फंगल पर्ण मक्का रोगजनकों द्वारा संक्रमण के लाइव-सेल इमेजिंग के लिए अलग मक्का म्यान
Summary
यह पांडुलिपि एक अनुकूलित टीकाकरण प्रोटोकॉल का विवरण देती है जो फंगल पौधे रोगजनकों के साथ मक्का इंटरैक्शन के प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य साइटोलॉजिकल, शारीरिक और आणविक अध्ययन के लिए अलग मक्का पत्ती म्यान का उपयोग करती है। पत्ती म्यान अनफिक्स ऊतकों में जीवित पौधे और कवक के बीच सेलुलर इंटरैक्शन के वास्तविक समय के अवलोकन की सुविधा प्रदान करता है।
Abstract
हमने हेमीबायोट्रॉफिक और नेक्रोट्रॉफिक पर्ण रोगजनक कवक के साथ मक्का पत्ती म्यान को टीका लगाने के लिए एक प्रोटोकॉल को अनुकूलित किया है। विधि को मूल रूप से चावल के पत्ते के म्यान पर लागू एक से संशोधित किया जाता है और जीवित पौधों की कोशिकाओं में कवक के विकास और विकास के प्रत्यक्ष सूक्ष्म अवलोकन की अनुमति देता है। दो पूरी तरह से उभरे हुए पत्ती कॉलर के साथ मक्का के अंकुरों से एकत्र किए गए पत्ती के आवरण को 5 x 105 बीजाणुओं/एमएल कवक बीजाणु निलंबन की 20 माइक्रोन बूंदों के साथ टीका लगाया जाता है और निरंतर फ्लोरोसेंट प्रकाश के तहत 23 डिग्री सेल्सियस पर आर्द्रता कक्षों में ऊष्मायन किया जाता है। 24-72 घंटे के बाद, एपिडर्मल कोशिकाओं की एक परत छोड़ने के लिए रेजर ब्लेड के साथ अतिरिक्त ऊतक को हटा दिया जाता है, एक ऑप्टिकली स्पष्ट नमूना जिसे रासायनिक निर्धारण या समाशोधन की आवश्यकता के बिना सीधे इमेज किया जा सकता है। पौधे और कवक कोशिकाएं प्रयोग की अवधि के लिए जीवित रहती हैं और वास्तविक समय में बातचीत की कल्पना की जा सकती है। संक्रमण और उपनिवेशण के दौरान मेजबान और रोगज़नक़ कोशिकाओं के विकासात्मक कोशिका विज्ञान और व्यवहार्यता का अध्ययन करने के लिए म्यान को दाग दिया जा सकता है या प्लास्मोलिसिस के अधीन किया जा सकता है। फ्लोरोसेंट प्रोटीन को व्यक्त करने के लिए परिवर्तित फंगल उपभेदों को बढ़े हुए संकल्प के लिए म्यान पर टीका लगाया या सह-टीका लगाया जा सकता है और प्रतिस्पर्धी या सहक्रियात्मक बातचीत के मूल्यांकन की सुविधा प्रदान की जा सकती है। फ्लोरोसेंट फ्यूजन प्रोटीन को व्यक्त करने वाले फंगल उपभेदों का उपयोग प्लांटा में इन व्यक्तिगत प्रोटीनों के उत्पादन और लक्ष्यीकरण को ट्रैक और मापने के लिए किया जा सकता है। Inoculated म्यान ऊतकों न्यूक्लिक एसिड, प्रोटीन, या चयापचयों को चिह्नित करने के लिए निकाला जा सकता है. इन म्यान परखों के उपयोग ने मक्का में फंगल रोगजनकता के तंत्र के विस्तृत अध्ययन और रोगजनकता में योगदान देने वाले कवक प्रोटीन प्रभावकों और माध्यमिक चयापचयों के विस्तृत अध्ययन को बहुत उन्नत किया है।
Introduction
सेलुलर स्तर पर स्थानिक और लौकिक विश्लेषण शरीर विज्ञान और कवक संयंत्र बातचीत के कोशिका विज्ञान को समझने के लिए महत्वपूर्ण हैं. पर्णीय ऊतक जिन्हें रासायनिक रूपसे 1,2,3 या साफ और दाग 4 के साथ-साथ कृत्रिम झिल्ली 5 तय किया गया है, का उपयोग अतीत में पर्ण रोगज़नक़ विकास और पौधे-कवक इंटरैक्शन के कोशिका विज्ञान की जांच के लिए किया गया है। हालांकि, निर्धारण या समाशोधन के बिना वास्तविक समय में रहने वाले मेजबान ऊतकों में संक्रमण की घटनाओं की जांच इमेजिंग के लिए वैकल्पिक रूप से पारदर्शी नमूने तैयार करने से संबंधित तकनीकी मुद्दों के कारण चुनौतीपूर्ण है।
चावल विस्फोट कवक मैग्नापोर्थे ओरिज़ा6 के लिए जीवित चावल एपिडर्मल कोशिकाओं के प्रतिरोध की उज्ज्वल क्षेत्र सूक्ष्म जांच के लिए 1940 के दशक के उत्तरार्ध में एक अलग पत्ती म्यान टीका प्रोटोकॉल विकसित किया गया था। हाल ही में, Colletotrichum और Magnaporthe प्रजातियों द्वारा मेजबान उपनिवेशण के विस्तृत आणविक, शारीरिक, और cytological टिप्पणियों को फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त करने वाले कवक ट्रांसफार्मर के साथ इस पत्ती म्यान विधि के संशोधित संस्करणों के संयोजन से बहुत सुविधा प्रदान की गई है, और उच्च प्रदर्शन लाइव-सेल इमेजिंग प्रोटोकॉल, जिसमें एपिफ्लोरेसेंस और कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी 7,8,9,10,11,12,13.
