Löstagbara majshöljen för avbildning av levande celler av infektion orsakad av bladsvampspatogener för majs
Summary
Detta manuskript beskriver ett optimerat inokuleringsprotokoll som använder fristående majsbladshöljen för reproducerbara cytologiska, fysiologiska och molekylära studier av majsinteraktioner med svampväxtpatogener. Bladslidorna gör det möjligt att i realtid observera cellulära interaktioner mellan den levande växten och svampen i ofixerade vävnader.
Abstract
Vi har optimerat ett protokoll för att inokulera majsbladsskidor med hemibiotrofa och nekrotrofa bladpatogena svampar. Metoden är modifierad från en metod som ursprungligen tillämpades på risbladsskidor och möjliggör direkt mikroskopisk observation av svamptillväxt och utveckling i levande växtceller. Bladslidor som samlats in från majsplantor med två fullt utvecklade bladkragar inokuleras med 20 μl droppar av 5 x 105 sporer/ml svampsporsuspensioner och inkuberas i fuktkammare vid 23 °C i kontinuerligt lysrörsljus. Efter 24-72 timmar avlägsnas överflödig vävnad med ett rakblad för att lämna ett enda lager av epidermala celler, ett optiskt klart prov som kan avbildas direkt utan behov av kemisk fixering eller rensning. Växt- och svampceller förblir vid liv under hela experimentet och interaktioner kan visualiseras i realtid. Slidor kan färgas eller utsättas för plasmolys för att studera utvecklingen av cytologi och livskraft hos värd- och patogenceller under infektion och kolonisering. Svampstammar som omvandlats till att uttrycka fluorescerande proteiner kan inokuleras eller saminokuleras på manteln för ökad upplösning och för att underlätta utvärderingen av konkurrerande eller synergistiska interaktioner. Svampstammar som uttrycker fluorescerande fusionsproteiner kan användas för att spåra och kvantifiera produktionen och inriktningen av dessa enskilda proteiner i planta. Inokulerade mantelvävnader kan extraheras för att karakterisera nukleinsyror, proteiner eller metaboliter. Användningen av dessa manteltester har i hög grad främjat de detaljerade studierna av mekanismerna för svamppatogenicitet i majs och även av svampproteineffektorer och sekundära metaboliter som bidrar till patogenicitet.
Introduction
Rumsliga och tidsmässiga analyser på cellulär nivå är avgörande för att förstå fysiologin och cytologin hos interaktioner mellan svampar och växter. Bladvävnader somhar fixerats kemiskt 1,2,3 eller rensats och färgats4, samt konstgjorda membran5, har tidigare använts för att undersöka cytologin för bladpatogenutveckling och interaktioner mellan växter och svampar. Att undersöka infektionshändelser i levande värdvävnader i realtid utan fixering eller rensning är dock utmanande på grund av tekniska problem relaterade till beredning av optiskt transparenta prover för avbildning.
I slutet av 1940-talet utvecklades ett protokoll för inokulering av lösryckta bladhöljen för mikroskopisk undersökning av resistens hos levande epidermala risceller mot risblastsvampen Magnaporthe oryza6. På senare tid har detaljerade molekylära, fysiologiska och cytologiska observationer av värdkolonisering av Colletotrichum– och Magnaporthe-arter i hög grad underlättats genom att kombinera modifierade versioner av denna bladmantelmetod med svamptransformanter som uttrycker fluorescerande proteiner, och högpresterande avbildningsprotokoll för levande celler, inklusive epifluorescens och konfokalmikroskopi 7,8,9,10,11,12,13.
