Intramikroskopi av Leukocytt-endothelial og blodplater-leukocytt Interaksjon i Mesenterial Vener i Mus

Abstract

Intravital mikroskopi er en metode som kan brukes til å undersøke ulike prosesser i forskjellige områder og fartøyer i levende dyr. I denne protokollen beskriver vi intramikroskopi av mesentery årer. Dette kan utføres i en kort periode med reproduserbare resultater viser leukocytt-endotel interaksjoner in vivo. Vi beskriver en inflammatorisk omgivelser etter LPS utfordringen endotelet. Men i denne modellen kan man bruke mange forskjellige typer av betennelsestilstander, som bakteriell, kjemiske eller biologiske og undersøke administrering av legemidler og deres direkte effekter på levende dyr og dens innvirkning på leukocytter rekruttering. Denne protokollen har vært brukt med hell til en rekke forskjellige behandlinger av mus og deres effekt på inflammatorisk reaksjon i skip. Heri beskriver vi visualisering av leukocytter og blodplater av fluorescens merking disse med rhodamine 6G. I tillegg kan en hvilken som helst spesifikk avbildning være performed bruker målrettede fluorescensmerkede molekyler.

Introduction

Hensikten med denne protokollen er å beskrive en forenklet teknikk for intravital mikroskopi av mesenteriet årer i levende mus for direkte observasjon av leukocytt-endotel og leukocytt-blodplateinteraksjoner henhold inflammatoriske tilstander.

Intravital mikroskopi ble utviklet for å studere leukocytt-endotel interaksjoner in vivo i henhold til inflammatoriske tilstander ^1,2, som ikke er ubetydelig, men viktig for forståelsen av inflammatorisk leukocytt-rekruttering og funksjon. Metoden vi beskriver i denne protokollen ble utviklet basert på tidligere publiserte publikasjoner. I likhet med visualisering av blodplate inkorporering i en voksende trombe ³ og parallelt til det som er publisert tidligere ⁴ er et exteriorized mesenteriet vene undersøkt ved hjelp av transmittert lys-mikroskopi. Det finnes ulike andre modeller av intra-vital mikroskopi som cremaster muskel av rotter ⁵ eller lever av mus og rotter ^6.

Intramikroskopi av mesentery vene har blitt utviklet og anvendt i tidligere studier av flere grupper. Vi har brukt denne teknikken til å observere forskjeller i leukocytt rekruttering mellom villtype mus og tryptofan hydroxylase1 (Tph1) - / - mus, som er mangel av ikke-nevronale serotonin og sammenlignet funnene til mus som plate serotonin ble farmakologisk oppbrukt av langsiktig søknad en selektiv serotonin reuptake inhibitor fluoksetin ^7. Vi har også undersøkt leukocyttpopulasjoner-endothelial interaksjoner etter akutt fluoksetin behandling ^8.

I denne protokollen har vi fokus på intramikroskopi av mesentery årer, fordi denne modellen kan gjennomføres raskt, og lar gyldige målinger av leukocytter-endothelial og blodplate leukocytt interaksjoner. Dette er mye mer vanskelig og tidkrevende i intravital mikroskopi av andre organer, slik som ben, lever, hud, muskel eller cremaster. Modusenl er beskrevet her er ideell for reproduserbar evaluering av inflammatorisk celle-celle-interaksjon etter challengeing den med en inflammatorisk stimulus, så som intraperitoneal injeksjon med lipopolysakkarid.

Protocol

Alle dyreforsøk ble utført i samsvar med den tyske dyrevern lov (TierSchG). Musene ble plassert og behandles i samsvar med god dyr praksis som definert av FELASA (www.felasa.eu/guidelines.php) og det nasjonale dyrevelferd kroppen GV-SOLAS (www.gv-solas.de/index.html). Den dyrevelferd komité ved Universitetet i Freiburg, samt de lokale myndigheter (Regierungspräsidium Freiburg) godkjent alle dyreforsøk.

1. Animal Handling, Utarbeidelse og Induksjon av Betennelse

1. Bruk 4-6 uker gamle hannmus med en vekt rekke 16-20 g. Merk: Hvis mus er eldre eller tyngre de presenterer mye fett rundt fartøyet, noe som begrenser den mikroskopiske observasjon.
2. Sterilisere alle verktøy og mikroskop bordet før operasjonen.
3. Injiser 20 mg / kg LPS (lipopolysakkarid) intraperitonealt 4 timer før mikroskopi inn i levende mus for å indusere en bakteriell Inflammasjon.
4. Prewarm en 0,9% saltoppløsning i et vannbad ved 37 ° C for å fukte plastkammer og mesenteriet vev.
5. Bedøve mus med intraperitoneal injeksjon av ketamin (100 mg / kg) og xylazin (5 mg / kg) like før mikros prosedyren. Alternative bedøvelse kan anvendes, f.eks, 2% isofluran inhalering. Bekreft riktig anesthetization ved tap av respons på refleks stimulering (tå eller hale knipe med fast trykk).
6. Fjerne håret magen ved hjelp av en barbermaskin og fjerne løse hår med gasbind mettet med etanol 70%.
7. Påfør dyrlege salve på øynene av musen for å hindre tørrhet, mens under anestesi.

