Vainas de maíz desprendidas para la obtención de imágenes de células vivas de la infección por patógenos fúngicos foliares del maíz
Summary
En este manuscrito se detalla un protocolo de inoculación optimizado que utiliza vainas de hojas de maíz desprendidas para estudios citológicos, fisiológicos y moleculares reproducibles de las interacciones del maíz con los patógenos fúngicos de las plantas. Las vainas de las hojas facilitan la observación en tiempo real de las interacciones celulares entre la planta viva y el hongo en tejidos no fijados.
Abstract
Hemos optimizado un protocolo para inocular vainas foliares de maíz con hongos patógenos foliares hemibiotróficos y necrótrofos. El método es una modificación de uno aplicado originalmente a las vainas de las hojas de arroz y permite la observación microscópica directa del crecimiento y desarrollo de hongos en células vegetales vivas. Las vainas foliares recolectadas de plántulas de maíz con dos collares foliares completamente emergidos se inoculan con 20 μL de suspensiones de esporas fúngicas de 5 x 105 esporas/mL y se incuban en cámaras de humedad a 23 °C bajo luz fluorescente continua. Después de 24-72 h, el exceso de tejido se elimina con una cuchilla de afeitar para dejar una sola capa de células epidérmicas, una muestra ópticamente clara que se puede obtener directamente sin necesidad de fijación química o aclaramiento. Las células vegetales y fúngicas permanecen vivas durante la duración del experimento y las interacciones se pueden visualizar en tiempo real. Las vainas pueden teñirse o someterse a plasmólisis para estudiar la citología del desarrollo y la viabilidad de las células huésped y patógena durante la infección y la colonización. Las cepas fúngicas transformadas para expresar proteínas fluorescentes pueden ser inoculadas o co-inoculadas en las vainas para aumentar la resolución y facilitar la evaluación de interacciones competitivas o sinérgicas. Las cepas fúngicas que expresan proteínas de fusión fluorescentes se pueden utilizar para rastrear y cuantificar la producción y el objetivo de estas proteínas individuales en la planta. Los tejidos de la vaina inoculados se pueden extraer para caracterizar ácidos nucleicos, proteínas o metabolitos. El uso de estos ensayos de vaina ha hecho avanzar en gran medida los estudios detallados de los mecanismos de patogenicidad fúngica en el maíz y también de los efectores proteicos fúngicos y los metabolitos secundarios que contribuyen a la patogenicidad.
Introduction
Los análisis espaciales y temporales a nivel celular son fundamentales para comprender la fisiología y la citología de las interacciones entre hongos y plantas. Los tejidos foliares que han sido fijados químicamente 1,2,3 o aclarados y teñidos4, así como las membranas artificiales5, se han utilizado en el pasado para investigar la citología del desarrollo de patógenos foliares y las interacciones planta-hongo. Sin embargo, la investigación de eventos de infección en tejidos vivos del huésped en tiempo real sin fijación o aclaramiento es un desafío debido a problemas técnicos relacionados con la preparación de muestras ópticamente transparentes para la obtención de imágenes.
A finales de la década de 1940 se desarrolló un protocolo de inoculación de la vaina de la hoja separada para la investigación microscópica de campo claro de la resistencia de las células epidérmicas vivas del arroz al hongo del brusone del arroz Magnaporthe oryza6. Más recientemente, las observaciones moleculares, fisiológicas y citológicas detalladas de la colonización del huésped por las especies Colletotrichum y Magnaporthe se han facilitado en gran medida mediante la combinación de versiones modificadas de este método de vaina foliar con transformadores fúngicos que expresan proteínas fluorescentes y protocolos de imágenes de células vivas de alto rendimiento, incluida la epifluorescencia y la microscopía confocal 7,8,9,10.11,12,13.
En este trabajo se detalla un protocolo de inoculación optimizado utilizando vainas foliares de maíz separadas para la observación de procesos de infección por patógenos fúngicos foliares hemibiotróficos y necrótrofos. Lo hemos utilizado específicamente para estudiar Colletotrichum graminicola (C. graminicola), el agente causal del tizón de la hoja y la pudrición del tallo de la antracnosis, y Stenocarpella maydis, que causa el tizón de la hoja y la pudrición del tallo por Diplodia. Sin embargo, el método debe ser aplicable a otros patógenos fúngicos foliares hemibiotróficos y necrótrofos. Las respuestas citológicas y fisiológicas durante los eventos de infección y colonización en estas vainas foliares extirpadas son similares a las de las láminas foliares enteras12,14,15. Además, la colonización hemibiotrófica de las células epidérmicas de la vaina por C. graminicola es similar a la colonización de las células de la médula del tallo16,17. Las vainas desprendidas muestran mayor sincronicidad y reproducibilidad experimental de la penetración y colonización fúngica que las láminas foliares o los tejidos de la médula del tallo14,16,17,18. La mayoría de las variedades de maíz se pueden utilizar para este protocolo. Sin embargo, los endogámicos o híbridos con exceso de pigmentos púrpuras en las vainas son menos adecuados, ya que los pigmentos interfieren con las imágenes. El maíz dulce del Jubileo de Oro ha sido particularmente útil para nuestros estudios porque las semillas no tratadas están disponibles comercialmente, las plantas son altamente susceptibles a muchas enfermedades foliares y crecen bien en el invernadero. Las primeras epidemias de pudrición del tallo por antracnosis en los Estados Unidos provocaron la pérdida total de las cosechas de maíz dulce en Indiana en la década de 197019,20. Este método de inoculación de la vaina foliar se puede aplicar para observar y cuantificar directamente el crecimiento y desarrollo de hongos en células vegetales vivas frente a células vegetales muertas localmente, para demostrar reacciones de resistencia en respuestas compatibles/incompatibles a la infección fúngica y para probar las interacciones entre cepas fúngicas en la misma vaina en tiempo real.