Denna artikel beskriver ett optimerat inokuleringsprotokoll med hjälp av fristående majsbladshöljen för observation av infektionsprocesser av hemibiotrofa och nekrotrofa bladsvamppatogener. Vi har specifikt använt den för att studera Colletotrichum graminicola (C. graminicola), orsaken till bladmögel och stjälkröta, och Stenocarpella maydis, som orsakar bladmögel och stjälkröta. Metoden bör dock kunna tillämpas på andra hemibiotrofa och nekrotrofa bladsvamppatogener. Cytologiska och fysiologiska reaktioner under infektion och kolonisering i dessa utskurna bladskidor liknar dem i hela bladblad12,14,15. Dessutom liknar hemibiotrofisk kolonisering av mantelepidermala celler av C. graminicola kolonisering av stjälkmärgceller16,17. Fristående höljen uppvisar större synkronicitet och experimentell reproducerbarhet av svamppenetration och kolonisering än bladblad eller stjälkmärgsvävnader14,16,17,18. De flesta majssorter kan användas för detta protokoll. Inavlade eller hybrider med för mycket lila pigment i höljet är dock mindre lämpliga eftersom pigmenten stör avbildningen. Golden Jubilee sockermajs har varit särskilt användbar för våra studier eftersom obehandlade frön är kommersiellt tillgängliga, växterna är mycket mottagliga för många bladsjukdomar och de växer bra i växthuset. De första epidemierna av anthracnose stjälkröta i USA resulterade i en total förlust av sockermajsskördar i Indiana på1970-talet 19,20. Denna metod för ympning av bladhöljen kan användas för att direkt observera och kvantifiera svamptillväxt och utveckling i levande kontra lokalt dödade växtceller, för att påvisa resistensreaktioner i kompatibla/inkompatibla svar på svampinfektion och för att testa interaktioner mellan svampstammar på samma hölje i realtid.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den optimerade ympningsmetoden för bladslidor som beskrivs här är modifierad från ett originalprotokoll som utvecklades för och har tillämpats på risbladsskidor 6,8,36. Det möjliggör direkta, detaljerade observationer av svamptillväxt och utveckling i levande växtceller med antingen vidvinkel- eller konfokalmikroskopi. Protokollet är lämpligt för karakterisering, jämförelse och kvantifiering av en mängd olika mi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna tackar USDA-NIFA för deras ekonomiska stöd (anslagsnummer 2018-67013-28489 och 2020-70410-32901). Alla åsikter, resultat, slutsatser eller rekommendationer som uttrycks i detta manuskript är enbart författarnas och återspeglar inte nödvändigtvis åsikterna hos USA:s jordbruksdepartement. Vi tackar Science Without Borders gästande student från Brasilien, Mayara de Silva, för bilderna som visas i figur 6A och i figur 7D. Vi tackar också institutionen för växtpatologi vid University of Kentucky för att ha gett tillgång till Olympus konfokalmikroskop.
Materials
| Axiocam monochrome microscope camera | ZEISS | 426560-9010-000 | Compatible with the Axioplan 2 microscope; provides low read noise and high speed for live cell imaging |
| Axioplan 2 epifluorescence microscope | ZEISS | N/A | Allows live viewing and image/video capture of biological samples |
| Benchtop centrifuge 24 X 1.5/2 mL | Thermo Fisher Scientific | 75002431 | Sorvall Legend Micro 17; max speed: 13,300 rpm (17,000 x g) |
| Falcon bacteriological Petri dish with lid | Fisher Scientific | 08-757-105 | Polystyrene material; hydrophobic surface |
| Filter paper | Fisher Scientific | 09-920-115 | Whatman grade 1 for Petri plate moist chambers |
| FV 3000 laser scanning confocal microscope | Olympus | N/A | For visualization of fungal transformants' |
| Germination paper | Anchor Paper Co. | SD7615L | 76# heavy weight for plastic box moist chambers |
| Glass Petri dishes | VWR International | 75845-542 | Type 1 class A, 33 expansion borosilicate glass; complete set (cover + bottom), for Petri plate moist chambers |
| Glass wool | Ohio Valley Specialty Chemical | 3350 | For glass-wool filter units |
| Hemocytometer/Neubauer counting chamber and cover glass | VWR International | 15170-172 | 0.1 mm chamber depth; comes with two 0.4 mm cover glasses |
| Microscope coverslips | Fisher Scientific | 12-553-457 | Borosilicate glass; 100/Pk.; 22 mm length, 22 mm width |
| Maize cultivar Golden Jubilee seeds | West Coast Seeds Ltd., Delta, BC, Canada | CN361 | Matures in 95-105 days; seed type: F1 |
| Microcentrifuge tubes | USA Scientific | 1415-2500 | 1.5 mL capacity |
| Microscope slides | Fisher Scientific | 12-550-123 | Superfrost white tab slide; 76 mm length, 25 mm width |
| Oatmeal Agar (OA) | VWR International | 255210 | Difco Oatmeal Agar, BD; 500 g |
| Nail polish | Revlon | 43671 | Clear nail polish for sealing microscope slides; color 771 Clear |
| Non-skirted 96-well PCR plate | USA Sientific | 1402-9500 | 100 uL plate volume |
| Pestle for microcentrifuge tubes | USA Scientific | 1415-5390 | Conical tip; polypropylene material |
| PlanApo 60X/1,00 WLSM water objective | Olympus | 1-UB933 | Compatible with the Olympus FV 3000 confocal microscope |
| Potato Dextrose Agar (PDA) | VWR International | 90000-758 | Difco Potato Dextrose Media, BD; 500 g |
| Pro-Mix BX | Premium Horticulture Supply Co. | N/A | Premium general-purpose growing medium formulated to provide a balance of water retention and proper drainage |
| SC10 cone-tainers | Greenhouse Megastore | CN-SS-SC-10B | 1.5 inch diameter, 8.25 inch depth, and a volume of 164 mL |
| SC10 cone-tainers tray | Greenhouse Megastore | CN-SS-SCTR98 | 24 inch length x 12 inch width x 6.75 inch height; holds up to 98 of SC10 cone-tainers |
| Single edge razor blade | Thermo Fisher Scientific | 17-989-145 | AccuTec blade; steel material; 38 mm length blade |
| Storage containers/boxes with latch closure | Target | 002-02-0405 | Clear view storage boxes for rmoist chamber; outside dimensions: 23 5/8 inch x 16 3/8 inch x 6 1/2 inch; 32 qt. capacity |
References
- Cheng, Y., Yao, J., Zhang, H., Huang, L., Kang, Z. Cytological and molecular analysis of nonhost resistance in rice to wheat powdery mildew and leaf rust pathogens. Protoplasma. 252 (4), 1167-1179 (2015).