2. kirurgi

1. Sterilisere magen ved hjelp av 70% etanol. Denne metoden er ikke en steril metode og kan være dødelig ved slutten av forsøket.
2. Utfør en median laparotomi: Åpne abdominal hud ved hjelp av små, buede pinsett og liten saks. Identifiser epigastrical fartøy og åpne peritoneum i området ved den linea alba, for å beskytte skip.
3. Påfør noen dråper forvarmet saltvann inn i bukhulen for å holde vevet fuktig.
4. Etikett leukocytter og blodplater fluorescens ved å injisere 50 pl rodamin 6G (1 mg / ml) retro-orbitalt som tidligere beskrevet ^9,10.
5. Exteriorize en løkke av ileumand sted det i en petriskål med en diameter på 10 cm, og sørg for å holde vevet fuktig ved bruk av 37 ° C forvarmet saltvannsoppløsning (0,9%) hvert andre minutt.

3. intraMikros

1. Plasser mus under mikroskopet og bringe mesenteriet vene med en diameter på 200 - 300 pm i sentrum av visningen. Velge et fartøy uten synlig fett omgivelser.
2. Ikke berør mesenterium fartøyene dermed unngå stimulering av endotelet. Håndter ileum løkken forsiktig.
3. Visualblodcelle endothelial interaksjonermed en invertert eller oppreist mikroskop og et kamera ved hjelp av et mikroskop programvare. Record blodcelle endothelial interaksjoner for 1 min i 4 forskjellige årer per mus.
4. Avlive musen ved cervikal dislokasjon etter fullføring av bildebehandlings eksperimenter.

4. Analyse

1. Utføre analysen offline og blindet for alle parametere. Utføre analyser ved hjelp av en egnet program.
2. Bekreft stabile og interindividually sammenlignblodstrømningsforholdene i høy tid oppløsning cine-klipp (maksimal bildefrekvens) fokusert på intraluminal blodlegemer flyt.
3. Kvantifisere antallet av rullende leukocytter. Derfor tegne en vertikal linje gjennom venen og telle alle leukocytter krysser denne linjen i 1 min.
4. Bestem valsehastigheten ved å måle tiden en enkelt leukocytt må passere en avstand på 50 mikrometer, mens stabilt rullende på endotel. For å gjøre dette, trekker to vertikale linjer i en avstand på 50 mikrometer through venen.
   1. Mål tiden en representant leukocytter trenger å komme fra en linje til other.Calculate hastigheten på leukocytter ved å dividere 50 mikrometer gjennom den tiden som trengs (mikrometer / s).
5. Måle leukocytt adhesjon i et felt av 0,04 mm ^2. For å gjøre dette, tegne et kvadrat med sidelengde på 200 mikrometer inn i venen.
   1. Tell fast tilhenger leukocytter, definert som ingen synlige bevegelser i 30 sek, innen denne plassen.
6. Tell antall blodplater bundet til en leukocytt å kvantifisere blodplate-leukocytt interaksjoner.

Representative Results

En oversikt over den eksperimentelle omgivelser er beskrevet i denne protokollen er vist i figur 1. Det viser en mus med en exteriorized ileum-løkke og sine fartøyer, noe som kan observeres i intravital mikroskopi. Figur 2 viser viss grad av aktivering i ubehandlede dyr på grunn selve inngrepet. Men det er nesten ingen langsom valsing eller fast adhesjon av leukocytter i forhold til LPS-behandlede mus. Figur 2 viser også de forskjellige resultatene av intravital mikroskopi i villtype-mus som enten ble behandlet med fluoksetin i 3 uker i drikkevannet eller i ubehandlede mus. Figur 2aeller C viser resultatene uten ytterligere inflammatorisk utfordring med LPS, mens musene i figur 2F-H ble behandlet med LPS i tillegg. Her kan vi se høyere antall rullende og tilhenger leukocytter, mens rullende hastigheten redusert etter LPS utfordring. Med disse eksperimentene kunne vi vise at plate serotonin er crucial for de første trinnene av leukocytt rekruttering i betennelse ^7.

I figur 3, ble intravital mikroskopi utført uten ytterligere LPS utfordring og like etter akutt behandling med fluoksetin intraperitonealt 2 timer før operasjonen. Her kan vi se høyere antall fast tilhenger leukocytter og lavere rullehastigheter i fluoksetin behandlet mus, noe som indikerer en påvirkning av akutt fluoksetin behandling på leukocytter-endothelial interaksjoner ^8.

I figur 4 blodplate-leukocytt interaksjoner under lipopolysakkarid indusert peritonitt visualiseres i en vene. Blodplater er roset rundt leukocytter og disse kompleksene er i samspill med karveggen.

