Уникальный подход к выделению нейтрофилов костного мозга крыс с сопоставимой емкостью
Summary
В этом исследовании описаны два метода выделения многочисленных внеклеточных ловушек нейтрофилов (НВЛ) из костного мозга крысы. Один метод сочетает в себе коммерческий набор для выделения нейтрофилов с центрифугированием с градиентом плотности, в то время как другой использует только центрифугирование с градиентом плотности. Оба подхода дают функциональные НВЛ, превосходящие таковые из нейтрофилов периферической крови.
Abstract
Основной целью данного исследования была разработка надежного и эффективного подхода к выделению нейтрофильных внеклеточных ловушек (НВЛ) из костного мозга крыс. Эта попытка возникла из-за ограничений, связанных с традиционным методом извлечения НВЛ из периферической крови, в основном из-за нехватки доступных нейтрофилов для выделения. Исследование выявило две различные методологии получения нейтрофилов крыс из костного мозга: оптимизированная одноступенчатая процедура, которая давала удовлетворительные уровни очистки, и более трудоемкий двухступенчатый процесс, который демонстрировал повышенную эффективность очистки. Важно отметить, что оба метода дали значительное количество жизнеспособных нейтрофилов, от 50 до 100 миллионов на крысу. Эта эффективность отражала результаты, полученные при выделении нейтрофилов как из человеческих, так и из мышиных источников. Важно отметить, что нейтрофилы, полученные из костного мозга крыс, продемонстрировали сопоставимую способность секретировать НВЛ по сравнению с нейтрофилами, полученными из периферической крови. Тем не менее, метод, основанный на костном мозге, последовательно производил значительно большее количество как нейтрофилов, так и НВЛ. Этот подход продемонстрировал потенциал получения значительно большего количества этих клеточных компонентов для дальнейшего применения. Примечательно, что эти изолированные НВЛ и нейтрофилы имеют перспективы для целого ряда применений, охватывающих области воспаления, инфекций и аутоиммунных заболеваний.
Introduction
Нейтрофилы представляют собой важнейшую подгруппу лейкоцитов, которые играют ключевую роль во врожденном иммунном ответе. Они характеризуются многолопастными ядрами и гранулами, содержащими различные протеазы и антимикробные пептиды1. Нейтрофилы в основном функционируют за счет дегрануляции, фагоцитоза и образования НВЛ. Наблюдение НВЛ было впервые сделано Takei et al. в 1996 году во время эксперимента, в котором нейтрофилы стимулировались ацетатом форболмиристата (PMA)2. Впоследствии, в 2004 году, процесс формирования НВЛ был назван Brinkmann et al.3 термином «NETosis». Их исследование еще больше пролило свет на решающую роль НВЛ в нейтрофил-опосредованном антимикробном ответе. НВЛ представляют собой паутиноподобные структуры, состоящие из хроматина, гистонов и антимикробных белков, которые высвобождаются из активированных нейтрофилов в ответ на инфекционные и воспалительные стимулы. НВЛ могут обездвиживать и убивать вторгшихся патогенов, захватывая их и подвергая воздействию высокой концентрации антимикробных пептидов и протеаз 1,3. Кроме того, НВЛ способствуют очищению апоптотических клеток и участвуют в разрешении воспаления. Недавние исследования также показывают, что чрезмерное образование НВЛ или нарушение деградации НВЛ может привести к повреждению тканей, аутоиммунным нарушениям, тромбогенезу и нарушению реваскуляризации 4,5,6,7,8,9,10.
Патогенетическая роль НВЛ при неконтролируемом фиброзе после инфаркта миокарда и формировании желудочковых аневризм была продемонстрирована на примере распространения периваскулярного фиброза 4,11. Модель инфаркта миокарда и выделение нейтрофилов из костного мозга у мышей хорошо известны. Полиморфноядерные (ПМН) лейкоциты, тип белых кровяных телец, в изобилии присутствующих в крови человека, служат отличным источником для выделения нейтрофилов человека. Этот метод устраняет необходимость забора костного мозга, что повышает безопасность и эффективность.
