Отдельно взятые оболочки кукурузы для визуализации живых клеток инфекции, вызванной грибковыми листовыми патогенами кукурузы
Summary
В данной рукописи подробно описан оптимизированный протокол инокуляции, в котором для воспроизводимых цитологических, физиологических и молекулярных исследований взаимодействия кукурузы с грибковыми патогенами растений используются отдельные оболочки листьев кукурузы. Влагалища листьев облегчают наблюдение в режиме реального времени за клеточными взаимодействиями между живым растением и грибом в нефиксированных тканях.
Abstract
Оптимизирован протокол инокуляции влагалищ листьев кукурузы гемибиотрофными и некротрофными листовыми патогенными грибами. Этот метод является модификацией по сравнению с методом, первоначально примененным к влагалищу рисовых листьев, и позволяет проводить прямые микроскопические наблюдения за ростом и развитием грибов в живых клетках растений. Влагалища листьев, собранные с проростков кукурузы с двумя полностью раскрывшимися листовыми шейками, инокулируют 20 мкл капель суспензий спор грибов 5 x 105 спор /мл и инкубируют во влажных камерах при температуре 23 °C при непрерывном флуоресцентном свете. Через 24-72 ч лишняя ткань удаляется лезвием бритвы, оставляя один слой клеток эпидермиса, оптически чистый образец, который можно визуализировать непосредственно без необходимости химической фиксации или очистки. Клетки растений и грибов остаются живыми в течение всего эксперимента, а взаимодействия могут быть визуализированы в режиме реального времени. Оболочки могут быть окрашены или подвергнуты плазмолизу для изучения цитологии развития и жизнеспособности клеток хозяина и патогена во время инфекции и колонизации. Штаммы грибов, трансформируемые для экспрессии флуоресцентных белков, могут быть инокулированы или коинокулированы на оболочки для повышения разрешения и облегчения оценки конкурентных или синергетических взаимодействий. Штаммы грибов, экспрессирующие флуоресцентные белки слияния, могут быть использованы для отслеживания и количественной оценки производства и нацеливания этих отдельных белков в planta. Инокулированные ткани оболочки могут быть извлечены для определения характеристик нуклеиновых кислот, белков или метаболитов. Использование этих оболочечных анализов значительно продвинуло вперед детальные исследования механизмов патогенности грибов в кукурузе, а также эффекторов грибных белков и вторичных метаболитов, способствующих патогенности.
Introduction
Пространственный и временной анализ на клеточном уровне имеет решающее значение для понимания физиологии и цитологии взаимодействий грибов и растений. Листовые ткани, которые были химически закреплены 1,2,3 или очищены и окрашены4, а также искусственные мембраны5 использовались в прошлом для изучения цитологии развития листовых патогенов и взаимодействия растений с грибами. Тем не менее, исследование инфекционных событий в тканях живого хозяина в режиме реального времени без фиксации или очистки является сложной задачей из-за технических проблем, связанных с подготовкой оптически прозрачных образцов для визуализации.
В конце 1940-х годов был разработан протокол инокуляции оболочек листьев для ярко-полевого микроскопического исследования резистентности живых клеток эпидермиса риса к рисовому бластному грибу Magnaporthe oryza6. В последнее время детальные молекулярные, физиологические и цитологические наблюдения за колонизацией хозяина видами Colletotrichum и Magnaporthe были значительно облегчены благодаря сочетанию модифицированных версий этого метода с грибными трансформантами, экспрессирующими флуоресцентные белки, и высокоэффективными протоколами визуализации живых клеток, включая эпифлуоресценцию и конфокальную микроскопию7,8,9,10.11,12,13.
