Mantar yaprakları mısır patojenlerinin neden olduğu enfeksiyonun canlı hücre görüntülemesi için müstakil mısır kılıfları
Summary
Bu makale, mantar bitki patojenleri ile mısır etkileşimlerinin tekrarlanabilir sitolojik, fizyolojik ve moleküler çalışmaları için ayrılmış mısır yaprağı kılıflarını kullanan optimize edilmiş bir aşılama protokolünü detaylandırmaktadır. Yaprak kılıfları, sabitlenmemiş dokularda canlı bitki ve mantar arasındaki hücresel etkileşimlerin gerçek zamanlı gözlemini kolaylaştırır.
Abstract
Mısır yaprağı kılıflarını hemibiotrofik ve nekrotrofik yaprak patojenik mantarlarla aşılamak için bir protokolü optimize ettik. Yöntem, orijinal olarak pirinç yaprağı kılıflarına uygulanandan modifiye edilmiştir ve canlı bitki hücrelerinde mantar büyümesi ve gelişiminin doğrudan mikroskobik gözlemine izin verir. İki adet tam yaprak boğazı ile mısır fidelerinden toplanan yaprak kılıfları, 20 μL damla 5 x 105 spor/mL mantar sporu süspansiyonu ile aşılanır ve sürekli floresan ışık altında 23 °C’de nem odalarında inkübe edilir. 24-72 saat sonra, kimyasal fiksasyon veya temizleme gerektirmeden doğrudan görüntülenebilen optik olarak berrak bir numune olan tek bir epidermal hücre tabakası bırakmak için fazla doku bir tıraş bıçağıyla çıkarılır. Bitki ve mantar hücreleri deney süresince canlı kalır ve etkileşimler gerçek zamanlı olarak görselleştirilebilir. Kılıflar, enfeksiyon ve kolonizasyon sırasında konakçı ve patojen hücrelerin gelişimsel sitolojisini ve canlılığını incelemek için boyanabilir veya plazmolize tabi tutulabilir. Floresan proteinleri eksprese etmek için dönüştürülen mantar suşları, daha fazla çözünürlük için ve rekabetçi veya sinerjik etkileşimlerin değerlendirilmesini kolaylaştırmak için kılıflar üzerine aşılanabilir veya birlikte aşılanabilir. Floresan füzyon proteinlerini eksprese eden mantar suşları, plantadaki bu bireysel proteinlerin üretimini ve hedeflenmesini izlemek ve ölçmek için kullanılabilir. Aşılanmış kılıf dokuları, nükleik asitleri, proteinleri veya metabolitleri karakterize etmek için ekstrakte edilebilir. Bu kılıf tahlillerinin kullanımı, mısırda mantar patojenitesi mekanizmalarının ve ayrıca patojeniteye katkıda bulunan mantar protein efektörlerinin ve ikincil metabolitlerin ayrıntılı çalışmalarını büyük ölçüde ilerletmiştir.
Introduction
Hücresel düzeyde mekansal ve zamansal analizler, mantar-bitki etkileşimlerinin fizyolojisini ve sitolojisini anlamak için kritik öneme sahiptir. Kimyasal olarak sabitlenmiş 1,2,3 veya temizlenmiş ve boyanmış4 yaprak dokuları ve yapay zarlar5, geçmişte yaprak patojen gelişiminin sitolojisini ve bitki-mantar etkileşimlerini araştırmak için kullanılmıştır. Bununla birlikte, canlı konakçı dokulardaki enfeksiyon olaylarının fiksasyon veya temizleme olmadan gerçek zamanlı olarak araştırılması, görüntüleme için optik olarak şeffaf örneklerin hazırlanmasıyla ilgili teknik sorunlar nedeniyle zordur.
