Unieke aanpak voor het isoleren van beenmergneutrofielen bij ratten met vergelijkbare capaciteit
Summary
Dit onderzoek schetst twee technieken voor het isoleren van overvloedige neutrofiele extracellulaire vallen (NET’s) uit het beenmerg van ratten. De ene methode combineert een commerciële neutrofielenisolatiekit met dichtheidsgradiëntcentrifugatie, terwijl de andere alleen dichtheidsgradiëntcentrifugatie gebruikt. Beide benaderingen leveren functionele NET’s op die die van perifere bloedneutrofielen overtreffen.
Abstract
Het primaire doel van dit onderzoek was het ontwikkelen van een betrouwbare en efficiënte aanpak voor het isoleren van neutrofiele extracellulaire vallen (NET’s) uit het beenmerg van ratten. Deze inspanning kwam voort uit beperkingen die verband houden met de traditionele methode om NET’s uit perifeer bloed te extraheren, voornamelijk als gevolg van de schaarste aan beschikbare neutrofielen voor isolatie. De studie onthulde twee verschillende methoden voor het verkrijgen van neutrofielen van ratten uit het beenmerg: een gestroomlijnde eenstapsprocedure die bevredigende zuiveringsniveaus opleverde, en een meer tijdrovend tweestapsproces dat een verbeterde zuiveringsefficiëntie vertoonde. Belangrijk is dat beide technieken een aanzienlijke hoeveelheid levensvatbare neutrofielen opleverden, variërend van 50 tot 100 miljoen per rat. Deze efficiëntie weerspiegelde de resultaten die werden verkregen door neutrofielen te isoleren uit zowel menselijke als muizenbronnen. Het is veelbetekenend dat neutrofielen afkomstig van het beenmerg van ratten vergelijkbare mogelijkheden vertoonden om NET af te scheiden in vergelijking met neutrofielen verkregen uit perifeer bloed. De op beenmerg gebaseerde methode produceerde echter consequent aanzienlijk grotere hoeveelheden van zowel neutrofielen als NET’s. Deze aanpak toonde het potentieel aan om aanzienlijk grotere hoeveelheden van deze cellulaire componenten te verkrijgen voor verdere stroomafwaartse toepassingen. Met name deze geïsoleerde NET’s en neutrofielen zijn veelbelovend voor een reeks toepassingen, op het gebied van ontstekingen, infecties en auto-immuunziekten.
Introduction
Neutrofielen vormen een cruciale subset van leukocyten die een cruciale rol spelen in de aangeboren immuunrespons. Ze worden gekenmerkt door meerlobbige kernen en korrels die verschillende proteasen en antimicrobiële peptiden bevatten1. Neutrofielen werken voornamelijk door degranulatie, fagocytose en de vorming van NET’s. De waarneming van NET’s werd voor het eerst gedaan door Takei et al. in 1996 tijdens een experiment waarbij neutrofielen werden gestimuleerd met phorbolmyristaatacetaat (PMA)2. Vervolgens werd het proces van NET-vorming in 2004 door Brinkmann et al.3 “NETosis” genoemd. Hun onderzoek belichtte verder de cruciale rol van NET in neutrofielen-gemedieerde antimicrobiële reacties. NET’s zijn webachtige structuren die zijn samengesteld uit chromatine, histonen en antimicrobiële eiwitten die vrijkomen uit geactiveerde neutrofielen als reactie op infectieuze en inflammatoire stimuli. NET’s kunnen binnendringende ziekteverwekkers immobiliseren en doden door ze te vangen en bloot te stellen aan een hoge concentratie antimicrobiële peptiden en proteasen 1,3. Bovendien dragen NET’s bij aan de klaring van apoptotische cellen en nemen ze deel aan het oplossen van ontstekingen. Recente studies geven ook aan dat een overmatige vorming van NET’s of verminderde NET-afbraak kan leiden tot weefselbeschadiging, auto-immuunziekten, trombogenese en verminderde revascularisatie 4,5,6,7,8,9,10.
De pathogene rol van NET bij ongecontroleerde fibrose na een myocardinfarct en de vorming van ventriculaire aneurysma’s is aangetoond door de uitbreiding van perivasculaire fibrose 4,11. Het myocardinfarctmodel en de isolatie van neutrofielen uit het beenmerg bij muizen zijn beide goed ingeburgerd. Polymorfonucleaire (PMN) leukocyten, een type witte bloedcellen dat overvloedig aanwezig is in menselijk bloed, dienen als een uitstekende bron voor het isoleren van menselijke neutrofielen. Deze methode elimineert de noodzaak om beenmerg te oogsten, waardoor de veiligheid en efficiëntie worden verbeterd.