В данной работе подробно описан оптимизированный протокол инокуляции с использованием отслоившихся влагалищ листьев кукурузы для наблюдения за процессами заражения гемибиотрофными и некротрофными листовыми грибковыми патогенами. Мы специально использовали его для изучения Colletotrichum graminicola (C. graminicola), возбудителя антракноза листьев и стеблевой гнили, и Stenocarpella maydis, которая вызывает фитофтороз листьев Diplodia и стеблевую гниль. Однако метод должен быть применим и к другим гемибиотрофным и некротрофным листовым грибковым патогенам. Цитологические и физиологические реакции во время инфекций и колонизации в этих иссеченных листовых влагалях аналогичны таковым в целых листовых пластинках12,14,15. Кроме того, гемибиотрофная колонизация клеток эпидермиса оболочки C. graminicola сходна с колонизацией клеток сердцевины стебля16,17. Отслоенные влагалища демонстрируют большую синхронность и экспериментальную воспроизводимость проникновения и колонизации грибов, чем листовые пластинки или ткани сердцевины стебля14,16,17,18. Для этого протокола можно использовать большинство сортов кукурузы. Тем не менее, инбредные или гибриды с избыточным количеством фиолетовых пигментов в влагалях менее подходят, поскольку пигменты мешают визуализации. Сладкая кукуруза «Золотой юбилей» была особенно полезна для наших исследований, потому что необработанные семена коммерчески доступны, растения очень восприимчивы ко многим листовым заболеваниям и хорошо растут в теплице. Первые эпидемии антракнозной стеблевой гнили в США привели к полной потере урожая сахарной кукурузы в Индиане в 1970-х годах19,20. Этот метод инокуляции влагалища листа может быть применен для непосредственного наблюдения и количественной оценки роста и развития грибков в живых и локально убитых растительных клетках, для демонстрации реакций резистентности в совместимых/несовместимых ответах на грибковую инфекцию, а также для тестирования взаимодействия между штаммами грибов на одной и той же оболочке в режиме реального времени.
Protocol
Representative Results
Discussion
Оптимизированный метод инокуляции влагалища листа, описанный здесь, является модификацией оригинального протокола, который был разработан и применен для влагалищ листьев риса 6,8,36. Он позволяет проводить прямые, детальные наблюдения …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы благодарят USDA-NIFA за финансовую поддержку (номера грантов 2018-67013-28489 и 2020-70410-32901). Любые мнения, выводы, выводы или рекомендации, выраженные в этой рукописи, принадлежат исключительно авторам и не обязательно отражают точку зрения Министерства сельского хозяйства США. Мы благодарим студентку программы «Наука без границ» из Бразилии Майяру де Сильва за изображения, представленные на рисунке 6A и на рисунке 7D. Мы также выражаем признательность кафедре патологии растений Университета Кентукки за предоставление доступа к конфокальным микроскопам Olympus.
Materials
| Axiocam monochrome microscope camera | ZEISS | 426560-9010-000 | Compatible with the Axioplan 2 microscope; provides low read noise and high speed for live cell imaging |
| Axioplan 2 epifluorescence microscope | ZEISS | N/A | Allows live viewing and image/video capture of biological samples |
| Benchtop centrifuge 24 X 1.5/2 mL | Thermo Fisher Scientific | 75002431 | Sorvall Legend Micro 17; max speed: 13,300 rpm (17,000 x g) |
| Falcon bacteriological Petri dish with lid | Fisher Scientific | 08-757-105 | Polystyrene material; hydrophobic surface |
| Filter paper | Fisher Scientific | 09-920-115 | Whatman grade 1 for Petri plate moist chambers |
| FV 3000 laser scanning confocal microscope | Olympus | N/A | For visualization of fungal transformants' |
| Germination paper | Anchor Paper Co. | SD7615L | 76# heavy weight for plastic box moist chambers |
| Glass Petri dishes | VWR International | 75845-542 | Type 1 class A, 33 expansion borosilicate glass; complete set (cover + bottom), for Petri plate moist chambers |
| Glass wool | Ohio Valley Specialty Chemical | 3350 | For glass-wool filter units |
| Hemocytometer/Neubauer counting chamber and cover glass | VWR International | 15170-172 | 0.1 mm chamber depth; comes with two 0.4 mm cover glasses |
| Microscope coverslips | Fisher Scientific | 12-553-457 | Borosilicate glass; 100/Pk.; 22 mm length, 22 mm width |
| Maize cultivar Golden Jubilee seeds | West Coast Seeds Ltd., Delta, BC, Canada | CN361 | Matures in 95-105 days; seed type: F1 |
| Microcentrifuge tubes | USA Scientific | 1415-2500 | 1.5 mL capacity |
| Microscope slides | Fisher Scientific | 12-550-123 | Superfrost white tab slide; 76 mm length, 25 mm width |
| Oatmeal Agar (OA) | VWR International | 255210 | Difco Oatmeal Agar, BD; 500 g |
| Nail polish | Revlon | 43671 | Clear nail polish for sealing microscope slides; color 771 Clear |
| Non-skirted 96-well PCR plate | USA Sientific | 1402-9500 | 100 uL plate volume |
| Pestle for microcentrifuge tubes | USA Scientific | 1415-5390 | Conical tip; polypropylene material |
| PlanApo 60X/1,00 WLSM water objective | Olympus | 1-UB933 | Compatible with the Olympus FV 3000 confocal microscope |
| Potato Dextrose Agar (PDA) | VWR International | 90000-758 | Difco Potato Dextrose Media, BD; 500 g |
| Pro-Mix BX | Premium Horticulture Supply Co. | N/A | Premium general-purpose growing medium formulated to provide a balance of water retention and proper drainage |
| SC10 cone-tainers | Greenhouse Megastore | CN-SS-SC-10B | 1.5 inch diameter, 8.25 inch depth, and a volume of 164 mL |
| SC10 cone-tainers tray | Greenhouse Megastore | CN-SS-SCTR98 | 24 inch length x 12 inch width x 6.75 inch height; holds up to 98 of SC10 cone-tainers |
| Single edge razor blade | Thermo Fisher Scientific | 17-989-145 | AccuTec blade; steel material; 38 mm length blade |
| Storage containers/boxes with latch closure | Target | 002-02-0405 | Clear view storage boxes for rmoist chamber; outside dimensions: 23 5/8 inch x 16 3/8 inch x 6 1/2 inch; 32 qt. capacity |
References
- Cheng, Y., Yao, J., Zhang, H., Huang, L., Kang, Z. Cytological and molecular analysis of nonhost resistance in rice to wheat powdery mildew and leaf rust pathogens. Protoplasma. 252 (4), 1167-1179 (2015).