1940’ların sonlarında, canlı pirinç epidermal hücrelerinin pirinç patlaması mantarı Magnaporthe oryza6’ya karşı direncinin parlak alan mikroskobik araştırması için müstakil bir yaprak kılıfı aşılama protokolü geliştirilmiştir. Daha yakın zamanlarda, Colletotrichum ve Magnaporthe türleri tarafından konak kolonizasyonunun ayrıntılı moleküler, fizyolojik ve sitolojik gözlemleri, bu yaprak kılıfı yönteminin modifiye edilmiş versiyonlarının floresan proteinleri eksprese eden mantar dönüştürücüleri ve epifloresan ve konfokal mikroskopi dahil olmak üzere yüksek performanslı canlı hücre görüntüleme protokolleri ile birleştirilmesiyle büyük ölçüde kolaylaştırılmıştır 7,8,9,10,11,12,13.
Bu makale, hemibiyotrofik ve nekrotrofik yaprak mantar patojenleri tarafından enfeksiyon süreçlerinin gözlemlenmesi için ayrılmış mısır yaprağı kılıfları kullanılarak optimize edilmiş bir aşılama protokolünü detaylandırmaktadır. Antraknoz yaprak yanıklığı ve sap çürüklüğünün etken maddesi olan Colletotrichum graminicola (C. graminicola) ve Diplodia yaprak yanıklığına ve sap çürümesine neden olan Stenocarpella maydis’i incelemek için özel olarak kullandık. Bununla birlikte, yöntem diğer hemibiotrofik ve nekrotrofik yaprak mantar patojenlerine uygulanabilir olmalıdır. Bu eksize edilen yaprak kılıflarında enfeksiyon ve kolonizasyon olayları sırasındaki sitolojik ve fizyolojik yanıtlar, tüm yaprak bıçaklarındakilerebenzerdir 12,14,15. Ayrıca, kılıf epidermal hücrelerinin C. graminicola tarafından hemibiyotrofik kolonizasyonu, sap öz hücrelerininkolonizasyonuna benzer 16,17. Müstakil kılıflar, mantar penetrasyonu ve kolonizasyonunun yaprak bıçaklarından veya sap özü dokularından daha fazla eşzamanlılık ve deneysel tekrarlanabilirlik gösterir14,16,17,18. Çoğu mısır çeşidi bu protokol için kullanılabilir. Bununla birlikte, kılıflarda aşırı mor pigmentlere sahip akrabalı veya melezler, pigmentler görüntülemeye müdahale ettiği için daha az uygundur. Golden Jubilee tatlı mısır, çalışmalarımız için özellikle yararlı olmuştur, çünkü işlenmemiş tohumlar ticari olarak temin edilebilir, bitkiler birçok yaprak hastalığına karşı oldukça hassastır ve serada iyi büyürler. Amerika Birleşik Devletleri’ndeki ilk antraknoz sap çürüklüğü salgınları, 1970’lerde Indiana’da tatlı mısır mahsullerinin toplam kaybına neden oldu19,20. Bu yaprak kılıfı aşılama yöntemi, canlı ve yerel olarak öldürülmüş bitki hücrelerinde mantar büyümesini ve gelişimini doğrudan gözlemlemek ve ölçmek, mantar enfeksiyonuna uyumlu/uyumsuz yanıtlarda direnç reaksiyonlarını göstermek ve aynı kılıf üzerindeki mantar suşları arasındaki etkileşimleri gerçek zamanlı olarak test etmek için uygulanabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada açıklanan optimize edilmiş yaprak kılıfı aşılama yöntemi, pirinç yaprağı kılıfları6,8,36 için geliştirilmiş ve uygulanmış olan orijinal bir protokolden değiştirilmiştir. Geniş alan veya konfokal mikroskopi ile canlı bitki hücrelerinde mantar büyümesi ve gelişiminin doğrudan, ayrıntılı gözlemlerine izin verir. Protokol, mısır kolonizasyonu sırasında, uyumlu ve uyumsuz etkileşimler sı…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar mali destekleri için USDA-NIFA’ya teşekkür eder (hibe numaraları 2018-67013-28489 ve 2020-70410-32901). Bu yazıda ifade edilen herhangi bir görüş, bulgu, sonuç veya öneri yalnızca yazarlara aittir ve ABD Tarım Bakanlığı’nın görüşlerini yansıtmayabilir. Brezilya’dan Sınır Tanımayan Bilim misafir öğrencisi Mayara de Silva’ya Şekil 6A ve Şekil 7D’de yer alan görüntüler için teşekkür ederiz. Ayrıca, Olympus konfokal mikroskoplarına erişim sağladığı için Kentucky Üniversitesi Bitki Patolojisi Bölümü’ne de teşekkür ederiz.