- Hickey, E. L., Coffey, M. D. A fine-structural study of the pea downy mildew fungus Peronospora pisi in its host Pisum sativum. Canadian Journal of Botany. 55 (23), 2845-2858 (1977).
- Wharton, P. S., Julian, A. M., O’Connell, R. J. Ultrastructure of the infection of Sorghum bicolor by Colletotrichum sublineolum. Phytopathology. 91 (2), 149-158 (2001).
- Latunde-Dada, A. O., et al. Infection process and identity of the hemibiotrophic anthracnose fungus (Colletotrichum destructivum O’Gara) from cowpea (Vigna unguiculata (L) Walp.). Mycological Research. 100 (9), 1133-1141 (1996).
- Bourett, T. M., Howard, R. J. In vitro development of penetration structures in the rice blast fungus Magnaporthe grisea. Canadian Journal of Botany. 68 (2), 329-342 (1990).
- Sakamoto, M. On the new method of sheath inoculation of rice plants with blast fungus, Pyricularia oryzae Cav., for the studying of the disease-resistant nature of the plant. Bulletin of the Institute for Agricultural Research, Tōhoku University. 1 (3), 120-129 (1949).
- Buiate, E. A., et al. A comparative genomic analysis of putative pathogenicity genes in the host-specific sibling species Colletotrichum graminicola and Colletotrichum sublineola. BMC genomics. 18 (1), 1-24 (2017).
- Kankanala, P., Czymmek, K., Valent, B. Roles for rice membrane dynamics and plasmodesmata during biotrophic invasion by the blast fungus. The Plant Cell. 19 (2), 706-724 (2007).
- Khang, C. H., et al. Translocation of Magnaporthe oryzae effectors into rice cells and their subsequent cell-to-cell movement. The Plant Cell. 22 (4), 1388-1403 (2010).
- Mosquera, G., Giraldo, M. C., Khang, C. H., Coughlan, S., Valent, B. Interaction transcriptome analysis identifies Magnaporthe oryzae BAS1-4 as biotrophy-associated secreted proteins in rice blast disease. The Plant Cell. 21 (4), 1273-1290 (2009).
- Sakulkoo, W., et al. A single fungal MAP kinase controls plant cell-to-cell invasion by the rice blast fungus. Science. 359 (6382), 1399-1403 (2018).
- Torres, M. F., Cuadros, D. F., Vaillancourt, L. J. Evidence for a diffusible factor that induces susceptibility in the Colletotrichum-maize disease interaction. Molecular Plant Pathology. 15 (1), 80-93 (2014).
- Valent, B., Khang, C. H. Recent advances in rice blast effector research. Current Opinion in Plant Biology. 13 (4), 434-441 (2010).
- Mims, C. W., Vaillancourt, L. J. Ultrastructural characterization of infection and colonization of maize leaves by Colletotrichum graminicola, and by a C. graminicola pathogenicity mutant. Phytopathology. 92 (7), 803-812 (2002).
- Vargas, W. A., et al. Plant defense mechanisms are activated during biotrophic and necrotrophic development of Colletotricum graminicola in maize. Plant Physiology. 158 (3), 1342-1358 (2012).
- Venard, C., Vaillancourt, L. Colonization of fiber cells by Colletotrichum graminicola in wounded maize stalks. Phytopathology. 97 (4), 438-447 (2007).