Protocol
Representative Results
Discussion
El método optimizado de inoculación de la vaina foliar descrito aquí es una modificación de un protocolo original que se desarrolló y se ha aplicado a las vainas foliares de arroz 6,8,36. Permite observaciones directas y detalladas del crecimiento y desarrollo de hongos en células vegetales vivas con microscopía de campo amplio o confocal. El protocolo es adecuado para la caracterización, comparación y cuantificación d…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores agradecen al USDA-NIFA por su apoyo financiero (números de subvención 2018-67013-28489 y 2020-70410-32901). Todas las opiniones, hallazgos, conclusiones o recomendaciones expresadas en este manuscrito pertenecen exclusivamente a los autores y no reflejan necesariamente los puntos de vista del Departamento de Agricultura de los Estados Unidos. Agradecemos a la estudiante visitante de Ciencia Sin Fronteras de Brasil, Mayara de Silva, por las imágenes que aparecen en la Figura 6A y en la Figura 7D. También reconocemos al Departamento de Patología Vegetal de la Universidad de Kentucky por proporcionar acceso a los microscopios confocales Olympus.
Materials
| Axiocam monochrome microscope camera | ZEISS | 426560-9010-000 | Compatible with the Axioplan 2 microscope; provides low read noise and high speed for live cell imaging |
| Axioplan 2 epifluorescence microscope | ZEISS | N/A | Allows live viewing and image/video capture of biological samples |
| Benchtop centrifuge 24 X 1.5/2 mL | Thermo Fisher Scientific | 75002431 | Sorvall Legend Micro 17; max speed: 13,300 rpm (17,000 x g) |
| Falcon bacteriological Petri dish with lid | Fisher Scientific | 08-757-105 | Polystyrene material; hydrophobic surface |
| Filter paper | Fisher Scientific | 09-920-115 | Whatman grade 1 for Petri plate moist chambers |
| FV 3000 laser scanning confocal microscope | Olympus | N/A | For visualization of fungal transformants' |
| Germination paper | Anchor Paper Co. | SD7615L | 76# heavy weight for plastic box moist chambers |
| Glass Petri dishes | VWR International | 75845-542 | Type 1 class A, 33 expansion borosilicate glass; complete set (cover + bottom), for Petri plate moist chambers |
| Glass wool | Ohio Valley Specialty Chemical | 3350 | For glass-wool filter units |
| Hemocytometer/Neubauer counting chamber and cover glass | VWR International | 15170-172 | 0.1 mm chamber depth; comes with two 0.4 mm cover glasses |
| Microscope coverslips | Fisher Scientific | 12-553-457 | Borosilicate glass; 100/Pk.; 22 mm length, 22 mm width |
| Maize cultivar Golden Jubilee seeds | West Coast Seeds Ltd., Delta, BC, Canada | CN361 | Matures in 95-105 days; seed type: F1 |
| Microcentrifuge tubes | USA Scientific | 1415-2500 | 1.5 mL capacity |
| Microscope slides | Fisher Scientific | 12-550-123 | Superfrost white tab slide; 76 mm length, 25 mm width |
| Oatmeal Agar (OA) | VWR International | 255210 | Difco Oatmeal Agar, BD; 500 g |
| Nail polish | Revlon | 43671 | Clear nail polish for sealing microscope slides; color 771 Clear |
| Non-skirted 96-well PCR plate | USA Sientific | 1402-9500 | 100 uL plate volume |
| Pestle for microcentrifuge tubes | USA Scientific | 1415-5390 | Conical tip; polypropylene material |
| PlanApo 60X/1,00 WLSM water objective | Olympus | 1-UB933 | Compatible with the Olympus FV 3000 confocal microscope |
| Potato Dextrose Agar (PDA) | VWR International | 90000-758 | Difco Potato Dextrose Media, BD; 500 g |
| Pro-Mix BX | Premium Horticulture Supply Co. | N/A | Premium general-purpose growing medium formulated to provide a balance of water retention and proper drainage |
| SC10 cone-tainers | Greenhouse Megastore | CN-SS-SC-10B | 1.5 inch diameter, 8.25 inch depth, and a volume of 164 mL |
| SC10 cone-tainers tray | Greenhouse Megastore | CN-SS-SCTR98 | 24 inch length x 12 inch width x 6.75 inch height; holds up to 98 of SC10 cone-tainers |
| Single edge razor blade | Thermo Fisher Scientific | 17-989-145 | AccuTec blade; steel material; 38 mm length blade |
| Storage containers/boxes with latch closure | Target | 002-02-0405 | Clear view storage boxes for rmoist chamber; outside dimensions: 23 5/8 inch x 16 3/8 inch x 6 1/2 inch; 32 qt. capacity |
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