NET spelen ook een rol bij boezemfibrilleren geassocieerd met cardiale remodellering. Grote dieren zoals honden en varkens werden echter gebruikt om boezemfibrilleren te modelleren, omdat muizen geen atrium hebben dat groot genoeg is om een herintredingscyclus of het AF-model tot stand te brengen, tenzij specifieke ionkanalen of signaalroutes worden neergehaald of uitgeschakeld12. Hoewel het mogelijk is om atriumfibrilleren bij ratten te induceren en neutrofielen te isoleren uit perifeer bloed van ratten, zoals eerder beschreven, stuitten onderzoekers op een beperking waarbij slechts 2 x 105-5 x 105 neutrofielen konden worden geïsoleerd uit perifeer bloed (10 ml per rat). Voor het extraheren van voldoende NET’s op elk tijdstip waren ongeveer 10-25 ratten nodig (5 x 106 neutrofielen in totaal), wat resulteerde in een tijdrovend, duur en vaak laag renderend proces13. In dit verband presenteren Li He en collega’s een beenmerggerichte strategie om adequate NET’s van ratten teverkrijgen14. In hun artikel geven ze een uitgebreide beschrijving van het isoleren van neutrofielen uit het beenmerg van ratten en vergelijken ze de NET-secretiemogelijkheden van perifere neutrofielen van ratten en neutrofielen van beenmerg. De twee geschetste methoden komen tegemoet aan verschillende experimentele doelen, die beide resulteren in voldoende hoeveelheden beenmergneutrofielen van ratten en tegelijkertijd het aantal benodigde ratten verminderen. De tweestapsisolatiemethode toonde een superieure neutrofielenzuivering aan, terwijl de eenstapsmethode tijdbesparend bleek met acceptabele zuiveringsniveaus. Bovendien vergeleken de onderzoekers NETosis en NET-vorming tussen beenmergneutrofielen van ratten en hun perifere tegenhangers, waarbij ze een gelijke potentie vonden met PMN. Deze bevindingen dragen aanzienlijk bij aan neutrofielen-gerelateerde studies van atriumfibrilleren en onderstrepen het belang van het flexibel selecteren van verschillende bronnen voor neutrofielenisolatie in verschillende proefdieren met verschillende neutrofielenverdelingen.
Protocol
Representative Results
Discussion
De isolatie van neutrofielen vormt een cruciale stap in het bestuderen van NETosis, waarbij de selectie van een geschikte isolatiemethode van het grootste belang is voor het verkrijgen van betrouwbare resultaten. Een belangrijke factor om af te wegen is het optreden van lymfocytenbesmetting tijdens isolatie. Het aanpakken van deze uitdaging is vooral belangrijk bij het isoleren van neutrofielen van ratten uit het beenmerg. Ondanks het duidelijke dichtheidsbereik van neutrofielen (1,0814-1,0919, met een piek van 1,0919) i…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Financiering: Dit werk werd ondersteund door de National Natural Science Foundation of China (nrs. 82004154, 81900311, 82100336 en 81970345).
Materials
| A488-conjugated donkey antirabbit IgG(H + L) | Invitrogen, USA | A32790 | |
| A594-conjugated donkey anti-mouse IgG(H + L) | Invitrogen, USA | A32744 | |
| A594-conjugated goat anti-Mouse IgG1 | Invitrogen, USA | A21125 | |
| Anti-rat myeloperoxidase | Abcam, England | ab134132 | |
| Anti-rat neutrophil elastase | Abcam, England | ab21595 | |
| Celigo Image Cytometer | Nexelom, USA | 200-BFFL-5C | |
| DNase I | Sigma, USA | 10104159001 | |
| fetal bovine serum (FBS) | Gibco, USA | 10099141C | |
| Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco, USA | C14175500BT | |
| Hoechst | Thermofisher, USA | 33342 | |
| Isoflurane | RWD, China | R510-22-10 | |
| Mowiol | Sigma, USA | 81381 | |
| Normal Donkey Serum | Solarbio, China | SL050 | |
| Paraformaldehyde | biosharp, China | BL539A | |
| Penicillin-streptomycin | Hyclone, USA | SV30010 | |
| Percoll | GE, USA | P8370-1L | |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Sigma, USA | P1585 | |
| Picogreen dsDNA Assay Kit | Invitrogen, USA | P11496 | |
| Rat neutrophil isolation kit | Solarbio, China | P9200 | |
| Red blood cell lysis buffer | Solarbio, China | R1010 | |
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI) media | Hyclone, USA | SH30809.01B | |
| RWD Universal Animal Anesthesia Machine | RWD, China | R500 | |
| Sprague Dawley (SD) rats | Dashuo, China | ||
| SytoxGreen | Thermofisher, USA | S7020 | |
| Tris-EDTA (TE) buffer | Solarbio, China | T1120 | |
| Triton-X-100 | Biofroxx, German | 1139ML100 |
References
- Papayannopoulos, V. Neutrophil extracellular traps in immunity and disease. Nature Reviews Immunology. 18 (2), 134-147 (2018).
