Abstract
Microscopia intravital é um método que pode ser usado para investigar processos diferentes em regiões diferentes e vasos em animais vivos. Neste protocolo, descrevemos microscopia intravital das veias mesentério. Esta pode ser realizada num curto período de tempo com resultados reprodutíveis mostrando interacções leucócito-endotélio in vivo. Nós descrevemos um ambiente inflamatório após LPS desafio do endotélio. Mas neste modelo pode-se aplicar muitos tipos diferentes de condições inflamatórias, como bactérias, química ou biológica e investigar a administração de drogas e seus efeitos diretos sobre o animal vivo e seu impacto sobre o recrutamento de leucócitos. Este protocolo foi aplicado com sucesso a um número de diferentes tratamentos dos ratos e dos seus efeitos sobre a resposta inflamatória nos vasos. Descrevemos a visualização de leucócitos e plaquetas por fluorescência rotulando-os com rodamina 6G. Além disso, qualquer imagem específica pode ser PErformed usando moléculas fluorescente etiquetado alvejados.
Introduction
O objectivo deste protocolo é descrever uma técnica simplificada de microscopia intravital das veias mesentério em ratos vivos para observação direta da interação leucócito-endotélio e leucócitos-plaquetas em condições inflamatórias.
Microscopia intravital foi desenvolvido para estudar as interacções leucócito-endotélio in vivo sob condições inflamatórias 1,2, o que não é trivial, mas importante para compreender o recrutamento de leucócitos inflamatórios e função. O método que nós descrevemos nesse protocolo foi desenvolvido com base em publicações anteriormente publicados. Semelhante a visualização de incorporação de plaquetas num trombo crescente 3 e em paralelo com o que foi anteriormente publicado 4, uma veia mesentério exteriorizada é examinada por microscopia de luz transmitida. Existem vários outros modelos de microscopia intra-vital, como o músculo cremaster de ratos 5 ou fígado de rato e ratos 6.
Microscopia intravital da veia mesentério foi desenvolvido e aplicado em estudos anteriores por vários grupos. Temos usado essa técnica para observar diferenças no recrutamento de leucócitos entre camundongos selvagens e hydroxylase1 triptofano (TPH1) - / - ratos, que são deficientes de serotonina não-neuronal e compararam os resultados aos camundongos cujos serotonina de plaquetas foi farmacologicamente esgotados por longo prazo aplicação a um inibidor seletivo da recaptação da serotonina fluoxetina 7. Examinamos, também, interações leucócito-endotélio após o tratamento com fluoxetina aguda 8.
Neste protocolo nos concentramos em microscopia intravital das veias mesentério, porque este modelo pode ser realizada rapidamente, e permite medições válidas de interação leucócito-endotélio e plaquetas-leucócitos. Isto é muito mais difícil e em microscopia intravital de outros órgãos, tais como o osso, fígado, pele, músculo cremaster ou demorada. O modo del descrito aqui é ideal para a avaliação reprodutível de interacção célula-célula inflamatória após challengeing-o com um estímulo inflamatório, tal como a injecção intraperitoneal de lipopolissacarídeos.
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Protocol
Todos os experimentos com animais foram realizados em conformidade com a lei de proteção animal Alemão (TierSchG). Os ratos foram alojados e tratados de acordo com as boas práticas animal, definidos no FELASA (www.felasa.eu/guidelines.php) eo corpo bem-estar animal nacional GV-SOLAS (www.gv-solas.de/index.html). O animal comitê de bem-estar, da Universidade de Freiburg, bem como as autoridades locais (Regierungspräsidium Freiburg) aprovou todas as experiências com animais.
1. Handling Animal, Preparação e indução da inflamação
- Use 4-6 semanas de idade ratos macho com uma faixa de peso de 16-20 g. Nota: Se eles os ratinhos mais velhos são mais pesados ou apresentam excesso de gordura que envolve o recipiente, o que limita a observação microscópica.
- Esterilizar todas as ferramentas e mesa microscópio antes da cirurgia.
- Injectar 20 mg / kg de LPS (lipopolissacárido) intraperitonealmente quatro horas antes da microscopia no rato vivo para induzir uma Inflamm bacterianação.
- Pré-aquecer uma solução salina a 0,9% num banho-maria a 37 ° C para humidificar a câmara de plástico e o tecido mesentério.
- Anestesiar o rato com injecção intraperitoneal de cetamina (100 mg / kg) e xilazina (5 mg / kg) imediatamente antes do procedimento de microscopia. Anestesia alternativos podem ser utilizados, por exemplo, 2% a inalação de isoflurano. Confirme anestesia adequada pela perda de resposta à estimulação reflexa (dedo do pé ou cauda pitada com pressão firme).
- Depilar o abdome utilizando uma máquina de barbear e remover cabelo solto com gaze saturada com etanol 70%.
- Aplicar veterinário pomada sobre os olhos do mouse para evitar a secura, sob anestesia.