Materials
| Axiocam monochrome microscope camera | ZEISS | 426560-9010-000 | Compatible with the Axioplan 2 microscope; provides low read noise and high speed for live cell imaging |
| Axioplan 2 epifluorescence microscope | ZEISS | N/A | Allows live viewing and image/video capture of biological samples |
| Benchtop centrifuge 24 X 1.5/2 mL | Thermo Fisher Scientific | 75002431 | Sorvall Legend Micro 17; max speed: 13,300 rpm (17,000 x g) |
| Falcon bacteriological Petri dish with lid | Fisher Scientific | 08-757-105 | Polystyrene material; hydrophobic surface |
| Filter paper | Fisher Scientific | 09-920-115 | Whatman grade 1 for Petri plate moist chambers |
| FV 3000 laser scanning confocal microscope | Olympus | N/A | For visualization of fungal transformants' |
| Germination paper | Anchor Paper Co. | SD7615L | 76# heavy weight for plastic box moist chambers |
| Glass Petri dishes | VWR International | 75845-542 | Type 1 class A, 33 expansion borosilicate glass; complete set (cover + bottom), for Petri plate moist chambers |
| Glass wool | Ohio Valley Specialty Chemical | 3350 | For glass-wool filter units |
| Hemocytometer/Neubauer counting chamber and cover glass | VWR International | 15170-172 | 0.1 mm chamber depth; comes with two 0.4 mm cover glasses |
| Microscope coverslips | Fisher Scientific | 12-553-457 | Borosilicate glass; 100/Pk.; 22 mm length, 22 mm width |
| Maize cultivar Golden Jubilee seeds | West Coast Seeds Ltd., Delta, BC, Canada | CN361 | Matures in 95-105 days; seed type: F1 |
| Microcentrifuge tubes | USA Scientific | 1415-2500 | 1.5 mL capacity |
| Microscope slides | Fisher Scientific | 12-550-123 | Superfrost white tab slide; 76 mm length, 25 mm width |
| Oatmeal Agar (OA) | VWR International | 255210 | Difco Oatmeal Agar, BD; 500 g |
| Nail polish | Revlon | 43671 | Clear nail polish for sealing microscope slides; color 771 Clear |
| Non-skirted 96-well PCR plate | USA Sientific | 1402-9500 | 100 uL plate volume |
| Pestle for microcentrifuge tubes | USA Scientific | 1415-5390 | Conical tip; polypropylene material |
| PlanApo 60X/1,00 WLSM water objective | Olympus | 1-UB933 | Compatible with the Olympus FV 3000 confocal microscope |
| Potato Dextrose Agar (PDA) | VWR International | 90000-758 | Difco Potato Dextrose Media, BD; 500 g |
| Pro-Mix BX | Premium Horticulture Supply Co. | N/A | Premium general-purpose growing medium formulated to provide a balance of water retention and proper drainage |
| SC10 cone-tainers | Greenhouse Megastore | CN-SS-SC-10B | 1.5 inch diameter, 8.25 inch depth, and a volume of 164 mL |
| SC10 cone-tainers tray | Greenhouse Megastore | CN-SS-SCTR98 | 24 inch length x 12 inch width x 6.75 inch height; holds up to 98 of SC10 cone-tainers |
| Single edge razor blade | Thermo Fisher Scientific | 17-989-145 | AccuTec blade; steel material; 38 mm length blade |
| Storage containers/boxes with latch closure | Target | 002-02-0405 | Clear view storage boxes for rmoist chamber; outside dimensions: 23 5/8 inch x 16 3/8 inch x 6 1/2 inch; 32 qt. capacity |
References
- Cheng, Y., Yao, J., Zhang, H., Huang, L., Kang, Z. Cytological and molecular analysis of nonhost resistance in rice to wheat powdery mildew and leaf rust pathogens. Protoplasma. 252 (4), 1167-1179 (2015).
