Bainhas de milho destacadas para imagens de células vivas da infecção por patógenos fúngicos foliares de milho
Summary
Este manuscrito detalha um protocolo de inoculação otimizado que utiliza bainhas de folhas de milho destacadas para estudos citológicos, fisiológicos e moleculares reprodutíveis de interações do milho com fitopatógenos fúngicos. As bainhas foliares facilitam a observação em tempo real das interações celulares entre a planta viva e o fungo em tecidos não fixos.
Abstract
Otimizamos um protocolo para inocular bainhas foliares de milho com fungos hemibiotróficos e necrotróficos foliares patogênicos. O método é modificado a partir de um originalmente aplicado em bainhas de folhas de arroz e permite a observação microscópica direta do crescimento e desenvolvimento de fungos em células vivas de plantas. Bainhas foliares coletadas de plântulas de milho com dois colares de folhas completamente emergidos são inoculadas com gotas de 20 μL de suspensões de esporos fúngicos de 5 x 105 esporos/mL e incubadas em câmaras de umidade a 23 °C sob luz fluorescente contínua. Após 24-72 h, o excesso de tecido é removido com uma lâmina de barbear para deixar uma única camada de células epidérmicas, uma amostra opticamente clara que pode ser fotografada diretamente sem a necessidade de fixação química ou clareamento. Células de plantas e fungos permanecem vivas durante todo o experimento e as interações podem ser visualizadas em tempo real. As bainhas podem ser coradas ou submetidas à plasmólise para estudar a citologia do desenvolvimento e a viabilidade das células do hospedeiro e do patógeno durante a infecção e colonização. Cepas fúngicas transformadas para expressar proteínas fluorescentes podem ser inoculadas ou co-inoculadas nas bainhas para maior resolução e para facilitar a avaliação de interações competitivas ou sinérgicas. Cepas fúngicas expressando proteínas de fusão fluorescente podem ser usadas para rastrear e quantificar a produção e o direcionamento dessas proteínas individuais em planta. Tecidos da bainha inoculados podem ser extraídos para caracterizar ácidos nucléicos, proteínas ou metabólitos. O uso destes ensaios de bainha tem avançado muito os estudos detalhados dos mecanismos de patogenicidade fúngica em milho e também de efetores de proteínas fúngicas e metabólitos secundários que contribuem para a patogenicidade.
Introduction
Análises espaciais e temporais em nível celular são críticas para o entendimento da fisiologia e citologia das interações fúngico-planta. Tecidos foliares quimicamentefixados1,2,3 ou clareados4, bem como membranas artificiais5, têm sido utilizados no passado para investigar a citologia do desenvolvimento de patógenos foliares e interações planta-fungos. No entanto, a investigação de eventos infecciosos em tecidos vivos do hospedeiro em tempo real, sem fixação ou clareamento, é um desafio devido a questões técnicas relacionadas à preparação de amostras opticamente transparentes para obtenção de imagens.
Um protocolo de inoculação em bainha de folha destacada foi desenvolvido no final da década de 1940 para investigação microscópica de campo brilhante da resistência de células epidérmicas vivas de arroz ao fungo da brusone do arroz Magnaporthe oryza6. Mais recentemente, observações moleculares, fisiológicas e citológicas detalhadas da colonização do hospedeiro por espécies de Colletotrichum e Magnaporthe foram grandemente facilitadas pela combinação de versões modificadas desse método de bainha foliar com transformadores fúngicos expressando proteínas fluorescentes e protocolos de imagem de células vivas de alto desempenho, incluindo epifluorescência e microscopia confocal 7,8,9,10,11,12,13.