2. Cirurgia
- Esterilizar os abdome utilizando etanol a 70%. Este método não é um método de estéril e pode ser letal no final da experiência.
- Executar uma laparotomia mediana: Abra a pele abdominal usando uma pinça pequenos, curvos e uma tesoura pequena. Identificar o epivasos gastrical e abrir o peritoneu na região da linea alba, para proteger os vasos.
- Aplicar algumas gotas de solução salina pré-aquecido para dentro da cavidade abdominal para manter o tecido húmido.
- Etiqueta de leucócitos e plaquetas fluorescência por injecção de 50 ul de rodamina 6G (1 mg / ml) retro-orbitalmente, tal como descrito antes 9,10.
- Exteriorizar um laço de lugar ileumand-lo em uma placa de Petri com um diâmetro de 10 cm e certifique-se de manter o tecido úmido, aplicando a 37 ° C pré-aquecido solução salina (0,9%) a cada dois minutos.
3. Microscopia intravital
- Colocar o rato sob o microscópio e trazer a veia mesentério com um diâmetro de 200-300 uM no centro de visão. Escolha uma embarcação sem arredores gordura visível.
- Não toque nos vasos mesentério evitando assim a estimulação do endotélio. Pega o loop íleo cautela.
- Visualize interações celulares do endotélio sanguecom um microscópio invertido ou vertical e uma câmera usando um software de microscópio. Grave sangue interações celulares do endotélio para 1 min em 4 veias diferentes por mouse.
- Eutanásia o rato por luxação cervical após a conclusão de experiências de imagiologia.
4. Análise
- Realizar a análise off-line e cego para todos os parâmetros. Realizar análise usando qualquer programa de software adequado.
- Confirme condições estáveis e interindividually comparáveis fluxo sanguíneo em alta resolução tempo cine-clips (taxa de quadros máxima) com foco no fluxo de glóbulos intraluminal.
- Quantificar o número de leucócitos de rolamento. Therefor desenhar uma linha vertical através da veia e contar todos os leucócitos atravessam esta linha em 1 min.
- Determinar a velocidade de rolamento através da medição do tempo de um único leucócitos tem de passar por uma distância de 50 mm, enquanto estavelmente rolando sobre o endotélio. Para fazer isso, desenhe duas linhas verticais em uma distância de 50 mm ttravés da veia.
- Medir o tempo de um representante de leucócitos deve começar a partir de uma linha para a other.Calculate a velocidade dos leucócitos dividindo-se 50 mm através do tempo necessário (mm / s).
- Medir a adesão de leucócitos em um campo de 0,04 mm2. Para fazer isso, desenhar um quadrado com o comprimento de 200 um lado para dentro da veia.
- Conte os leucócitos aderentes firmes, definidos como nenhum movimento visível durante 30 segundos, dentro deste quadrado.
- Contar o número de plaquetas ligadas a um dos leucócitos para quantificar interacções plaquetas-leucócitos.
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Representative Results
Uma visão geral da configuração experimental descrito neste protocolo é demonstrado na Figura 1. Ela mostra um rato com um íleo-ciclo exteriorizado e seus navios, o que pode ser observado em microscopia intravital. A Figura 2 mostra certo grau de activação em animais não tratados devido a o procedimento em si. Mas não há quase nenhum rolamento lenta ou adesão firme dos leucócitos em comparação com os ratinhos tratados com LPS. A Figura 2 também mostra os diferentes resultados de microscopia intravital em ratinhos de tipo selvagem ou tratados com fluoxetina durante 3 semanas, na água potável ou de ratinhos não tratados. A Figura 2A- C mostram os resultados sem qualquer outro desafio inflamatório com LPS, enquanto os ratos na Figura 2F-H foram tratados com LPS, além disso. Aqui podemos ver números mais elevados de rolamento e leucócitos aderentes, enquanto a velocidade de rolamento diminuiu após o desafio LPS. Com estas experiências pudéssemos mostrar que a serotonina de plaquetas é crucial para as etapas iniciais de recrutamento de leucócitos na inflamação 7.
Na Figura 3, microscopia intravital foi realizado sem mais provocação com LPS e apenas após o tratamento com fluoxetina aguda por via intraperitoneal 2 horas antes da cirurgia. Aqui podemos ver números mais elevados de leucócitos firmemente aderentes e menores velocidades de rolamento em ratinhos tratados com fluoxetina, indicando uma influência do tratamento com fluoxetina aguda na interação leucócito-endotélio 8.
Na Figura 4 interacções plaquetas-leucócitos durante a peritonite induzida por lipopolissacáridos são visualizados dentro de uma veia. As plaquetas são rosetas em torno dos leucócitos e estes complexos estão interagindo com a parede do vaso.
