Enfoque único para aislar neutrófilos de médula ósea de rata con capacidad comparable
Summary
Esta investigación describe dos técnicas para aislar abundantes trampas extracelulares de neutrófilos (TNE) de la médula ósea de rata. Un método combina un kit comercial de aislamiento de neutrófilos con centrifugación en gradiente de densidad, mientras que el otro emplea solo centrifugación en gradiente de densidad. Ambos enfoques producen TNE funcionales que superan a los de los neutrófilos de sangre periférica.
Abstract
El objetivo principal de esta investigación fue desarrollar un enfoque fiable y eficiente para aislar las trampas extracelulares de neutrófilos (TNE) de la médula ósea de rata. Este esfuerzo surgió debido a las limitaciones asociadas con el método tradicional de extracción de TNE de sangre periférica, principalmente debido a la escasez de neutrófilos disponibles para su aislamiento. El estudio reveló dos metodologías distintas para obtener neutrófilos de rata a partir de la médula ósea: un procedimiento simplificado de un solo paso que produjo niveles de purificación satisfactorios, y un proceso de dos pasos más intensivo en tiempo que exhibió una mayor eficiencia de purificación. Es importante destacar que ambas técnicas produjeron una cantidad sustancial de neutrófilos viables, que oscilaban entre 50 y 100 millones por rata. Esta eficiencia reflejó los resultados obtenidos al aislar neutrófilos de fuentes humanas y murinas. Significativamente, los neutrófilos derivados de la médula ósea de rata exhibieron capacidades comparables para secretar TNE en comparación con los neutrófilos obtenidos de sangre periférica. Sin embargo, el método basado en la médula ósea produjo consistentemente cantidades notablemente mayores tanto de neutrófilos como de TNE. Este enfoque demostró el potencial de obtener cantidades significativamente mayores de estos componentes celulares para aplicaciones posteriores. En particular, estos NET y neutrófilos aislados son prometedores para una variedad de aplicaciones, que abarcan los ámbitos de la inflamación, la infección y las enfermedades autoinmunes.
Introduction
Los neutrófilos constituyen un subconjunto crítico de leucocitos que desempeñan un papel fundamental en la respuesta inmunitaria innata. Se caracterizan por núcleos multilobulados y gránulos que contienen diversas proteasas y péptidos antimicrobianos1. Los neutrófilos funcionan principalmente a través de la degranulación, la fagocitosis y la formación de NET. La observación de los TNE fue realizada por primera vez por Takei et al. en 1996 durante un experimento en el que se estimularon neutrófilos con acetato de miristato de forbol (PMA)2. Posteriormente, el proceso de formación de NET fue acuñado como “NETosis” por Brinkmann et al.3 en 2004. Su investigación iluminó aún más el papel crucial de los NET en las respuestas antimicrobianas mediadas por neutrófilos. Los TNE son estructuras en forma de red compuestas de cromatina, histonas y proteínas antimicrobianas que se liberan de los neutrófilos activados en respuesta a estímulos infecciosos e inflamatorios. Los TNE pueden inmovilizar y matar patógenos invasores atrapándolos y exponiéndolos a una alta concentración de péptidos antimicrobianos y proteasas 1,3. Además, los NET contribuyen a la eliminación de las células apoptóticas y participan en la resolución de la inflamación. Estudios recientes también indican que una formación excesiva de TNE o una degradación deficiente de los TNE puede conducir a daño tisular, trastornos autoinmunes, trombogénesis y alteración de la revascularización 4,5,6,7,8,9,10.
El papel patogénico de los TNE en la fibrosis no controlada después del infarto de miocardio y en la formación de aneurismas ventriculares ha sido demostrado a través de la expansión de la fibrosis perivascular 4,11. El modelo de infarto de miocardio y el aislamiento de neutrófilos de la médula ósea en ratones están bien establecidos. Los leucocitos polimorfonucleares (PMN), un tipo de glóbulo blanco abundante en la sangre humana, sirven como una excelente fuente para aislar neutrófilos humanos. Este método elimina la necesidad de recolectar médula ósea, lo que mejora la seguridad y la eficiencia.
