Abgetrennte Maisscheiden für die Lebendzell-Bildgebung der Infektion durch pilzliche Blattmais-Erreger
Summary
Dieses Manuskript beschreibt ein optimiertes Inokulationsprotokoll, das abgelöste Maisblatthüllen für reproduzierbare zytologische, physiologische und molekulare Studien von Maisinteraktionen mit pilzlichen Pflanzenpathogenen verwendet. Die Blattscheiden erleichtern die Echtzeitbeobachtung zellulärer Interaktionen zwischen der lebenden Pflanze und dem Pilz in nicht fixiertem Gewebe.
Abstract
Wir haben ein Protokoll optimiert, um Maisblattscheiden mit hemibiotrophen und nekrotrophen blattpathogenen Pilzen zu impfen. Die Methode ist eine Abwandlung von einer Methode, die ursprünglich auf Reisblattscheiden angewendet wurde, und ermöglicht die direkte mikroskopische Beobachtung des Pilzwachstums und der Pilzentwicklung in lebenden Pflanzenzellen. Blattscheiden, die von Maiskeimlingen mit zwei vollständig geschlüpften Blatthalsen entnommen wurden, werden mit 20 μl-Tropfen von 5 x 105 Sporen/ml Pilzsporensuspensionen beimpft und in Feuchtekammern bei 23 °C unter kontinuierlichem Fluoreszenzlicht inkubiert. Nach 24-72 h wird überschüssiges Gewebe mit einer Rasierklinge entfernt, um eine einzelne Schicht Epidermiszellen zu hinterlassen, eine optisch klare Probe, die direkt abgebildet werden kann, ohne dass eine chemische Fixierung oder Reinigung erforderlich ist. Pflanzen- und Pilzzellen bleiben für die Dauer des Experiments am Leben und Interaktionen können in Echtzeit visualisiert werden. Hüllen können gefärbt oder einer Plasmolyse unterzogen werden, um die Entwicklungszytologie und Lebensfähigkeit von Wirts- und Pathogenzellen während der Infektion und Kolonisierung zu untersuchen. Pilzstämme, die so transformiert wurden, dass sie fluoreszierende Proteine exprimieren, können auf den Hüllen inokuliert oder co-inokuliert werden, um die Auflösung zu erhöhen und die Bewertung kompetitiver oder synergistischer Interaktionen zu erleichtern. Pilzstämme, die fluoreszierende Fusionsproteine exprimieren, können verwendet werden, um die Produktion und das Targeting dieser einzelnen Proteine in planta zu verfolgen und zu quantifizieren. Inokulierte Scheidengewebe können extrahiert werden, um Nukleinsäuren, Proteine oder Metaboliten zu charakterisieren. Der Einsatz dieser Scheidenassays hat die detaillierten Untersuchungen der Mechanismen der pilzlichen Pathogenität in Mais sowie der Effektoren von Pilzproteinen und Sekundärmetaboliten, die zur Pathogenität beitragen, erheblich vorangebracht.
Introduction
Räumliche und zeitliche Analysen auf zellulärer Ebene sind entscheidend für das Verständnis der Physiologie und Zytologie von Pilz-Pflanzen-Interaktionen. Blattgewebe, das chemischfixiert wurde 1,2,3 oder gereinigt und gefärbt 4, sowie künstliche Membranen5 wurden in der Vergangenheit verwendet, um die Zytologie der Blattpathogenentwicklung und der Wechselwirkungen zwischen Pflanzen und Pilzen zu untersuchen. Die Untersuchung von Infektionsereignissen in lebenden Wirtsgeweben in Echtzeit ohne Fixierung oder Klärung ist jedoch aufgrund technischer Probleme im Zusammenhang mit der Vorbereitung optisch transparenter Proben für die Bildgebung eine Herausforderung.