НВЛ также играют роль в фибрилляции предсердий, связанной с ремоделированием сердца. Тем не менее, крупные животные, такие как собаки и свиньи, использовались для моделирования фибрилляции предсердий, поскольку у мышей отсутствует предсердие, достаточно большое, чтобы установить цикл повторного входа или модель мерцательной аритмии, если только специфические ионные каналы или сигнальные пути не будут сбитыили нокаутированы. Несмотря на то, что можно индуцировать фибрилляцию предсердий у крыс и изолировать нейтрофилы из периферической крови крыс, как описано ранее, исследователи столкнулись с ограничением, в соответствии с которым из периферической крови можно было выделить только 2 нейтрофила x 105-5 x 105 (10 мл на крысу). Для извлечения достаточного количества НВЛ в каждый момент времени требовалось примерно 10-25 крыс (всего 5 x 106 нейтрофилов), что приводило к трудоемкому, дорогостоящему и часто малопродуктивномупроцессу. В связи с этим Ли Хэ и его коллеги представляют стратегию, ориентированную на костный мозг, для получения адекватных НВЛ у крыс14. В своей статье они дают всестороннее описание выделения нейтрофилов из костного мозга крыс и сравнивают возможности секреции НВЛ периферических нейтрофилов и нейтрофилов костного мозга крыс. Эти два метода преследуют различные экспериментальные цели, оба приводят к получению достаточного количества нейтрофилов костного мозга крыс при одновременном снижении количества необходимых крыс. Двухступенчатый метод выделения продемонстрировал превосходную очистку нейтрофилов, в то время как одностадийный метод оказался эффективным по времени при приемлемых уровнях очистки. Кроме того, исследователи сравнили образование нетоза и НВЛ между нейтрофилами костного мозга крыс и их периферическими аналогами, обнаружив одинаковую эффективность с PMN. Эти результаты вносят значительный вклад в исследования фибрилляции предсердий, связанные с нейтрофилами, и подчеркивают важность гибкого выбора различных источников для выделения нейтрофилов у различных экспериментальных животных с различным распределением нейтрофилов.
Protocol
Representative Results
Discussion
Выделение нейтрофилов представляет собой ключевой шаг в изучении нетоза, где выбор соответствующего метода выделения имеет первостепенное значение для получения надежных результатов. Важным фактором, который следует взвесить, является возникновение контаминации лимфоцитов во врем?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Финансирование: Работа выполнена при поддержке Национального фонда естественных наук Китая (NoNo 82004154, 81900311, 82100336 и 81970345).
Materials
| A488-conjugated donkey antirabbit IgG(H + L) | Invitrogen, USA | A32790 | |
| A594-conjugated donkey anti-mouse IgG(H + L) | Invitrogen, USA | A32744 | |
| A594-conjugated goat anti-Mouse IgG1 | Invitrogen, USA | A21125 | |
| Anti-rat myeloperoxidase | Abcam, England | ab134132 | |
| Anti-rat neutrophil elastase | Abcam, England | ab21595 | |
| Celigo Image Cytometer | Nexelom, USA | 200-BFFL-5C | |
| DNase I | Sigma, USA | 10104159001 | |
| fetal bovine serum (FBS) | Gibco, USA | 10099141C | |
| Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco, USA | C14175500BT | |
| Hoechst | Thermofisher, USA | 33342 | |
| Isoflurane | RWD, China | R510-22-10 | |
| Mowiol | Sigma, USA | 81381 | |
| Normal Donkey Serum | Solarbio, China | SL050 | |
| Paraformaldehyde | biosharp, China | BL539A | |
| Penicillin-streptomycin | Hyclone, USA | SV30010 | |
| Percoll | GE, USA | P8370-1L | |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Sigma, USA | P1585 | |
| Picogreen dsDNA Assay Kit | Invitrogen, USA | P11496 | |
| Rat neutrophil isolation kit | Solarbio, China | P9200 | |
| Red blood cell lysis buffer | Solarbio, China | R1010 | |
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI) media | Hyclone, USA | SH30809.01B | |
| RWD Universal Animal Anesthesia Machine | RWD, China | R500 | |
| Sprague Dawley (SD) rats | Dashuo, China | ||
| SytoxGreen | Thermofisher, USA | S7020 | |
| Tris-EDTA (TE) buffer | Solarbio, China | T1120 | |
| Triton-X-100 | Biofroxx, German | 1139ML100 |
References
- Papayannopoulos, V. Neutrophil extracellular traps in immunity and disease. Nature Reviews Immunology. 18 (2), 134-147 (2018).