Los tumores neuroendocrinos también desempeñan un papel en la fibrilación auricular asociada con la remodelación cardíaca. Sin embargo, se utilizaron animales grandes como perros y cerdos para modelar la fibrilación auricular, ya que los ratones carecen de una aurícula lo suficientemente grande como para establecer un ciclo de reentrada o el modelo de FA, a menos que los canales iónicos específicos o las vías de señalización sean derribados o eliminados. Si bien es posible inducir fibrilación auricular en ratas y aislar neutrófilos de la sangre periférica de ratas como se describió anteriormente, los investigadores encontraron una limitación por la cual solo se podían aislar 2 x 105-5 x 105 neutrófilos de la sangre periférica (10 ml por rata). La extracción de suficientes NETs en cada punto de tiempo requirió aproximadamente 10-25 ratas (5 x 106 neutrófilos en total), lo que resultó en un proceso lento, costoso y, a menudo, de bajo rendimiento13. En este sentido, Li He y sus colegas presentan una estrategia orientada a la médula ósea para obtener TNE adecuados de ratas14. En su artículo, proporcionan una descripción completa del aislamiento de neutrófilos de la médula ósea de rata y comparan las capacidades de secreción de NET de los neutrófilos periféricos y de la médula ósea de rata. Los dos métodos descritos se adaptan a objetivos experimentales distintos, y ambos dan como resultado cantidades suficientes de neutrófilos de médula ósea de rata al tiempo que reducen el número de ratas necesarias. El método de aislamiento de dos pasos demostró una purificación superior de los neutrófilos, mientras que el método de un solo paso demostró ser eficiente en el tiempo con niveles de purificación aceptables. Además, los investigadores compararon la formación de NETosis y NET entre los neutrófilos de la médula ósea de rata y sus homólogos periféricos, encontrando la misma potencia que la PMN. Estos hallazgos contribuyen significativamente a los estudios relacionados con los neutrófilos de la fibrilación auricular y subrayan la importancia de seleccionar de manera flexible diferentes fuentes para el aislamiento de neutrófilos en varios animales de experimentación con diferentes distribuciones de neutrófilos.
Protocol
Representative Results
Discussion
El aislamiento de neutrófilos constituye un paso fundamental en el estudio de la NETosis, donde la selección de un método de aislamiento apropiado es primordial para obtener resultados fiables. Un factor importante a tener en cuenta es la aparición de contaminación linfocitaria durante el aislamiento. Abordar este desafío es particularmente importante cuando se aíslan neutrófilos de rata de la médula ósea. A pesar del claro rango de densidad de neutrófilos (1,0814-1,0919, con un pico en 1,0919) en comparación…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Financiación: Este trabajo contó con el apoyo de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (Nos. 82004154, 81900311, 82100336 y 81970345).
Materials
| A488-conjugated donkey antirabbit IgG(H + L) | Invitrogen, USA | A32790 | |
| A594-conjugated donkey anti-mouse IgG(H + L) | Invitrogen, USA | A32744 | |
| A594-conjugated goat anti-Mouse IgG1 | Invitrogen, USA | A21125 | |
| Anti-rat myeloperoxidase | Abcam, England | ab134132 | |
| Anti-rat neutrophil elastase | Abcam, England | ab21595 | |
| Celigo Image Cytometer | Nexelom, USA | 200-BFFL-5C | |
| DNase I | Sigma, USA | 10104159001 | |
| fetal bovine serum (FBS) | Gibco, USA | 10099141C | |
| Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco, USA | C14175500BT | |
| Hoechst | Thermofisher, USA | 33342 | |
| Isoflurane | RWD, China | R510-22-10 | |
| Mowiol | Sigma, USA | 81381 | |
| Normal Donkey Serum | Solarbio, China | SL050 | |
| Paraformaldehyde | biosharp, China | BL539A | |
| Penicillin-streptomycin | Hyclone, USA | SV30010 | |
| Percoll | GE, USA | P8370-1L | |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Sigma, USA | P1585 | |
| Picogreen dsDNA Assay Kit | Invitrogen, USA | P11496 | |
| Rat neutrophil isolation kit | Solarbio, China | P9200 | |
| Red blood cell lysis buffer | Solarbio, China | R1010 | |
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI) media | Hyclone, USA | SH30809.01B | |
| RWD Universal Animal Anesthesia Machine | RWD, China | R500 | |
| Sprague Dawley (SD) rats | Dashuo, China | ||
| SytoxGreen | Thermofisher, USA | S7020 | |
| Tris-EDTA (TE) buffer | Solarbio, China | T1120 | |
| Triton-X-100 | Biofroxx, German | 1139ML100 |
References
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