In den späten 1940er Jahren wurde ein Inokulationsprotokoll für die Inokulation mit abgelöster Blattscheide entwickelt, um die Resistenz lebender Reisepidermiszellen gegen den Reisblastenpilz Magnaporthe oryza6 hellfeldmikroskopisch zu untersuchen. In jüngerer Zeit wurden detaillierte molekulare, physiologische und zytologische Beobachtungen der Wirtsbesiedlung durch Colletotrichum– und Magnaporthe-Arten durch die Kombination modifizierter Versionen dieser Blattscheidenmethode mit Pilztransformanten, die fluoreszierende Proteine exprimieren, und leistungsstarken Live-Cell-Imaging-Protokollen, einschließlich Epifluoreszenz und konfokaler Mikroskopie, erheblich erleichtert 7,8,9,10.11,12,13.
In dieser Arbeit wird ein optimiertes Inokulationsprotokoll unter Verwendung von abgelösten Maisblattscheiden zur Beobachtung von Infektionsprozessen durch hemibiotrophe und nekrotrophe Blattpilzerreger beschrieben. Wir haben es speziell verwendet, um Colletotrichum graminicola (C. graminicola), den Erreger der Anthraknose-Blattfäule und Stängelfäule, und Stenocarpella maydis, die Diplodia-Blattfäule und Stängelfäule verursacht, zu untersuchen. Die Methode sollte jedoch auch auf andere hemibiotrophe und nekrotrophe Blattpilzpathogene anwendbar sein. Die zytologischen und physiologischen Reaktionen während der Infektions- und Kolonisationsereignisse in diesen herausgeschnittenen Blattscheiden ähneln denen in ganzen Blattspreiten12,14,15. Darüber hinaus ähnelt die hemibiotrophe Besiedlung von Scheidenepidermiszellen durch C. graminicola der Besiedlung von Stängelmarkzellen16,17. Abgelöste Hüllen zeigen eine größere Synchronizität und experimentelle Reproduzierbarkeit der Pilzpenetration und -besiedlung als Blattspreiten oder Stängelmarkgewebe 14,16,17,18. Die meisten Maissorten können für dieses Protokoll verwendet werden. Inzuchten oder Hybriden mit übermäßigen violetten Pigmenten in den Scheiden sind jedoch weniger geeignet, da die Pigmente die Bildgebung stören. Golden Jubilee Zuckermais war für unsere Studien besonders nützlich, da unbehandeltes Saatgut im Handel erhältlich ist, die Pflanzen sehr anfällig für viele Blattkrankheiten sind und im Gewächshaus gut wachsen. Die ersten Epidemien der Anthraknose-Stängelfäule in den Vereinigten Staaten führten in den 1970er Jahren zum Totalverlust der Zuckermaisernte in Indiana19,20. Diese Methode der Blattscheideninokulation kann angewendet werden, um das Pilzwachstum und die Pilzentwicklung in lebenden vs. lokal abgetöteten Pflanzenzellen direkt zu beobachten und zu quantifizieren, um Resistenzreaktionen in kompatiblen/inkompatiblen Reaktionen auf eine Pilzinfektion nachzuweisen und um Interaktionen zwischen Pilzstämmen auf derselben Scheide in Echtzeit zu testen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die hier beschriebene optimierte Blattscheideninokulationsmethode ist modifiziert von einem Originalprotokoll, das für Reisblattscheiden entwickelt wurde und auf Reisblattscheiden angewendet wurde 6,8,36. Es ermöglicht direkte, detaillierte Beobachtungen des Pilzwachstums und der Pilzentwicklung in lebenden Pflanzenzellen entweder mit Weitfeld- oder konfokaler Mikroskopie. Das Protokoll eignet sich für die Charakterisierung, …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren danken USDA-NIFA für die finanzielle Unterstützung (Fördernummern 2018-67013-28489 und 2020-70410-32901). Alle Meinungen, Erkenntnisse, Schlussfolgerungen oder Empfehlungen, die in diesem Manuskript zum Ausdruck gebracht werden, sind ausschließlich die der Autoren und spiegeln nicht unbedingt die Ansichten des US-Landwirtschaftsministeriums wider. Wir danken der brasilianischen Gaststudentin von Science Without Borders, Mayara de Silva, für die Bilder, die in Abbildung 6A und in Abbildung 7D zu sehen sind. Wir danken auch der Abteilung für Pflanzenpathologie an der University of Kentucky für den Zugang zu den konfokalen Mikroskopen von Olympus.