- Takei, H., Araki, A., Watanabe, H., Ichinose, A., Sendo, F. Rapid killing of human neutrophils by the potent activator phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) accompanied by changes different from typical apoptosis or necrosis. Journal of Leukocyte Biology. 59 (2), 229-240 (1996).
- Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
- Li, T., et al. Neutrophil extracellular traps induce intestinal damage and thrombotic tendency in inflammatory bowel disease. Journal of Crohn’s and Colitis. 14 (2), 240-253 (2020).
- Laridan, E., Martinod, K., De Meyer, S. F. Neutrophil extracellular traps in arterial and venous thrombosis. Seminars in Thrombosis and Hemostasis. 45 (1), 86-93 (2019).
- Dinallo, V., et al. Neutrophil Extracellular traps sustain inflammatory signals in ulcerative colitis. Journal of Crohn’s and Colitis. 13 (6), 772-784 (2019).
- Dicker, A. J., et al. Neutrophil extracellular traps are associated with disease severity and microbiota diversity in patients with chronic obstructive pulmonary disease. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 141 (1), 117-127 (2018).
- Franck, G., et al. Roles of PAD4 and netosis in experimental atherosclerosis and arterial injury: Implications for superficial erosion. Atherosclerosis. 275, e11 (2018).
- Jorch, S. K., Kubes, P. An emerging role for neutrophil extracellular traps in noninfectious disease. Nature Medicine. 23 (3), 279-287 (2017).
- Marin-Esteban, V., et al. Afa/Dr diffusely adhering Escherichia coli strain C1845 induces neutrophil extracellular traps that kill bacteria and damage human enterocyte-like cells. Infection and Immunity. 80 (5), 1891-1899 (2012).
- Kang, L., et al. Neutrophil extracellular traps released by neutrophils impair revascularization and vascular remodeling after stroke. Nature Communications. 11 (1), 2488 (2020).
- Schüttler, D., et al. Animal models of atrial fibrillation. Circulation Research. 127 (1), 91-110 (2020).
- Najmeh, S., Cools-Lartigue, J., Giannias, B., Spicer, J., Ferri, L. E. Simplified human neutrophil extracellular traps (NETs) isolation and handling. Journal of Visualized Experiments. 98, e52687 (2015).
- He, L., et al. Bone marrow is the preferred source for isolation of rat neutrophils and the subsequent acquisition of neutrophil extracellular traps. Annals of Translational Medicine. 10 (15), 823-823 (2022).
- Freeman, G. E., Dalton, C. A., Brooks, P. M. A Nycodenz gradient method for the purification of neutrophils from the peripheral blood of rats. Journal of Immunological Methods. 139 (2), 241-249 (1991).
- Zindl, C. L., et al. IL-22-producing neutrophils contribute to antimicrobial defense and restitution of colonic epithelial integrity during colitis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (31), 12768-12773 (2013).
- Wong, K. L., et al. Gene expression profiling reveals the defining features of the classical, intermediate, and nonclassical human monocyte subsets. Blood. 118 (5), e16-e31 (2011).
- Nauseef, W. M. Isolation of human neutrophils from venous blood. Methods in Molecular Biology. 412, 15-20 (2007).
- Lindena, J., Burkhardt, H. Separation and chemiluminescence properties of human, canine and rat polymorphonuclear cells. Journal of Immunological Methods. 115 (1), 141-147 (1988).
- Lauwers, M., et al. Optimization of the Transwell assay for the analysis of neutrophil chemotaxis using flow cytometry to refine the clinical investigation of immunodeficient patients. Clinical Immunology. 238, 108994 (2022).
- Evrard, M., et al. Developmental analysis of bone marrow neutrophils reveals populations specialized in expansion, trafficking, and effector functions. Immunity. 48 (2), 364-379 (2018).