Figura 1. Visão geral das configurações experimentais. (A) Um rato anestesiado com exteriorizado íleo-loop e seus navios mesentério (seta preta). (B) microscópio intravital com rato colocado (seta vermelha) embaixo do objectivo (seta preta). Fonte de luz (seta preta) e câmera (seta vermelha) estão marcados. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. Microscopia intravital Depois de 3 semanas de administração de fluoxetina para ratos tipo selvagem com ou sem LPS Challenge. Modificado de 7 (A) número de leucócitos de rolamento sem LPS-estimulação. (B) a velocidade de leucócitos sem estimulação LPS. (C) Número de leucócitos, firmemente aderentes, sem estimulação com LPS.(D) Exemplo de um navio de um rato WT não tratada sem desafio LPS. (E) Exemplo de um navio de um ratinho tratado com fluoxetina sem desafio LPS. (F) Número de leucócitos de rolamento após estimulação com LPS. (G) velocidade de leucócitos após a estimulação com LPS. (H) Número de leucócitos, firmemente aderentes após a estimulação com LPS. (I) Exemplo de um navio de um rato não tratado WT após o desafio com LPS. (J) Exemplo de um navio de um ratinho tratado com fluoxetina após o desafio com LPS. Scale bar = 100 mm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Microscopia intravital Depois aguda Fluoxetina Challenge 2 horas antes da cirurgia comfora LPS Challenge. Modificado de 8 A) número de leucócitos de rolamento sem LPS-estimulação. B) a velocidade de Leucócitos, sem estimulação com LPS. C) Número de leucócitos, firmemente aderentes, sem estimulação com LPS. D) Exemplo de um navio de um rato WT não tratada sem desafio LPS. E) Exemplo de um navio de um ratinho tratado com fluoxetina aguda sem desafio LPS. Scale bar = 100 mm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4:. Interações plaquetas de leucócitos in vivo Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Imagem representativa das plaquetas-leucócitos, interações em ratos in vivo durante lipopolissacarídeo induziu peritonite nas veias. Reimprimir a partir de 11.
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Discussion
Aqui, descrevemos a preparação e realização de microscopia intravital das veias mesentério de ratos in vivo. Este método nos dá a oportunidade de observar as interações leucócito-endotélio e plaquetas-endotélio 11 diretamente no organismo vivo.
Como uma resposta rápida a inflamação do endotélio é ativado e interage com leucócitos e plaquetas, resultando em rolamento, adesão e transmigração 12. Mas também os leucócitos interagem com plaquetas formando os chamados, complexos de plaquetas-leucócitos, predominantemente complexos de plaquetas de neutrófilos (PNCs) e complexos de plaquetas de monócitos (EPM) 13,14 .Estes interacções podem ser observados e quantificados no presente método.
Além disso, esta técnica permite investigar a activação do endotélio com marcadores como VCAM-1 ou ICAM-1 (por exemplo, depois de interacções plaquetas / leucócitos) 15.
O estímulo físico do próprio procedimento faz com que um certo grau de activação endotelial, o que leva a laminagem visível de leucócitos (mas quase nenhum rolamento lento e sem adesão firme). Isto implica que o examinador precisa lidar com o mesentério com grande cuidado. Se houver muita ativação causada por bruto manuseá-lo irá resultar em números elevados de rolamento e leucócitos aderentes. Para chegar a um número reprodutível de 30-80 leucócitos de rolamento por minuto em camundongos selvagens o examinador tem que ser treinado.
Bloqueio de P-selectina / PSGL-interacção poderia servir como um controlo para confirmar a interacção dos leucócitos com o endotélio. Ele exclui que os leucócitos são passivamente "ligado" ao endotélio, um cenário que pode ocorrer se o fluxo sanguíneo é fortemente reduzida.
Diâmetro do vaso varia sobre mesentério 200-300 | im. Assim, este método não é adequado para avaliar a microcirculação nos capilares, mas concentrana interação leucócito-endotélio em pequenas veias inflamadas, o principal local para a transmigração dos leucócitos. Em comparação com outros métodos de microscopia intra-vitais, tais como o modelo cremaster, este método é mais fácil de aprender e pode ser realizado num período de tempo mais curto.
Uma das limitações mais importantes deste método é que os ratos precisam ser jovem, sem muita gordura mesentério para ter uma boa vista para os navios, de modo que este método não pode ser realizada após estudos de alimentação ou tratamentos longos.
Uma vez que o examinador está treinado, diferentes condições inflamatórias podem ser examinados com este método, tais como a aplicação de LPS, tioglicolato, TNF ou histamina. Mais imagiologia específica de células sanguíneas específicas pode ser conseguida por meio de moléculas marcadas por fluorescência segmentados. No geral, este método é fácil de aprender e uma maneira rápida de examinar as interações leucócito-endotélio e plaquetas-leucócitos em um organismo vivo.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Rhodamine 6G | Sigma-Aldrich | 989-38-8 | |
| Lipopolysaccharides from Escherichia coli 055:B5 | Sigma-Aldrich | L2637 |
References
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