Materials
| Axiocam monochrome microscope camera | ZEISS | 426560-9010-000 | Compatible with the Axioplan 2 microscope; provides low read noise and high speed for live cell imaging |
| Axioplan 2 epifluorescence microscope | ZEISS | N/A | Allows live viewing and image/video capture of biological samples |
| Benchtop centrifuge 24 X 1.5/2 mL | Thermo Fisher Scientific | 75002431 | Sorvall Legend Micro 17; max speed: 13,300 rpm (17,000 x g) |
| Falcon bacteriological Petri dish with lid | Fisher Scientific | 08-757-105 | Polystyrene material; hydrophobic surface |
| Filter paper | Fisher Scientific | 09-920-115 | Whatman grade 1 for Petri plate moist chambers |
| FV 3000 laser scanning confocal microscope | Olympus | N/A | For visualization of fungal transformants' |
| Germination paper | Anchor Paper Co. | SD7615L | 76# heavy weight for plastic box moist chambers |
| Glass Petri dishes | VWR International | 75845-542 | Type 1 class A, 33 expansion borosilicate glass; complete set (cover + bottom), for Petri plate moist chambers |
| Glass wool | Ohio Valley Specialty Chemical | 3350 | For glass-wool filter units |
| Hemocytometer/Neubauer counting chamber and cover glass | VWR International | 15170-172 | 0.1 mm chamber depth; comes with two 0.4 mm cover glasses |
| Microscope coverslips | Fisher Scientific | 12-553-457 | Borosilicate glass; 100/Pk.; 22 mm length, 22 mm width |
| Maize cultivar Golden Jubilee seeds | West Coast Seeds Ltd., Delta, BC, Canada | CN361 | Matures in 95-105 days; seed type: F1 |
| Microcentrifuge tubes | USA Scientific | 1415-2500 | 1.5 mL capacity |
| Microscope slides | Fisher Scientific | 12-550-123 | Superfrost white tab slide; 76 mm length, 25 mm width |
| Oatmeal Agar (OA) | VWR International | 255210 | Difco Oatmeal Agar, BD; 500 g |
| Nail polish | Revlon | 43671 | Clear nail polish for sealing microscope slides; color 771 Clear |
| Non-skirted 96-well PCR plate | USA Sientific | 1402-9500 | 100 uL plate volume |
| Pestle for microcentrifuge tubes | USA Scientific | 1415-5390 | Conical tip; polypropylene material |
| PlanApo 60X/1,00 WLSM water objective | Olympus | 1-UB933 | Compatible with the Olympus FV 3000 confocal microscope |
| Potato Dextrose Agar (PDA) | VWR International | 90000-758 | Difco Potato Dextrose Media, BD; 500 g |
| Pro-Mix BX | Premium Horticulture Supply Co. | N/A | Premium general-purpose growing medium formulated to provide a balance of water retention and proper drainage |
| SC10 cone-tainers | Greenhouse Megastore | CN-SS-SC-10B | 1.5 inch diameter, 8.25 inch depth, and a volume of 164 mL |
| SC10 cone-tainers tray | Greenhouse Megastore | CN-SS-SCTR98 | 24 inch length x 12 inch width x 6.75 inch height; holds up to 98 of SC10 cone-tainers |
| Single edge razor blade | Thermo Fisher Scientific | 17-989-145 | AccuTec blade; steel material; 38 mm length blade |
| Storage containers/boxes with latch closure | Target | 002-02-0405 | Clear view storage boxes for rmoist chamber; outside dimensions: 23 5/8 inch x 16 3/8 inch x 6 1/2 inch; 32 qt. capacity |
References
- Cheng, Y., Yao, J., Zhang, H., Huang, L., Kang, Z. Cytological and molecular analysis of nonhost resistance in rice to wheat powdery mildew and leaf rust pathogens. Protoplasma. 252 (4), 1167-1179 (2015).
