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Biology

真菌葉トウモロコシ病原体による感染の生細胞イメージングのための分離トウモロコシ鞘

Published: September 15, 2023
doi:
10.3791/65755
, , , , ,
1Department of Plant Pathology,University of Kentucky, 2Department of Biological Sciences,University of Cincinnati, 3Bayer Crop Science, 4Everglades Research and Education Center,University of Florida

Summary

この原稿では、トウモロコシと真菌植物病原体との相互作用の再現性のある細胞学的、生理学的、および分子学的研究のために、剥離したトウモロコシの葉鞘を使用する最適化された接種プロトコルについて詳しく説明します。葉鞘は、未固定組織における生きた植物と真菌の間の細胞相互作用のリアルタイム観察を容易にします。

Abstract

トウモロコシの葉鞘に半栄養性および壊死栄養性の葉面病原性真菌を接種するためのプロトコルを最適化しました。この方法は、もともとイネの葉鞘に適用されていた方法から変更され、生きた植物細胞の真菌の成長と発生を直接顕微鏡で観察することができます。トウモロコシの苗から採取した葉鞘に、2つの葉の襟が完全に出現し、20 μLの滴下(5 x 105 胞子/mLの真菌胞子懸濁液)を接種し、23°Cの湿度チャンバー内で連続蛍光灯下でインキュベートします。24〜72時間後、余分な組織をカミソリの刃で除去し、表皮細胞の単層、化学的固定や透明化を必要とせずに直接画像化できる光学的に透明なサンプルを残します。植物細胞と真菌細胞は実験期間中生き続け、相互作用をリアルタイムで視覚化できます。シースを染色または形質分解して、感染およびコロニー形成中の宿主細胞および病原体細胞の発生細胞診および生存率を研究することができます。蛍光タンパク質を発現するように形質転換された真菌株を鞘に接種または同時接種することで、分解能を高め、競合的または相乗的相互作用の評価を容易にすることができます。蛍光融合タンパク質を発現する真菌株を使用して、 プランタにおけるこれらの個々のタンパク質の産生および標的化を追跡および定量化することができます。接種した鞘組織を抽出して、核酸、タンパク質、または代謝物を特徴付けることができます。これらのシースアッセイの使用は、トウモロコシの真菌病原性のメカニズム、および病原性に寄与する真菌タンパク質エフェクターおよび二次代謝産物の詳細な研究を大幅に前進させました。

Introduction

細胞レベルでの空間的および時間的分析は、真菌と植物の相互作用の生理学と細胞学を理解するために重要です。過去には、化学的に固定された葉面組織1,2,3または透明化して染色した4、および人工膜5が、葉面病原体の発生と植物と真菌の相互作用の細胞診を調べるために使用されてきました。しかし、固定や透明化を行わずに、生きた宿主組織の感染事象をリアルタイムで調べることは、イメージング用の光学的に透明なサンプルの調製に関連する技術的な問題があるため、困難です。

1940年代後半に、イネいもち病菌Magnaporthe oryza6に対する生きたイネ表皮細胞の耐性を明視野顕微鏡で調べるために、分離葉鞘接種プロトコルが開発されました。最近では、ColletotrichumおよびMagnaporthe種による宿主コロニー形成の詳細な分子学的、生理学的、および細胞学的観察は、この葉鞘法の修正バージョンと、蛍光タンパク質を発現する真菌形質転換体、および落射蛍光および共焦点顕微鏡検査を含む高性能生細胞イメージングプロトコルを組み合わせることによって非常に容易になりました7,8,9,10、11、12、13。

この論文では、半栄養性および壊死栄養性の葉状真菌病原体による感染過程を観察するために、剥離したトウモロコシ葉鞘を使用した最適化された接種プロトコルについて詳しく説明します。具体的には、炭疽病の葉枯れ病や茎腐病の原因菌であるColletotrichum graminicola(C. graminicola)や、ディプロディアの葉枯れ病や茎腐病の原因となるStenocarpella maydisの研究に使用しています。ただし、この方法は、他の半栄養性および壊死栄養性の葉面真菌病原体にも適用できるはずです。これらの切除された葉鞘における感染およびコロニー形成イベント中の細胞学的および生理学的応答は、葉身全体の反応と同様である12,14,15。さらに、C. graminicolaによる鞘表皮細胞の半栄養性コロニー形成は、茎髄細胞のコロニー形成に類似している16,17。剥離した鞘は、葉身や茎の髄組織よりも、真菌の浸透とコロニー形成の同期性と実験的再現性が高いことを示しています14,16,17,18。ほとんどのトウモロコシ品種は、このプロトコルに使用できます。ただし、鞘に過剰な紫色の色素を持つ近交系またはハイブリッドは、色素がイメージングを妨げるため、あまり適していません。ゴールデンジュビリースイートコーンは、未処理の種子が市販されており、植物は多くの葉の病気に非常にかかりやすく、温室でよく育つため、私たちの研究に特に役立ちました。1970年代に米国で炭疽病の茎腐れ病が最初に流行した結果、インディアナ州ではスイートコーンの収穫が完全に失われました19,20。この葉鞘接種法は、生きた植物細胞と局所的に殺された植物細胞の真菌の成長と発生を直接観察および定量化し、真菌感染に対する適合/非互換応答における耐性反応を実証し、同じ鞘上の真菌株間の相互作用をリアルタイムでテストするために適用できます。