- Hickey, E. L., Coffey, M. D. A fine-structural study of the pea downy mildew fungus Peronospora pisi in its host Pisum sativum. Canadian Journal of Botany. 55 (23), 2845-2858 (1977).
- Wharton, P. S., Julian, A. M., O’Connell, R. J. Ultrastructure of the infection of Sorghum bicolor by Colletotrichum sublineolum. Phytopathology. 91 (2), 149-158 (2001).
- Latunde-Dada, A. O., et al. Infection process and identity of the hemibiotrophic anthracnose fungus (Colletotrichum destructivum O’Gara) from cowpea (Vigna unguiculata (L) Walp.). Mycological Research. 100 (9), 1133-1141 (1996).
- Bourett, T. M., Howard, R. J. In vitro development of penetration structures in the rice blast fungus Magnaporthe grisea. Canadian Journal of Botany. 68 (2), 329-342 (1990).
- Sakamoto, M. On the new method of sheath inoculation of rice plants with blast fungus, Pyricularia oryzae Cav., for the studying of the disease-resistant nature of the plant. Bulletin of the Institute for Agricultural Research, Tōhoku University. 1 (3), 120-129 (1949).
- Buiate, E. A., et al. A comparative genomic analysis of putative pathogenicity genes in the host-specific sibling species Colletotrichum graminicola and Colletotrichum sublineola. BMC genomics. 18 (1), 1-24 (2017).
- Kankanala, P., Czymmek, K., Valent, B. Roles for rice membrane dynamics and plasmodesmata during biotrophic invasion by the blast fungus. The Plant Cell. 19 (2), 706-724 (2007).
- Khang, C. H., et al. Translocation of Magnaporthe oryzae effectors into rice cells and their subsequent cell-to-cell movement. The Plant Cell. 22 (4), 1388-1403 (2010).
- Mosquera, G., Giraldo, M. C., Khang, C. H., Coughlan, S., Valent, B. Interaction transcriptome analysis identifies Magnaporthe oryzae BAS1-4 as biotrophy-associated secreted proteins in rice blast disease. The Plant Cell. 21 (4), 1273-1290 (2009).
- Sakulkoo, W., et al. A single fungal MAP kinase controls plant cell-to-cell invasion by the rice blast fungus. Science. 359 (6382), 1399-1403 (2018).
- Torres, M. F., Cuadros, D. F., Vaillancourt, L. J. Evidence for a diffusible factor that induces susceptibility in the Colletotrichum-maize disease interaction. Molecular Plant Pathology. 15 (1), 80-93 (2014).
- Valent, B., Khang, C. H. Recent advances in rice blast effector research. Current Opinion in Plant Biology. 13 (4), 434-441 (2010).
- Mims, C. W., Vaillancourt, L. J. Ultrastructural characterization of infection and colonization of maize leaves by Colletotrichum graminicola, and by a C. graminicola pathogenicity mutant. Phytopathology. 92 (7), 803-812 (2002).
- Vargas, W. A., et al. Plant defense mechanisms are activated during biotrophic and necrotrophic development of Colletotricum graminicola in maize. Plant Physiology. 158 (3), 1342-1358 (2012).
- Venard, C., Vaillancourt, L. Colonization of fiber cells by Colletotrichum graminicola in wounded maize stalks. Phytopathology. 97 (4), 438-447 (2007).
- Venard, C., Vaillancourt, L. Penetration and colonization of unwounded maize tissues by the maize anthracnose pathogen Colletotrichum graminicola and the related nonpathogen C. sublineolum. Mycologia. 99 (3), 368-377 (2007).
- Berruyer, R., Poussier, S., Kankanala, P., Mosquera, G., Valent, B. Quantitative and qualitative influence of inoculation methods on in planta growth of rice blast fungus. Phytopathology. 96 (4), 346-355 (2006).