- Venard, C., Vaillancourt, L. Penetration and colonization of unwounded maize tissues by the maize anthracnose pathogen Colletotrichum graminicola and the related nonpathogen C. sublineolum. Mycologia. 99 (3), 368-377 (2007).
- Berruyer, R., Poussier, S., Kankanala, P., Mosquera, G., Valent, B. Quantitative and qualitative influence of inoculation methods on in planta growth of rice blast fungus. Phytopathology. 96 (4), 346-355 (2006).
- Belisário, R., Robertson, A. E., Vaillancourt, L. J. Maize anthracnose stalk rot in the genomic era. Plant Disease. 106 (9), 2281-2298 (2022).
- Warren, H. L., Nicholson, R. L., Ullstrup, A. J., Sharvelle, E. G. Observations of Colletotrichum graminicola on sweet corn in Indiana. Plant Disease Reporter. 57, 143-144 (1973).
- Ritchie, S. W., Hanway, J. J., Benson, G. O. How a corn plant develops. Special Report, Iowa State University. 48, (1986).
- Tuite, J. . Plant pathological methods: fungi and bacteria. , (1969).
- Wicklow, D. T., Rogers, K. D., Dowd, P. F., Gloer, J. B. Bioactive metabolites from Stenocarpella maydis, a stalk and ear rot pathogen of maize. Fungal Biology. 115 (2), 133-142 (2011).
- Daudi, A., O’Brien, J. A. Detection of hydrogen peroxide by DAB staining in Arabidopsis leaves. Bio-protocol. 2 (18), e263-e263 (2012).
- Benhamou, R. I., Jaber, Q. Z., Herzog, I. M., Roichman, Y., Fridman, M. Fluorescent tracking of the endoplasmic reticulum in live pathogenic fungal cells. ACS Chemical Biology. 13 (12), 3325-3332 (2018).
- Lorang, J. M., et al. fluorescent protein is lighting up fungal biology. Applied and Environmental Microbiology. 67 (5), 1987-1994 (2001).
- Liu, C. Y., Zhu, J., Xie, Z. Visualizing yeast organelles with fluorescent protein markers. JoVE (Journal of Visualized Experiments). 182, e63846 (2022).
- Westermann, B., Neupert, W. Mitochondria-targeted green fluorescent proteins: convenient tools for the study of organelle biogenesis in Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 16 (15), 1421-1427 (2000).
- Lee, A. S. The ER chaperone and signaling regulator GRP78/BiP as a monitor of endoplasmic reticulum stress. Methods. 35 (4), 373-381 (2005).
- Krishnakumar, V., et al. A maize database resource that captures tissue-specific and subcellular-localized gene expression, via fluorescent tags and confocal imaging (Maize Cell Genomics Database). Plant and Cell Physiology. 56 (1), e12-e12 (2015).
- Wu, Q., Luo, A., Zadrozny, T., Sylvester, A., Jackson, D. Fluorescent protein marker lines in maize: generation and applications. International Journal of Developmental Biology. 57 (6-7-8), 535-543 (2013).
- O’Connell, R. J., et al. Lifestyle transitions in plant pathogenic Colletotrichum fungi deciphered by genome and transcriptome analyses. Nature Genetics. 44 (9), 1060-1065 (2012).
- Torres, M. F., et al. A Colletotrichum graminicola mutant deficient in the establishment of biotrophy reveals early transcriptional events in the maize anthracnose disease interaction. BMC Genomics. 17 (202), 1-24 (2016).
- Andrie, R. M., Martinez, J. P., Ciuffetti, L. M. Development of ToxA and ToxB promoter-driven fluorescent protein expression vectors for use in filamentous ascomycetes. Mycologia. 97 (5), 1152-1161 (2005).
- Gordon, C. L., et al. Glucoamylase:: green fluorescent protein fusions to monitor protein secretion in Aspergillus niger. Microbiology. 146 (2), 415-426 (2000).
- Koga, H., Dohi, K., Nakayachi, O., Mori, M. A novel inoculation method of Magnaporthe grisea for cytological observation of the infection process using intact leaf sheaths of rice plants. Physiological and Molecular Plant Pathology. 64 (2), 67-72 (2004).
- Xavier, K. V., Pfeiffer, T., Parreira, D. F., Chopra, S., Vaillancourt, L. Aggressiveness of Colletotrichum sublineola strains from Sorghum bicolor and S. halepense to sweet sorghum variety Sugar Drip, and their impact on yield. Plant Disease. 101 (9), 1578-1587 (2017).