Figur 1. Oversikt over den eksperimentelle innstillinger. (A) En bedøvet mus med exteriorized ileum-løkke og dets mesenterium fartøy (svart pil). (B) intra mikroskop med plassert mus (rød pil) under objektiv (sort pil). Lyskilde (svart pilspiss) og kamera (rød pilspiss) er merket. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2. intraMikros Etter 3 uker Administrasjon av Fluoxetin til villtype mus enten med eller uten LPS Challenge. Modifisert fra ⁷ (A) Antall rullende leukocytter uten LPS-stimulering. (B) Leukocyte hastighet uten LPS stimulering. (C) Antall fast adherente leukocytter uten LPS-stimulering.(D) Eksempel på et fartøy på et ubehandlet WT mus uten LPS utfordring. (E) Eksempel på et fartøy av en fluoksetin behandlet mus uten LPS utfordring. (F) Antall rullende leukocytter etter LPS-stimulering. (G) Leukocytt hastighet etter LPS-stimulering. (H) Antall fast tilhenger leukocytter etter LPS stimulering. (I) Eksempel på et fartøy på et ubehandlet WT mus etter LPS-utfordringen. (J) Eksempel på et fartøy av et fluoksetin-behandlede mus etter LPS-utfordringen. Scale bar = 100 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3: intraMikros Etter Akutt Fluoksetin Challenge 2 timer før operasjonen medut LPS Challenge. Modifisert fra ⁸ A) Antall rullende leukocytter uten LPS-stimulering. B) Leukocyte hastighet uten LPS stimulering. C) Antall fast tilhenger leukocytter uten LPS stimulering. D) Eksempel på et fartøy på et ubehandlet WT mus uten LPS utfordring. E) Eksempel på et fartøy av en akutt fluoksetin behandlet mus uten LPS utfordring. Scale bar = 100 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 4:. Blodplate leukocyttpopulasjoner Interactions in vivo Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Representativt bilde av plate leukocytter interhandlinger i mus in vivo under lipopolysakkarid indusert peritonitt i årer. Opptrykk fra ^11.

Discussion

Heri vi beskriver forberedelsene og utførelsen av intravital mikroskopi av mesentery årer av mus in vivo. Denne metoden gir oss muligheten til å observere leukocyttpopulasjoner-endothelial og plate endothelial interaksjoner ¹¹ direkte i levende organisme.

Som en tidlig reaksjon på betennelser endotelet blir aktivert og samhandler med leukocytter og blodplater som resulterer i et bølgende, heft og sjele ^12. Men leukocytter også samhandle med blodplater danner såkalte plate leukocyttpopulasjoner komplekser, hovedsakelig plate nøytrofile komplekser (PNCs) og blodplate monocytter komplekser (PMC) ^13,14 .Disse interaksjoner kan observeres og kvantifisert i denne metoden.

I tillegg denne teknikken tillater etterforsker endotelet aktivering med markører som VCAM-1 eller ICAM-1 (for eksempel etter plate / leukocyttpopulasjoner interaksjoner) ^15.

Den fysiske stimuli av prosedyren i seg selv fører til en viss grad av endotel-aktivering, noe som fører til synlige rulling av leukocytter (men nesten ingen langsom rulle- og ingen faste adhesjon). Dette innebærer at sensor må håndtere mesenteriet med stor forsiktighet. Dersom det er for mye aktivering forårsaket av råolje håndtere det vil resultere i forhøyet antall av valsing og adherente leukocytter. For å nå en reproduserbar antall 30-80 rullende leukocytter per minutt i villtype mus sensor må trenes.

Blokkering av P-selektin / PSGL-interaksjon kan tjene som en kontroll for å bekrefte interaksjonen av leukocytter med endotel. Det utelukker at leukocytter passivt "knyttet" til endotelet, en situasjon som kan oppstå dersom blodstrømmen er sterkt redusert.

Mesenterium fartøy diameter varierer om 200-300 mikrometer. Derfor er denne metode ikke er egnet for å vurdere mikrosirkulasjon i kapillærene, men fokusererpå leukocytter-endothelial interaksjoner i små, betente vener, den primære sted for sjelevandring av leukocytter. Sammenlignet med andre intra-vitale mikroskopi metoder som cremaster modellen, er denne metode lettere å lære og kan utføres i en kortere tidsperiode.

En av de vesentlige begrensninger ved denne metoden er at musene må være små uten mye mesenteriet fett for å ha en god utsikt til fartøyene, slik at denne metoden ikke kan utføres etter lange forings eller behandlingsstudier.

Når kontrollanten er trent, kan ulike betennelsestilstander bli undersøkt med denne metoden, som for eksempel bruk av LPS, thioglycollate, TNFa eller histamin. En mer spesifikk avbildning av bestemte blodceller kan oppnås ved hjelp av målrettet fluorescerende merkede molekyler. Totalt sett er denne metoden lett å lære og en rask måte å undersøke leukocytt-endothelial og blodplate leukocytt interaksjoner i en levende organisme.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Rhodamine 6G	Sigma-Aldrich	989-38-8
Lipopolysaccharides from Escherichia coli 055:B5	Sigma-Aldrich	L2637