- Belisário, R., Robertson, A. E., Vaillancourt, L. J. Maize anthracnose stalk rot in the genomic era. Plant Disease. 106 (9), 2281-2298 (2022).
- Warren, H. L., Nicholson, R. L., Ullstrup, A. J., Sharvelle, E. G. Observations of Colletotrichum graminicola on sweet corn in Indiana. Plant Disease Reporter. 57, 143-144 (1973).
- Ritchie, S. W., Hanway, J. J., Benson, G. O. How a corn plant develops. Special Report, Iowa State University. 48, (1986).
- Tuite, J. . Plant pathological methods: fungi and bacteria. , (1969).
- Wicklow, D. T., Rogers, K. D., Dowd, P. F., Gloer, J. B. Bioactive metabolites from Stenocarpella maydis, a stalk and ear rot pathogen of maize. Fungal Biology. 115 (2), 133-142 (2011).
- Daudi, A., O’Brien, J. A. Detection of hydrogen peroxide by DAB staining in Arabidopsis leaves. Bio-protocol. 2 (18), e263-e263 (2012).
- Benhamou, R. I., Jaber, Q. Z., Herzog, I. M., Roichman, Y., Fridman, M. Fluorescent tracking of the endoplasmic reticulum in live pathogenic fungal cells. ACS Chemical Biology. 13 (12), 3325-3332 (2018).
- Lorang, J. M., et al. fluorescent protein is lighting up fungal biology. Applied and Environmental Microbiology. 67 (5), 1987-1994 (2001).
- Liu, C. Y., Zhu, J., Xie, Z. Visualizing yeast organelles with fluorescent protein markers. JoVE (Journal of Visualized Experiments). 182, e63846 (2022).
- Westermann, B., Neupert, W. Mitochondria-targeted green fluorescent proteins: convenient tools for the study of organelle biogenesis in Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 16 (15), 1421-1427 (2000).
- Lee, A. S. The ER chaperone and signaling regulator GRP78/BiP as a monitor of endoplasmic reticulum stress. Methods. 35 (4), 373-381 (2005).
- Krishnakumar, V., et al. A maize database resource that captures tissue-specific and subcellular-localized gene expression, via fluorescent tags and confocal imaging (Maize Cell Genomics Database). Plant and Cell Physiology. 56 (1), e12-e12 (2015).
- Wu, Q., Luo, A., Zadrozny, T., Sylvester, A., Jackson, D. Fluorescent protein marker lines in maize: generation and applications. International Journal of Developmental Biology. 57 (6-7-8), 535-543 (2013).
- O’Connell, R. J., et al. Lifestyle transitions in plant pathogenic Colletotrichum fungi deciphered by genome and transcriptome analyses. Nature Genetics. 44 (9), 1060-1065 (2012).
- Torres, M. F., et al. A Colletotrichum graminicola mutant deficient in the establishment of biotrophy reveals early transcriptional events in the maize anthracnose disease interaction. BMC Genomics. 17 (202), 1-24 (2016).
- Andrie, R. M., Martinez, J. P., Ciuffetti, L. M. Development of ToxA and ToxB promoter-driven fluorescent protein expression vectors for use in filamentous ascomycetes. Mycologia. 97 (5), 1152-1161 (2005).
- Gordon, C. L., et al. Glucoamylase:: green fluorescent protein fusions to monitor protein secretion in Aspergillus niger. Microbiology. 146 (2), 415-426 (2000).
- Koga, H., Dohi, K., Nakayachi, O., Mori, M. A novel inoculation method of Magnaporthe grisea for cytological observation of the infection process using intact leaf sheaths of rice plants. Physiological and Molecular Plant Pathology. 64 (2), 67-72 (2004).
- Xavier, K. V., Pfeiffer, T., Parreira, D. F., Chopra, S., Vaillancourt, L. Aggressiveness of Colletotrichum sublineola strains from Sorghum bicolor and S. halepense to sweet sorghum variety Sugar Drip, and their impact on yield. Plant Disease. 101 (9), 1578-1587 (2017).
