Abordagem única para isolar neutrófilos de medula óssea de rato com capacidade comparável
Summary
Esta pesquisa descreve duas técnicas para isolar abundantes armadilhas extracelulares de neutrófilos (NETs) da medula óssea de ratos. Um método combina um kit comercial de isolamento de neutrófilos com centrifugação por gradiente de densidade, enquanto o outro emprega apenas centrifugação por gradiente de densidade. Ambas as abordagens produzem NETs funcionais superando as dos neutrófilos do sangue periférico.
Abstract
O objetivo primário desta pesquisa foi desenvolver uma abordagem confiável e eficiente para isolar armadilhas extracelulares (NETs) de neutrófilos da medula óssea de ratos. Esse esforço surgiu devido às limitações associadas ao método tradicional de extração de TNEs do sangue periférico, principalmente devido à escassez de neutrófilos disponíveis para isolamento. O estudo revelou duas metodologias distintas para a obtenção de neutrófilos de rato a partir da medula óssea: um procedimento simplificado de uma etapa que produziu níveis de purificação satisfatórios e um processo de duas etapas mais demorado que exibiu maior eficiência de purificação. É importante ressaltar que ambas as técnicas produziram uma quantidade substancial de neutrófilos viáveis, variando entre 50 a 100 milhões por rato. Essa eficiência refletiu os resultados obtidos com o isolamento de neutrófilos de fontes humanas e murinas. Significativamente, neutrófilos derivados da medula óssea de ratos exibiram habilidades comparáveis para secretar NETs quando comparados com neutrófilos obtidos de sangue periférico. No entanto, o método baseado na medula óssea produziu consistentemente quantidades notavelmente maiores de neutrófilos e NETs. Esta abordagem demonstrou o potencial de obter quantidades significativamente maiores desses componentes celulares para futuras aplicações a jusante. Notavelmente, esses NETs isolados e neutrófilos são promissores para uma variedade de aplicações, abrangendo os domínios da inflamação, infecção e doenças autoimunes.
Introduction
Os neutrófilos constituem um subconjunto crítico de leucócitos que desempenham um papel fundamental na resposta imune inata. Caracterizam-se por núcleos multilobados e grânulos contendo várias proteases e peptídeos antimicrobianos1. Os neutrófilos funcionam principalmente através da degranulação, fagocitose e formação de NETs. A observação dos TNEs foi feita pela primeira vez por Takei e col. em 1996, durante um experimento em que neutrófilos foram estimulados com acetato de miristato de forbol (PMA)2. Posteriormente, o processo de formação da NET foi denominado “NETosis” por Brinkmann et al.3 em 2004. Sua pesquisa iluminou ainda mais o papel crucial dos NETs em respostas antimicrobianas mediadas por neutrófilos. NETs são estruturas semelhantes a teias compostas por cromatina, histonas e proteínas antimicrobianas que são liberadas de neutrófilos ativados em resposta a estímulos infecciosos e inflamatórios. As NETs podem imobilizar e matar patógenos invasores, aprisionando-os e expondo-os a uma alta concentração de peptídeos e proteases antimicrobianas 1,3. Além disso, os TNEs contribuem para a depuração das células apoptóticas e participam da resolução da inflamação. Estudos recentes também indicam que a formação excessiva de TNEs ou a degradação prejudicada do SNE podem levar a dano tecidual, doenças autoimunes, trombogênese e revascularização prejudicada4,5,6,7,8,9,10.
O papel patogênico dos TNEs na fibrose não controlada após infarto do miocárdio e na formação de aneurismas ventriculares tem sido demonstrado através da expansão da fibrose perivascular 4,11. O modelo de infarto do miocárdio e o isolamento de neutrófilos da medula óssea em camundongos estão bem estabelecidos. Os leucócitos polimorfonucleares (PMN), um tipo de glóbulo branco abundante no sangue humano, servem como uma excelente fonte para isolar neutrófilos humanos. Este método elimina a necessidade de colheita de medula óssea, aumentando assim a segurança e eficiência.