Este trabalho detalha um protocolo de inoculação otimizado utilizando bainhas foliares destacadas de milho para observação de processos de infecção por patógenos fúngicos foliares hemibiotróficos e necrotróficos. Nós o usamos especificamente para estudar Colletotrichum graminicola (C. graminicola), o agente causal da requeima das folhas da antracnose e da podridão do colmo, e Stenocarpella maydis, que causa a queima das folhas de Diplodia e a podridão do colmo. No entanto, o método deve ser aplicável a outros patógenos fúngicos foliares hemibiotróficos e necrotróficos. As respostas citológicas e fisiológicas durante eventos de infecção e colonização nessas bainhas excisadas são semelhantes àquelas em lâminas foliares inteiras12,14,15. Além disso, a colonização hemibiotrófica das células epidérmicas da bainha por C. graminicola é semelhante à colonização das células da medula do pedúnculo16,17. Bainhas destacadas apresentam maior sincronicidade e reprodutibilidade experimental da penetração e colonização de fungos do que lâminas foliares ou tecidos da medula do pedúnculo14,16,17,18. A maioria das variedades de milho pode ser utilizada para este protocolo. No entanto, endogâmicas ou híbridos com excesso de pigmentos roxos nas bainhas são menos adequados, uma vez que os pigmentos interferem na imagem. O milho doce Golden Jubilee tem sido particularmente útil para nossos estudos porque sementes não tratadas estão disponíveis comercialmente, as plantas são altamente suscetíveis a muitas doenças foliares e crescem bem em casa de vegetação. As primeiras epidemias de podridão do colmo da antracnose nos Estados Unidos resultaram na perda total das lavouras de milho doce em Indiana na década de1970 19,20. Este método de inoculação da bainha foliar pode ser aplicado para observar e quantificar diretamente o crescimento e desenvolvimento fúngico em células vegetais vivas versus mortas localmente, para demonstrar reações de resistência em respostas compatíveis/incompatíveis à infecção fúngica e para testar interações entre cepas fúngicas na mesma bainha em tempo real.
Protocol
Representative Results
Discussion
O método otimizado de inoculação de bainha foliar aqui descrito é modificado de um protocolo original que foi desenvolvido e aplicado em bainhas foliares de arroz 6,8,36. Permite observações diretas e detalhadas do crescimento e desenvolvimento de fungos em células vegetais vivas com microscopia de campo amplo ou confocal. O protocolo é adequado para caracterização, comparação e quantificação de uma variedade de fe…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores agradecem ao USDA-NIFA por seu apoio financeiro (números de concessão 2018-67013-28489 e 2020-70410-32901). Quaisquer opiniões, achados, conclusões ou recomendações expressas neste manuscrito são exclusivamente dos autores e não refletem necessariamente as opiniões do Departamento de Agricultura dos EUA. Agradecemos à aluna visitante do Ciência sem Fronteiras, Mayara da Silva, pelas imagens que aparecem na Figura 6A e na Figura 7D. Também agradecemos ao Departamento de Fitopatologia da Universidade de Kentucky por fornecer acesso aos microscópios confocais Olympus.
Materials
| Axiocam monochrome microscope camera | ZEISS | 426560-9010-000 | Compatible with the Axioplan 2 microscope; provides low read noise and high speed for live cell imaging |
| Axioplan 2 epifluorescence microscope | ZEISS | N/A | Allows live viewing and image/video capture of biological samples |
| Benchtop centrifuge 24 X 1.5/2 mL | Thermo Fisher Scientific | 75002431 | Sorvall Legend Micro 17; max speed: 13,300 rpm (17,000 x g) |
| Falcon bacteriological Petri dish with lid | Fisher Scientific | 08-757-105 | Polystyrene material; hydrophobic surface |
| Filter paper | Fisher Scientific | 09-920-115 | Whatman grade 1 for Petri plate moist chambers |
| FV 3000 laser scanning confocal microscope | Olympus | N/A | For visualization of fungal transformants' |
| Germination paper | Anchor Paper Co. | SD7615L | 76# heavy weight for plastic box moist chambers |
| Glass Petri dishes | VWR International | 75845-542 | Type 1 class A, 33 expansion borosilicate glass; complete set (cover + bottom), for Petri plate moist chambers |
| Glass wool | Ohio Valley Specialty Chemical | 3350 | For glass-wool filter units |
| Hemocytometer/Neubauer counting chamber and cover glass | VWR International | 15170-172 | 0.1 mm chamber depth; comes with two 0.4 mm cover glasses |
| Microscope coverslips | Fisher Scientific | 12-553-457 | Borosilicate glass; 100/Pk.; 22 mm length, 22 mm width |
| Maize cultivar Golden Jubilee seeds | West Coast Seeds Ltd., Delta, BC, Canada | CN361 | Matures in 95-105 days; seed type: F1 |
| Microcentrifuge tubes | USA Scientific | 1415-2500 | 1.5 mL capacity |
| Microscope slides | Fisher Scientific | 12-550-123 | Superfrost white tab slide; 76 mm length, 25 mm width |
| Oatmeal Agar (OA) | VWR International | 255210 | Difco Oatmeal Agar, BD; 500 g |
| Nail polish | Revlon | 43671 | Clear nail polish for sealing microscope slides; color 771 Clear |
| Non-skirted 96-well PCR plate | USA Sientific | 1402-9500 | 100 uL plate volume |
| Pestle for microcentrifuge tubes | USA Scientific | 1415-5390 | Conical tip; polypropylene material |
| PlanApo 60X/1,00 WLSM water objective | Olympus | 1-UB933 | Compatible with the Olympus FV 3000 confocal microscope |
| Potato Dextrose Agar (PDA) | VWR International | 90000-758 | Difco Potato Dextrose Media, BD; 500 g |
| Pro-Mix BX | Premium Horticulture Supply Co. | N/A | Premium general-purpose growing medium formulated to provide a balance of water retention and proper drainage |
| SC10 cone-tainers | Greenhouse Megastore | CN-SS-SC-10B | 1.5 inch diameter, 8.25 inch depth, and a volume of 164 mL |
| SC10 cone-tainers tray | Greenhouse Megastore | CN-SS-SCTR98 | 24 inch length x 12 inch width x 6.75 inch height; holds up to 98 of SC10 cone-tainers |
| Single edge razor blade | Thermo Fisher Scientific | 17-989-145 | AccuTec blade; steel material; 38 mm length blade |
| Storage containers/boxes with latch closure | Target | 002-02-0405 | Clear view storage boxes for rmoist chamber; outside dimensions: 23 5/8 inch x 16 3/8 inch x 6 1/2 inch; 32 qt. capacity |
References
- Cheng, Y., Yao, J., Zhang, H., Huang, L., Kang, Z. Cytological and molecular analysis of nonhost resistance in rice to wheat powdery mildew and leaf rust pathogens. Protoplasma. 252 (4), 1167-1179 (2015).