- Takei, H., Araki, A., Watanabe, H., Ichinose, A., Sendo, F. Rapid killing of human neutrophils by the potent activator phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) accompanied by changes different from typical apoptosis or necrosis. Journal of Leukocyte Biology. 59 (2), 229-240 (1996).
- Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
- Li, T., et al. Neutrophil extracellular traps induce intestinal damage and thrombotic tendency in inflammatory bowel disease. Journal of Crohn’s and Colitis. 14 (2), 240-253 (2020).
- Laridan, E., Martinod, K., De Meyer, S. F. Neutrophil extracellular traps in arterial and venous thrombosis. Seminars in Thrombosis and Hemostasis. 45 (1), 86-93 (2019).
- Dinallo, V., et al. Neutrophil Extracellular traps sustain inflammatory signals in ulcerative colitis. Journal of Crohn’s and Colitis. 13 (6), 772-784 (2019).
- Dicker, A. J., et al. Neutrophil extracellular traps are associated with disease severity and microbiota diversity in patients with chronic obstructive pulmonary disease. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 141 (1), 117-127 (2018).
- Franck, G., et al. Roles of PAD4 and netosis in experimental atherosclerosis and arterial injury: Implications for superficial erosion. Atherosclerosis. 275, e11 (2018).
- Jorch, S. K., Kubes, P. An emerging role for neutrophil extracellular traps in noninfectious disease. Nature Medicine. 23 (3), 279-287 (2017).
- Marin-Esteban, V., et al. Afa/Dr diffusely adhering Escherichia coli strain C1845 induces neutrophil extracellular traps that kill bacteria and damage human enterocyte-like cells. Infection and Immunity. 80 (5), 1891-1899 (2012).
- Kang, L., et al. Neutrophil extracellular traps released by neutrophils impair revascularization and vascular remodeling after stroke. Nature Communications. 11 (1), 2488 (2020).
- Schüttler, D., et al. Animal models of atrial fibrillation. Circulation Research. 127 (1), 91-110 (2020).
- Najmeh, S., Cools-Lartigue, J., Giannias, B., Spicer, J., Ferri, L. E. Simplified human neutrophil extracellular traps (NETs) isolation and handling. Journal of Visualized Experiments. 98, e52687 (2015).
- He, L., et al. Bone marrow is the preferred source for isolation of rat neutrophils and the subsequent acquisition of neutrophil extracellular traps. Annals of Translational Medicine. 10 (15), 823-823 (2022).
- Freeman, G. E., Dalton, C. A., Brooks, P. M. A Nycodenz gradient method for the purification of neutrophils from the peripheral blood of rats. Journal of Immunological Methods. 139 (2), 241-249 (1991).
- Zindl, C. L., et al. IL-22-producing neutrophils contribute to antimicrobial defense and restitution of colonic epithelial integrity during colitis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (31), 12768-12773 (2013).
- Wong, K. L., et al. Gene expression profiling reveals the defining features of the classical, intermediate, and nonclassical human monocyte subsets. Blood. 118 (5), e16-e31 (2011).
- Nauseef, W. M. Isolation of human neutrophils from venous blood. Methods in Molecular Biology. 412, 15-20 (2007).
- Lindena, J., Burkhardt, H. Separation and chemiluminescence properties of human, canine and rat polymorphonuclear cells. Journal of Immunological Methods. 115 (1), 141-147 (1988).
- Lauwers, M., et al. Optimization of the Transwell assay for the analysis of neutrophil chemotaxis using flow cytometry to refine the clinical investigation of immunodeficient patients. Clinical Immunology. 238, 108994 (2022).
- Evrard, M., et al. Developmental analysis of bone marrow neutrophils reveals populations specialized in expansion, trafficking, and effector functions. Immunity. 48 (2), 364-379 (2018).