यह पत्र हेमीबायोट्रॉफिक और नेक्रोट्रॉफिक पर्ण कवक रोगजनकों द्वारा संक्रमण प्रक्रियाओं के अवलोकन के लिए अलग मक्का पत्ती म्यान का उपयोग करके एक अनुकूलित टीकाकरण प्रोटोकॉल का विवरण देता है। हमने विशेष रूप से इसका अध्ययन करने के लिए इसका उपयोग किया है Colletotrichum graminicola (सी. ग्रैमिनिकोला), एन्थ्रेक्नोज लीफ ब्लाइट और डंठल सड़ांध का कारण एजेंट, और स्टेनोकार्पेला मेडिस, जो डिप्लोडिया लीफ ब्लाइट और डंठल सड़ांध का कारण बनता है। हालांकि, विधि अन्य हेमिबायोट्रॉफिक और नेक्रोट्रॉफिक पर्ण कवक रोगजनकों पर लागू होनी चाहिए। इन उत्तेजित पत्ती म्यान में संक्रमण और उपनिवेशण की घटनाओं के दौरान साइटोलॉजिकल और शारीरिक प्रतिक्रियाएं पूरे पत्तीब्लेड 12,14,15 में समान हैं। इसके अलावा, सी. graminicola द्वारा म्यान एपिडर्मल कोशिकाओं के hemibiotrophic उपनिवेशण डंठल पिथ कोशिकाओं16,17 के उपनिवेशण के समान है. अलग म्यान पत्ती ब्लेड या डंठल पिथ ऊतकों14,16,17,18 की तुलना में कवक प्रवेश और उपनिवेशण की अधिक समकालिकता और प्रयोगात्मक प्रजनन क्षमता दिखा. अधिकांश मक्का किस्मों इस प्रोटोकॉल के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. हालांकि, म्यान में अत्यधिक बैंगनी वर्णक के साथ इनब्रेड्स या संकर कम उपयुक्त होते हैं क्योंकि पिगमेंट इमेजिंग में हस्तक्षेप करते हैं। गोल्डन जुबली स्वीट कॉर्न हमारे अध्ययन के लिए विशेष रूप से उपयोगी रहा है क्योंकि अनुपचारित बीज व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं, पौधे कई पर्ण रोगों के लिए अतिसंवेदनशील होते हैं, और वे ग्रीनहाउस में अच्छी तरह से विकसित होते हैं। संयुक्त राज्य अमेरिका में एन्थ्रेक्नोज डंठल सड़ांध की पहली महामारी के परिणामस्वरूप 1970के दशक में इंडियाना में स्वीट कॉर्न की फसलों का कुल नुकसान हुआ। इस लीफ शीथ इनोक्यूलेशन विधि को जीवित बनाम स्थानीय रूप से मारे गए पौधों की कोशिकाओं में फंगल विकास और विकास को सीधे देखने और मापने के लिए लागू किया जा सकता है, ताकि फंगल संक्रमण के संगत / असंगत प्रतिक्रियाओं में प्रतिरोध प्रतिक्रियाओं का प्रदर्शन किया जा सके, और वास्तविक समय में एक ही म्यान पर फंगल उपभेदों के बीच बातचीत का परीक्षण किया जा सके।
Protocol
Representative Results
Discussion
अनुकूलित पत्ती म्यान टीका यहाँ वर्णित एक मूल प्रोटोकॉल है कि के लिए विकसित किया गया था और चावल पत्ती म्यान 6,8,36 के लिए लागू किया गया है से संशोधित किया गया है. यह वाइडफी?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखक यूएसडीए-एनआईएफए को उनके वित्तीय समर्थन (अनुदान संख्या 2018-67013-28489 और 2020-70410-32901) के लिए धन्यवाद देते हैं। इस पांडुलिपि में व्यक्त की गई कोई भी राय, निष्कर्ष, निष्कर्ष या सिफारिशें पूरी तरह से लेखकों की हैं और जरूरी नहीं कि अमेरिकी कृषि विभाग के विचारों को प्रतिबिंबित करें। हम साइंस विदाउट बॉर्डर्स को धन्यवाद देते हैं, ब्राजील के छात्र मायारा डी सिल्वा का दौरा करते हैं, चित्र 6A और चित्र 7D में दिखाई देने वाली छवियों के लिए। हम ओलंपस कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप तक पहुंच प्रदान करने के लिए केंटकी विश्वविद्यालय में प्लांट पैथोलॉजी विभाग को भी स्वीकार करते हैं।
Materials
| Axiocam monochrome microscope camera | ZEISS | 426560-9010-000 | Compatible with the Axioplan 2 microscope; provides low read noise and high speed for live cell imaging |