- Hickey, E. L., Coffey, M. D. A fine-structural study of the pea downy mildew fungus Peronospora pisi in its host Pisum sativum. Canadian Journal of Botany. 55 (23), 2845-2858 (1977).
- Wharton, P. S., Julian, A. M., O’Connell, R. J. Ultrastructure of the infection of Sorghum bicolor by Colletotrichum sublineolum. Phytopathology. 91 (2), 149-158 (2001).
- Latunde-Dada, A. O., et al. Infection process and identity of the hemibiotrophic anthracnose fungus (Colletotrichum destructivum O’Gara) from cowpea (Vigna unguiculata (L) Walp.). Mycological Research. 100 (9), 1133-1141 (1996).
- Bourett, T. M., Howard, R. J. In vitro development of penetration structures in the rice blast fungus Magnaporthe grisea. Canadian Journal of Botany. 68 (2), 329-342 (1990).
- Sakamoto, M. On the new method of sheath inoculation of rice plants with blast fungus, Pyricularia oryzae Cav., for the studying of the disease-resistant nature of the plant. Bulletin of the Institute for Agricultural Research, Tōhoku University. 1 (3), 120-129 (1949).
- Buiate, E. A., et al. A comparative genomic analysis of putative pathogenicity genes in the host-specific sibling species Colletotrichum graminicola and Colletotrichum sublineola. BMC genomics. 18 (1), 1-24 (2017).
- Kankanala, P., Czymmek, K., Valent, B. Roles for rice membrane dynamics and plasmodesmata during biotrophic invasion by the blast fungus. The Plant Cell. 19 (2), 706-724 (2007).
- Khang, C. H., et al. Translocation of Magnaporthe oryzae effectors into rice cells and their subsequent cell-to-cell movement. The Plant Cell. 22 (4), 1388-1403 (2010).
- Mosquera, G., Giraldo, M. C., Khang, C. H., Coughlan, S., Valent, B. Interaction transcriptome analysis identifies Magnaporthe oryzae BAS1-4 as biotrophy-associated secreted proteins in rice blast disease. The Plant Cell. 21 (4), 1273-1290 (2009).
- Sakulkoo, W., et al. A single fungal MAP kinase controls plant cell-to-cell invasion by the rice blast fungus. Science. 359 (6382), 1399-1403 (2018).
- Torres, M. F., Cuadros, D. F., Vaillancourt, L. J. Evidence for a diffusible factor that induces susceptibility in the Colletotrichum-maize disease interaction. Molecular Plant Pathology. 15 (1), 80-93 (2014).
- Valent, B., Khang, C. H. Recent advances in rice blast effector research. Current Opinion in Plant Biology. 13 (4), 434-441 (2010).
- Mims, C. W., Vaillancourt, L. J. Ultrastructural characterization of infection and colonization of maize leaves by Colletotrichum graminicola, and by a C. graminicola pathogenicity mutant. Phytopathology. 92 (7), 803-812 (2002).
- Vargas, W. A., et al. Plant defense mechanisms are activated during biotrophic and necrotrophic development of Colletotricum graminicola in maize. Plant Physiology. 158 (3), 1342-1358 (2012).
- Venard, C., Vaillancourt, L. Colonization of fiber cells by Colletotrichum graminicola in wounded maize stalks. Phytopathology. 97 (4), 438-447 (2007).
- Venard, C., Vaillancourt, L. Penetration and colonization of unwounded maize tissues by the maize anthracnose pathogen Colletotrichum graminicola and the related nonpathogen C. sublineolum. Mycologia. 99 (3), 368-377 (2007).
- Berruyer, R., Poussier, S., Kankanala, P., Mosquera, G., Valent, B. Quantitative and qualitative influence of inoculation methods on in planta growth of rice blast fungus. Phytopathology. 96 (4), 346-355 (2006).