- Hickey, E. L., Coffey, M. D. A fine-structural study of the pea downy mildew fungus Peronospora pisi in its host Pisum sativum. Canadian Journal of Botany. 55 (23), 2845-2858 (1977).
- Wharton, P. S., Julian, A. M., O’Connell, R. J. Ultrastructure of the infection of Sorghum bicolor by Colletotrichum sublineolum. Phytopathology. 91 (2), 149-158 (2001).
- Latunde-Dada, A. O., et al. Infection process and identity of the hemibiotrophic anthracnose fungus (Colletotrichum destructivum O’Gara) from cowpea (Vigna unguiculata (L) Walp.). Mycological Research. 100 (9), 1133-1141 (1996).
- Bourett, T. M., Howard, R. J. In vitro development of penetration structures in the rice blast fungus Magnaporthe grisea. Canadian Journal of Botany. 68 (2), 329-342 (1990).
- Sakamoto, M. On the new method of sheath inoculation of rice plants with blast fungus, Pyricularia oryzae Cav., for the studying of the disease-resistant nature of the plant. Bulletin of the Institute for Agricultural Research, Tōhoku University. 1 (3), 120-129 (1949).
- Buiate, E. A., et al. A comparative genomic analysis of putative pathogenicity genes in the host-specific sibling species Colletotrichum graminicola and Colletotrichum sublineola. BMC genomics. 18 (1), 1-24 (2017).
- Kankanala, P., Czymmek, K., Valent, B. Roles for rice membrane dynamics and plasmodesmata during biotrophic invasion by the blast fungus. The Plant Cell. 19 (2), 706-724 (2007).
- Khang, C. H., et al. Translocation of Magnaporthe oryzae effectors into rice cells and their subsequent cell-to-cell movement. The Plant Cell. 22 (4), 1388-1403 (2010).
- Mosquera, G., Giraldo, M. C., Khang, C. H., Coughlan, S., Valent, B. Interaction transcriptome analysis identifies Magnaporthe oryzae BAS1-4 as biotrophy-associated secreted proteins in rice blast disease. The Plant Cell. 21 (4), 1273-1290 (2009).
- Sakulkoo, W., et al. A single fungal MAP kinase controls plant cell-to-cell invasion by the rice blast fungus. Science. 359 (6382), 1399-1403 (2018).
- Torres, M. F., Cuadros, D. F., Vaillancourt, L. J. Evidence for a diffusible factor that induces susceptibility in the Colletotrichum-maize disease interaction. Molecular Plant Pathology. 15 (1), 80-93 (2014).
- Valent, B., Khang, C. H. Recent advances in rice blast effector research. Current Opinion in Plant Biology. 13 (4), 434-441 (2010).
- Mims, C. W., Vaillancourt, L. J. Ultrastructural characterization of infection and colonization of maize leaves by Colletotrichum graminicola, and by a C. graminicola pathogenicity mutant. Phytopathology. 92 (7), 803-812 (2002).
- Vargas, W. A., et al. Plant defense mechanisms are activated during biotrophic and necrotrophic development of Colletotricum graminicola in maize. Plant Physiology. 158 (3), 1342-1358 (2012).
- Venard, C., Vaillancourt, L. Colonization of fiber cells by Colletotrichum graminicola in wounded maize stalks. Phytopathology. 97 (4), 438-447 (2007).