Os TNEs também desempenham um papel na fibrilação atrial associada ao remodelamento cardíaco. No entanto, animais de grande porte, como cães e porcos, foram utilizados para modelar a fibrilação atrial, uma vez que os camundongos não possuem um átrio considerável o suficiente para estabelecer um ciclo de reentrada ou o modelo de FA, a menos que canais iônicos específicos ou vias de sinalização sejam derrubados ou nocauteados12. Embora seja possível induzir fibrilação atrial em ratos e isolar neutrófilos do sangue periférico de ratos, como descrito anteriormente, os pesquisadores encontraram uma limitação pela qual apenas 2 x 105-5 x10 5 neutrófilos poderiam ser isolados do sangue periférico (10 mL por rato). A extração de NETs suficientes em cada momento exigiu aproximadamente 10-25 ratos (5 x 106 neutrófilos no total), resultando em um processo demorado, caro e, muitas vezes, de baixo rendimento13. A esse respeito, Li He e colaboradores apresentam uma estratégia orientada para a medula óssea para obter NETs adequados deratos14. Em seu artigo, eles fornecem uma descrição abrangente do isolamento de neutrófilos da medula óssea de ratos e comparam as capacidades de secreção de NET de neutrófilos periféricos e de medula óssea de ratos. Os dois métodos delineados atendem a objetivos experimentais distintos, ambos resultando em quantidades suficientes de neutrófilos da medula óssea de ratos, enquanto reduzem o número de ratos necessários. O método de isolamento em duas etapas demonstrou purificação superior de neutrófilos, enquanto o método de uma etapa mostrou-se eficiente em termos de tempo com níveis aceitáveis de purificação. Além disso, os pesquisadores compararam a formação de NETosis e NET entre neutrófilos da medula óssea de ratos e seus homólogos periféricos, encontrando potência igual com PMN. Esses achados contribuem significativamente para estudos relacionados a neutrófilos sobre fibrilação atrial e ressaltam a importância da seleção flexível de diferentes fontes para o isolamento de neutrófilos em vários animais experimentais com diferentes distribuições de neutrófilos.
Protocol
Representative Results
Discussion
O isolamento de neutrófilos constitui uma etapa fundamental no estudo da NETosis, onde a seleção de um método de isolamento apropriado é fundamental para a obtenção de resultados confiáveis. Um fator importante a pesar é a ocorrência de contaminação linfocitária durante o isolamento. Enfrentar esse desafio é particularmente significativo ao isolar neutrófilos de rato da medula óssea. Apesar da distinta faixa de densidade de neutrófilos (1,0814-1,0919, com pico em 1,0919) em relação aos linfócitos (1,0…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Financiamento: Este trabalho foi apoiado pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (Nos. 82004154, 81900311, 82100336 e 81970345).
Materials
| A488-conjugated donkey antirabbit IgG(H + L) | Invitrogen, USA | A32790 | |
| A594-conjugated donkey anti-mouse IgG(H + L) | Invitrogen, USA | A32744 | |
| A594-conjugated goat anti-Mouse IgG1 | Invitrogen, USA | A21125 | |
| Anti-rat myeloperoxidase | Abcam, England | ab134132 | |
| Anti-rat neutrophil elastase | Abcam, England | ab21595 | |
| Celigo Image Cytometer | Nexelom, USA | 200-BFFL-5C | |
| DNase I | Sigma, USA | 10104159001 | |
| fetal bovine serum (FBS) | Gibco, USA | 10099141C | |
| Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco, USA | C14175500BT | |
| Hoechst | Thermofisher, USA | 33342 | |
| Isoflurane | RWD, China | R510-22-10 | |
| Mowiol | Sigma, USA | 81381 | |
| Normal Donkey Serum | Solarbio, China | SL050 | |
| Paraformaldehyde | biosharp, China | BL539A | |
| Penicillin-streptomycin | Hyclone, USA | SV30010 | |
| Percoll | GE, USA | P8370-1L | |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Sigma, USA | P1585 | |
| Picogreen dsDNA Assay Kit | Invitrogen, USA | P11496 | |
| Rat neutrophil isolation kit | Solarbio, China | P9200 | |
| Red blood cell lysis buffer | Solarbio, China | R1010 | |
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI) media | Hyclone, USA | SH30809.01B | |
| RWD Universal Animal Anesthesia Machine | RWD, China | R500 | |
| Sprague Dawley (SD) rats | Dashuo, China | ||
| SytoxGreen | Thermofisher, USA | S7020 | |
| Tris-EDTA (TE) buffer | Solarbio, China | T1120 | |
| Triton-X-100 | Biofroxx, German | 1139ML100 |
References
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