- Belisário, R., Robertson, A. E., Vaillancourt, L. J. Maize anthracnose stalk rot in the genomic era. Plant Disease. 106 (9), 2281-2298 (2022).
- Warren, H. L., Nicholson, R. L., Ullstrup, A. J., Sharvelle, E. G. Observations of Colletotrichum graminicola on sweet corn in Indiana. Plant Disease Reporter. 57, 143-144 (1973).
- Ritchie, S. W., Hanway, J. J., Benson, G. O. How a corn plant develops. Special Report, Iowa State University. 48, (1986).
- Tuite, J. . Plant pathological methods: fungi and bacteria. , (1969).
- Wicklow, D. T., Rogers, K. D., Dowd, P. F., Gloer, J. B. Bioactive metabolites from Stenocarpella maydis, a stalk and ear rot pathogen of maize. Fungal Biology. 115 (2), 133-142 (2011).
- Daudi, A., O’Brien, J. A. Detection of hydrogen peroxide by DAB staining in Arabidopsis leaves. Bio-protocol. 2 (18), e263-e263 (2012).
- Benhamou, R. I., Jaber, Q. Z., Herzog, I. M., Roichman, Y., Fridman, M. Fluorescent tracking of the endoplasmic reticulum in live pathogenic fungal cells. ACS Chemical Biology. 13 (12), 3325-3332 (2018).
- Lorang, J. M., et al. fluorescent protein is lighting up fungal biology. Applied and Environmental Microbiology. 67 (5), 1987-1994 (2001).
- Liu, C. Y., Zhu, J., Xie, Z. Visualizing yeast organelles with fluorescent protein markers. JoVE (Journal of Visualized Experiments). 182, e63846 (2022).
- Westermann, B., Neupert, W. Mitochondria-targeted green fluorescent proteins: convenient tools for the study of organelle biogenesis in Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 16 (15), 1421-1427 (2000).
- Lee, A. S. The ER chaperone and signaling regulator GRP78/BiP as a monitor of endoplasmic reticulum stress. Methods. 35 (4), 373-381 (2005).
- Krishnakumar, V., et al. A maize database resource that captures tissue-specific and subcellular-localized gene expression, via fluorescent tags and confocal imaging (Maize Cell Genomics Database). Plant and Cell Physiology. 56 (1), e12-e12 (2015).
- Wu, Q., Luo, A., Zadrozny, T., Sylvester, A., Jackson, D. Fluorescent protein marker lines in maize: generation and applications. International Journal of Developmental Biology. 57 (6-7-8), 535-543 (2013).
- O’Connell, R. J., et al. Lifestyle transitions in plant pathogenic Colletotrichum fungi deciphered by genome and transcriptome analyses. Nature Genetics. 44 (9), 1060-1065 (2012).
- Torres, M. F., et al. A Colletotrichum graminicola mutant deficient in the establishment of biotrophy reveals early transcriptional events in the maize anthracnose disease interaction. BMC Genomics. 17 (202), 1-24 (2016).
- Andrie, R. M., Martinez, J. P., Ciuffetti, L. M. Development of ToxA and ToxB promoter-driven fluorescent protein expression vectors for use in filamentous ascomycetes. Mycologia. 97 (5), 1152-1161 (2005).
- Gordon, C. L., et al. Glucoamylase:: green fluorescent protein fusions to monitor protein secretion in Aspergillus niger. Microbiology. 146 (2), 415-426 (2000).
- Koga, H., Dohi, K., Nakayachi, O., Mori, M. A novel inoculation method of Magnaporthe grisea for cytological observation of the infection process using intact leaf sheaths of rice plants. Physiological and Molecular Plant Pathology. 64 (2), 67-72 (2004).
- Xavier, K. V., Pfeiffer, T., Parreira, D. F., Chopra, S., Vaillancourt, L. Aggressiveness of Colletotrichum sublineola strains from Sorghum bicolor and S. halepense to sweet sorghum variety Sugar Drip, and their impact on yield. Plant Disease. 101 (9), 1578-1587 (2017).
