष्ट आयन चैनल या सिग्नलिंग रास्ते नीचे खटखटाए नहीं जाते हैं या12 को खटखटाया जाता है। हालांकि चूहों में एट्रियल फाइब्रिलेशन को प्रेरित करना और चूहे के परिधीय रक्त से न्यूट्रोफिल को अलग करना संभव है, जैसा कि पहले वर्णित है, शोधकर्ताओं को एक सीमा का सामना करना पड़ा जिससे केवल 2 x 105-5 x10 5 न्यूट्रोफिल को परिधीय रक्त (10 एमएल प्रति चूहा) से अलग किया जा सकता है। प्रत्येक समय बिंदु पर पर्याप्त नेट निकालने के लिए लगभग 10-25 चूहों (कुल में 5 x 106 न्यूट्रोफिल ) की आवश्यकता होती है, जिसके परिणामस्वरूप समय लेने वाली, महंगी और अक्सर कम उपज प्रक्रिया13 होती है। इस संबंध में, ली हे और सहयोगियों चूहों14 से पर्याप्त नेट प्राप्त करने के लिए एक अस्थि मज्जा उन्मुख रणनीति पेश करते हैं. अपने लेख में, वे चूहे अस्थि मज्जा से न्यूट्रोफिल को अलग करने का व्यापक विवरण प्रदान करते हैं और चूहे परिधीय और अस्थि मज्जा न्यूट्रोफिल की नेट स्राव क्षमताओं की तुलना करते हैं। उल्लिखित दो विधियां अलग-अलग प्रयोगात्मक लक्ष्यों को पूरा करती हैं, दोनों के परिणामस्वरूप आवश्यक चूहों की संख्या को कम करते हुए चूहे अस्थि मज्जा न्यूट्रोफिल की पर्याप्त मात्रा होती है। दो-चरणीय अलगाव विधि ने बेहतर न्यूट्रोफिल शुद्धि का प्रदर्शन किया, जबकि एक-चरणीय विधि स्वीकार्य शुद्धि स्तरों के साथ समय-कुशल साबित हुई। इसके अलावा, शोधकर्ताओं ने चूहे अस्थि मज्जा न्यूट्रोफिल और उनके परिधीय समकक्षों के बीच नेटोसिस और नेट गठन की तुलना की, पीएमएन के साथ समान शक्ति पाई। ये निष्कर्ष एट्रियल फाइब्रिलेशन के न्यूट्रोफिल से संबंधित अध्ययनों में महत्वपूर्ण योगदान देते हैं और अलग-अलग न्यूट्रोफिल वितरण के साथ विभिन्न प्रयोगात्मक जानवरों में न्यूट्रोफिल अलगाव के लिए लचीले ढंग से विभिन्न स्रोतों का चयन करने के महत्व को रेखांकित करते हैं।
Protocol
Representative Results
Discussion
न्यूट्रोफिल का अलगाव नेटोसिस का अध्ययन करने में एक महत्वपूर्ण कदम है, जहां भरोसेमंद परिणाम प्राप्त करने के लिए एक उपयुक्त अलगाव विधि का चयन सर्वोपरि है। वजन करने के लिए एक महत्वपूर्ण कारक अलगाव के दौर…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
अनुदान: यह काम चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (संख्या 82004154, 81900311, 82100336 और 81970345) द्वारा समर्थित किया गया था।
Materials
| A488-conjugated donkey antirabbit IgG(H + L) | Invitrogen, USA | A32790 | |
| A594-conjugated donkey anti-mouse IgG(H + L) | Invitrogen, USA | A32744 | |
| A594-conjugated goat anti-Mouse IgG1 | Invitrogen, USA | A21125 | |
| Anti-rat myeloperoxidase | Abcam, England | ab134132 | |
| Anti-rat neutrophil elastase | Abcam, England | ab21595 | |
| Celigo Image Cytometer | Nexelom, USA | 200-BFFL-5C | |
| DNase I | Sigma, USA | 10104159001 | |
| fetal bovine serum (FBS) | Gibco, USA | 10099141C | |
| Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco, USA | C14175500BT | |
| Hoechst | Thermofisher, USA | 33342 | |
| Isoflurane | RWD, China | R510-22-10 | |
| Mowiol | Sigma, USA | 81381 | |
| Normal Donkey Serum | Solarbio, China | SL050 | |
| Paraformaldehyde | biosharp, China | BL539A | |
| Penicillin-streptomycin | Hyclone, USA | SV30010 | |
| Percoll | GE, USA | P8370-1L | |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Sigma, USA | P1585 | |
| Picogreen dsDNA Assay Kit | Invitrogen, USA | P11496 | |
| Rat neutrophil isolation kit | Solarbio, China | P9200 | |
| Red blood cell lysis buffer | Solarbio, China | R1010 | |
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI) media | Hyclone, USA | SH30809.01B | |
| RWD Universal Animal Anesthesia Machine | RWD, China | R500 | |
| Sprague Dawley (SD) rats | Dashuo, China | ||
| SytoxGreen | Thermofisher, USA | S7020 | |
| Tris-EDTA (TE) buffer | Solarbio, China | T1120 | |
| Triton-X-100 | Biofroxx, German | 1139ML100 |
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