- Hickey, E. L., Coffey, M. D. A fine-structural study of the pea downy mildew fungus Peronospora pisi in its host Pisum sativum. Canadian Journal of Botany. 55 (23), 2845-2858 (1977).
- Wharton, P. S., Julian, A. M., O’Connell, R. J. Ultrastructure of the infection of Sorghum bicolor by Colletotrichum sublineolum. Phytopathology. 91 (2), 149-158 (2001).
- Latunde-Dada, A. O., et al. Infection process and identity of the hemibiotrophic anthracnose fungus (Colletotrichum destructivum O’Gara) from cowpea (Vigna unguiculata (L) Walp.). Mycological Research. 100 (9), 1133-1141 (1996).
- Bourett, T. M., Howard, R. J. In vitro development of penetration structures in the rice blast fungus Magnaporthe grisea. Canadian Journal of Botany. 68 (2), 329-342 (1990).
- Sakamoto, M. On the new method of sheath inoculation of rice plants with blast fungus, Pyricularia oryzae Cav., for the studying of the disease-resistant nature of the plant. Bulletin of the Institute for Agricultural Research, Tōhoku University. 1 (3), 120-129 (1949).
- Buiate, E. A., et al. A comparative genomic analysis of putative pathogenicity genes in the host-specific sibling species Colletotrichum graminicola and Colletotrichum sublineola. BMC genomics. 18 (1), 1-24 (2017).
- Kankanala, P., Czymmek, K., Valent, B. Roles for rice membrane dynamics and plasmodesmata during biotrophic invasion by the blast fungus. The Plant Cell. 19 (2), 706-724 (2007).
- Khang, C. H., et al. Translocation of Magnaporthe oryzae effectors into rice cells and their subsequent cell-to-cell movement. The Plant Cell. 22 (4), 1388-1403 (2010).
- Mosquera, G., Giraldo, M. C., Khang, C. H., Coughlan, S., Valent, B. Interaction transcriptome analysis identifies Magnaporthe oryzae BAS1-4 as biotrophy-associated secreted proteins in rice blast disease. The Plant Cell. 21 (4), 1273-1290 (2009).
- Sakulkoo, W., et al. A single fungal MAP kinase controls plant cell-to-cell invasion by the rice blast fungus. Science. 359 (6382), 1399-1403 (2018).
- Torres, M. F., Cuadros, D. F., Vaillancourt, L. J. Evidence for a diffusible factor that induces susceptibility in the Colletotrichum-maize disease interaction. Molecular Plant Pathology. 15 (1), 80-93 (2014).
- Valent, B., Khang, C. H. Recent advances in rice blast effector research. Current Opinion in Plant Biology. 13 (4), 434-441 (2010).
- Mims, C. W., Vaillancourt, L. J. Ultrastructural characterization of infection and colonization of maize leaves by Colletotrichum graminicola, and by a C. graminicola pathogenicity mutant. Phytopathology. 92 (7), 803-812 (2002).
- Vargas, W. A., et al. Plant defense mechanisms are activated during biotrophic and necrotrophic development of Colletotricum graminicola in maize. Plant Physiology. 158 (3), 1342-1358 (2012).
- Venard, C., Vaillancourt, L. Colonization of fiber cells by Colletotrichum graminicola in wounded maize stalks. Phytopathology. 97 (4), 438-447 (2007).