Protocol

注: このメソッドのワークフローを 図 1 に示します。 図1:剥離したトウモロコシの葉鞘を使用した最適化された接種プロトコルのステップ。 胞子懸濁液の調製、葉鞘の接種、生細胞顕微鏡用のサンプル調製は、それぞ?…

Representative Results

以下の例は、トウモロコシ葉鞘接種法を使用した後の代表的な結果を示しています。これらの例は、トウモロコシと真菌の相互作用の観察と比較を、この最適化されたアッセイでリアルタイムに行うことの容易さ、速度、精度を示しています。また、生細胞イメージングは定量的な情報の抽出を可能にし、分子学的、細胞学的、生理学的の比較研究に有用なツールを提供します。詳細につい?…

Discussion

ここで説明する最適化された葉鞘接種法は、イネの葉鞘のために開発され、適用されている元のプロトコルから変更されています6,8,36。これにより、広視野顕微鏡または共焦点顕微鏡を使用して、生きた植物細胞における真菌の成長と発生を直接かつ詳細に観察することができます。プロトコルはトウモロコシのコロニー…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

著者らは、USDA-NIFAの財政支援に感謝する(助成金番号2018-67013-28489および2020-70410-32901)。この原稿で表明された意見、調査結果、結論、または推奨事項は、著者のものであり、必ずしも米国農務省の見解を反映しているわけではありません。ブラジルからの「国境なき科学」の客員学生であるMayara de Silva氏には、図 6A と 図7Dの画像を提供していただいたことに感謝します。また、ケンタッキー大学の植物病理学部がオリンパスの共焦点顕微鏡へのアクセスを提供してくれたことにも感謝します。

Materials

Axiocam monochrome microscope camera ZEISS 426560-9010-000 Compatible with the Axioplan 2 microscope; provides low read noise and high speed for live cell imaging
Axioplan 2 epifluorescence microscope ZEISS N/A Allows live viewing and image/video capture of biological samples 
Benchtop centrifuge 24 X 1.5/2 mL Thermo Fisher Scientific 75002431 Sorvall Legend Micro 17; max speed: 13,300 rpm (17,000 x g)
Falcon bacteriological Petri dish with lid Fisher Scientific 08-757-105 Polystyrene material; hydrophobic surface
Filter paper  Fisher Scientific 09-920-115 Whatman grade 1 for Petri plate moist chambers
FV 3000 laser scanning confocal microscope Olympus N/A For visualization of fungal transformants' 
Germination paper Anchor Paper Co. SD7615L 76# heavy weight for plastic box moist chambers
Glass Petri dishes VWR International 75845-542 Type 1 class A, 33 expansion borosilicate glass;
complete set (cover + bottom), for Petri plate moist chambers
Glass wool  Ohio Valley Specialty Chemical  3350 For glass-wool filter units
Hemocytometer/Neubauer counting chamber and cover glass VWR International 15170-172 0.1 mm chamber depth; comes with two 0.4 mm cover glasses
Microscope coverslips Fisher Scientific 12-553-457  Borosilicate glass; 100/Pk.; 22 mm length, 22 mm width
Maize cultivar Golden Jubilee seeds West Coast Seeds Ltd., Delta, BC, Canada CN361 Matures in 95-105 days; seed type: F1
Microcentrifuge tubes  USA Scientific   1415-2500 1.5 mL capacity
Microscope slides  Fisher Scientific 12-550-123  Superfrost white tab slide; 76 mm length, 25 mm width
Oatmeal Agar (OA) VWR International 255210 Difco Oatmeal Agar, BD; 500 g
Nail polish Revlon 43671 Clear nail polish for sealing microscope slides; color 771 Clear
Non-skirted 96-well PCR plate USA Sientific 1402-9500 100 uL plate volume
Pestle for microcentrifuge tubes USA Scientific  1415-5390 Conical tip; polypropylene material
PlanApo 60X/1,00 WLSM water objective  Olympus 1-UB933 Compatible with the Olympus FV 3000 confocal microscope
Potato Dextrose Agar (PDA) VWR International 90000-758 Difco Potato Dextrose Media, BD; 500 g
Pro-Mix BX Premium Horticulture Supply Co. N/A Premium general-purpose growing medium formulated to provide
a balance of water retention and proper drainage
SC10 cone-tainers  Greenhouse Megastore  CN-SS-SC-10B 1.5 inch diameter, 8.25 inch depth, and a volume of 164 mL
SC10 cone-tainers tray Greenhouse Megastore  CN-SS-SCTR98 24 inch length x 12 inch width x 6.75 inch height; holds up to 98 of SC10 cone-tainers
Single edge razor blade Thermo Fisher Scientific 17-989-145 AccuTec blade; steel material; 38 mm length blade
Storage containers/boxes with latch closure Target 002-02-0405 Clear view storage boxes for rmoist chamber;
outside dimensions: 23 5/8 inch x 16 3/8 inch x 6 1/2 inch; 32 qt. capacity
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References

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Keywords: MaizeLeaf SheathLive-cell ImagingFungal PathogensHemibiotrophicNecrotrophicPlant-pathogen InteractionsFungal ColonizationFungal PathogenicityMicroscopyFluorescent ProteinsReal-time VisualizationHost-pathogen InteractionsComparative Genomics
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