| Axioplan 2 epifluorescence microscope | ZEISS | N/A | Allows live viewing and image/video capture of biological samples |
| Benchtop centrifuge 24 X 1.5/2 mL | Thermo Fisher Scientific | 75002431 | Sorvall Legend Micro 17; max speed: 13,300 rpm (17,000 x g) |
| Falcon bacteriological Petri dish with lid | Fisher Scientific | 08-757-105 | Polystyrene material; hydrophobic surface |
| Filter paper | Fisher Scientific | 09-920-115 | Whatman grade 1 for Petri plate moist chambers |
| FV 3000 laser scanning confocal microscope | Olympus | N/A | For visualization of fungal transformants' |
| Germination paper | Anchor Paper Co. | SD7615L | 76# heavy weight for plastic box moist chambers |
| Glass Petri dishes | VWR International | 75845-542 | Type 1 class A, 33 expansion borosilicate glass; complete set (cover + bottom), for Petri plate moist chambers |
| Glass wool | Ohio Valley Specialty Chemical | 3350 | For glass-wool filter units |
| Hemocytometer/Neubauer counting chamber and cover glass | VWR International | 15170-172 | 0.1 mm chamber depth; comes with two 0.4 mm cover glasses |
| Microscope coverslips | Fisher Scientific | 12-553-457 | Borosilicate glass; 100/Pk.; 22 mm length, 22 mm width |
| Maize cultivar Golden Jubilee seeds | West Coast Seeds Ltd., Delta, BC, Canada | CN361 | Matures in 95-105 days; seed type: F1 |
| Microcentrifuge tubes | USA Scientific | 1415-2500 | 1.5 mL capacity |
| Microscope slides | Fisher Scientific | 12-550-123 | Superfrost white tab slide; 76 mm length, 25 mm width |
| Oatmeal Agar (OA) | VWR International | 255210 | Difco Oatmeal Agar, BD; 500 g |
| Nail polish | Revlon | 43671 | Clear nail polish for sealing microscope slides; color 771 Clear |
| Non-skirted 96-well PCR plate | USA Sientific | 1402-9500 | 100 uL plate volume |
| Pestle for microcentrifuge tubes | USA Scientific | 1415-5390 | Conical tip; polypropylene material |
| PlanApo 60X/1,00 WLSM water objective | Olympus | 1-UB933 | Compatible with the Olympus FV 3000 confocal microscope |
| Potato Dextrose Agar (PDA) | VWR International | 90000-758 | Difco Potato Dextrose Media, BD; 500 g |
| Pro-Mix BX | Premium Horticulture Supply Co. | N/A | Premium general-purpose growing medium formulated to provide a balance of water retention and proper drainage |
| SC10 cone-tainers | Greenhouse Megastore | CN-SS-SC-10B | 1.5 inch diameter, 8.25 inch depth, and a volume of 164 mL |
| SC10 cone-tainers tray | Greenhouse Megastore | CN-SS-SCTR98 | 24 inch length x 12 inch width x 6.75 inch height; holds up to 98 of SC10 cone-tainers |
| Single edge razor blade | Thermo Fisher Scientific | 17-989-145 | AccuTec blade; steel material; 38 mm length blade |
| Storage containers/boxes with latch closure | Target | 002-02-0405 | Clear view storage boxes for rmoist chamber; outside dimensions: 23 5/8 inch x 16 3/8 inch x 6 1/2 inch; 32 qt. capacity |
References
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