- Venard, C., Vaillancourt, L. Penetration and colonization of unwounded maize tissues by the maize anthracnose pathogen Colletotrichum graminicola and the related nonpathogen C. sublineolum. Mycologia. 99 (3), 368-377 (2007).
- Berruyer, R., Poussier, S., Kankanala, P., Mosquera, G., Valent, B. Quantitative and qualitative influence of inoculation methods on in planta growth of rice blast fungus. Phytopathology. 96 (4), 346-355 (2006).
- Belisário, R., Robertson, A. E., Vaillancourt, L. J. Maize anthracnose stalk rot in the genomic era. Plant Disease. 106 (9), 2281-2298 (2022).
- Warren, H. L., Nicholson, R. L., Ullstrup, A. J., Sharvelle, E. G. Observations of Colletotrichum graminicola on sweet corn in Indiana. Plant Disease Reporter. 57, 143-144 (1973).
- Ritchie, S. W., Hanway, J. J., Benson, G. O. How a corn plant develops. Special Report, Iowa State University. 48, (1986).
- Tuite, J. . Plant pathological methods: fungi and bacteria. , (1969).
- Wicklow, D. T., Rogers, K. D., Dowd, P. F., Gloer, J. B. Bioactive metabolites from Stenocarpella maydis, a stalk and ear rot pathogen of maize. Fungal Biology. 115 (2), 133-142 (2011).
- Daudi, A., O’Brien, J. A. Detection of hydrogen peroxide by DAB staining in Arabidopsis leaves. Bio-protocol. 2 (18), e263-e263 (2012).
- Benhamou, R. I., Jaber, Q. Z., Herzog, I. M., Roichman, Y., Fridman, M. Fluorescent tracking of the endoplasmic reticulum in live pathogenic fungal cells. ACS Chemical Biology. 13 (12), 3325-3332 (2018).
- Lorang, J. M., et al. fluorescent protein is lighting up fungal biology. Applied and Environmental Microbiology. 67 (5), 1987-1994 (2001).
- Liu, C. Y., Zhu, J., Xie, Z. Visualizing yeast organelles with fluorescent protein markers. JoVE (Journal of Visualized Experiments). 182, e63846 (2022).
- Westermann, B., Neupert, W. Mitochondria-targeted green fluorescent proteins: convenient tools for the study of organelle biogenesis in Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 16 (15), 1421-1427 (2000).
- Lee, A. S. The ER chaperone and signaling regulator GRP78/BiP as a monitor of endoplasmic reticulum stress. Methods. 35 (4), 373-381 (2005).
- Krishnakumar, V., et al. A maize database resource that captures tissue-specific and subcellular-localized gene expression, via fluorescent tags and confocal imaging (Maize Cell Genomics Database). Plant and Cell Physiology. 56 (1), e12-e12 (2015).
- Wu, Q., Luo, A., Zadrozny, T., Sylvester, A., Jackson, D. Fluorescent protein marker lines in maize: generation and applications. International Journal of Developmental Biology. 57 (6-7-8), 535-543 (2013).
- O’Connell, R. J., et al. Lifestyle transitions in plant pathogenic Colletotrichum fungi deciphered by genome and transcriptome analyses. Nature Genetics. 44 (9), 1060-1065 (2012).
- Torres, M. F., et al. A Colletotrichum graminicola mutant deficient in the establishment of biotrophy reveals early transcriptional events in the maize anthracnose disease interaction. BMC Genomics. 17 (202), 1-24 (2016).
- Andrie, R. M., Martinez, J. P., Ciuffetti, L. M. Development of ToxA and ToxB promoter-driven fluorescent protein expression vectors for use in filamentous ascomycetes. Mycologia. 97 (5), 1152-1161 (2005).
- Gordon, C. L., et al. Glucoamylase:: green fluorescent protein fusions to monitor protein secretion in Aspergillus niger. Microbiology. 146 (2), 415-426 (2000).
- Koga, H., Dohi, K., Nakayachi, O., Mori, M. A novel inoculation method of Magnaporthe grisea for cytological observation of the infection process using intact leaf sheaths of rice plants. Physiological and Molecular Plant Pathology. 64 (2), 67-72 (2004).
- Xavier, K. V., Pfeiffer, T., Parreira, D. F., Chopra, S., Vaillancourt, L. Aggressiveness of Colletotrichum sublineola strains from Sorghum bicolor and S. halepense to sweet sorghum variety Sugar Drip, and their impact on yield. Plant Disease. 101 (9), 1578-1587 (2017).