- Venard, C., Vaillancourt, L. Penetration and colonization of unwounded maize tissues by the maize anthracnose pathogen Colletotrichum graminicola and the related nonpathogen C. sublineolum. Mycologia. 99 (3), 368-377 (2007).
- Berruyer, R., Poussier, S., Kankanala, P., Mosquera, G., Valent, B. Quantitative and qualitative influence of inoculation methods on in planta growth of rice blast fungus. Phytopathology. 96 (4), 346-355 (2006).
- Belisário, R., Robertson, A. E., Vaillancourt, L. J. Maize anthracnose stalk rot in the genomic era. Plant Disease. 106 (9), 2281-2298 (2022).
- Warren, H. L., Nicholson, R. L., Ullstrup, A. J., Sharvelle, E. G. Observations of Colletotrichum graminicola on sweet corn in Indiana. Plant Disease Reporter. 57, 143-144 (1973).
- Ritchie, S. W., Hanway, J. J., Benson, G. O. How a corn plant develops. Special Report, Iowa State University. 48, (1986).
- Tuite, J. . Plant pathological methods: fungi and bacteria. , (1969).
- Wicklow, D. T., Rogers, K. D., Dowd, P. F., Gloer, J. B. Bioactive metabolites from Stenocarpella maydis, a stalk and ear rot pathogen of maize. Fungal Biology. 115 (2), 133-142 (2011).
- Daudi, A., O’Brien, J. A. Detection of hydrogen peroxide by DAB staining in Arabidopsis leaves. Bio-protocol. 2 (18), e263-e263 (2012).
- Benhamou, R. I., Jaber, Q. Z., Herzog, I. M., Roichman, Y., Fridman, M. Fluorescent tracking of the endoplasmic reticulum in live pathogenic fungal cells. ACS Chemical Biology. 13 (12), 3325-3332 (2018).
- Lorang, J. M., et al. fluorescent protein is lighting up fungal biology. Applied and Environmental Microbiology. 67 (5), 1987-1994 (2001).
- Liu, C. Y., Zhu, J., Xie, Z. Visualizing yeast organelles with fluorescent protein markers. JoVE (Journal of Visualized Experiments). 182, e63846 (2022).
- Westermann, B., Neupert, W. Mitochondria-targeted green fluorescent proteins: convenient tools for the study of organelle biogenesis in Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 16 (15), 1421-1427 (2000).
- Lee, A. S. The ER chaperone and signaling regulator GRP78/BiP as a monitor of endoplasmic reticulum stress. Methods. 35 (4), 373-381 (2005).
- Krishnakumar, V., et al. A maize database resource that captures tissue-specific and subcellular-localized gene expression, via fluorescent tags and confocal imaging (Maize Cell Genomics Database). Plant and Cell Physiology. 56 (1), e12-e12 (2015).
- Wu, Q., Luo, A., Zadrozny, T., Sylvester, A., Jackson, D. Fluorescent protein marker lines in maize: generation and applications. International Journal of Developmental Biology. 57 (6-7-8), 535-543 (2013).
- O’Connell, R. J., et al. Lifestyle transitions in plant pathogenic Colletotrichum fungi deciphered by genome and transcriptome analyses. Nature Genetics. 44 (9), 1060-1065 (2012).
- Torres, M. F., et al. A Colletotrichum graminicola mutant deficient in the establishment of biotrophy reveals early transcriptional events in the maize anthracnose disease interaction. BMC Genomics. 17 (202), 1-24 (2016).
- Andrie, R. M., Martinez, J. P., Ciuffetti, L. M. Development of ToxA and ToxB promoter-driven fluorescent protein expression vectors for use in filamentous ascomycetes. Mycologia. 97 (5), 1152-1161 (2005).
- Gordon, C. L., et al. Glucoamylase:: green fluorescent protein fusions to monitor protein secretion in Aspergillus niger. Microbiology. 146 (2), 415-426 (2000).
- Koga, H., Dohi, K., Nakayachi, O., Mori, M. A novel inoculation method of Magnaporthe grisea for cytological observation of the infection process using intact leaf sheaths of rice plants. Physiological and Molecular Plant Pathology. 64 (2), 67-72 (2004).
- Xavier, K. V., Pfeiffer, T., Parreira, D. F., Chopra, S., Vaillancourt, L. Aggressiveness of Colletotrichum sublineola strains from Sorghum bicolor and S. halepense to sweet sorghum variety Sugar Drip, and their impact on yield. Plant Disease. 101 (9), 1578-1587 (2017).
