Abstract
intravital المجهري هو طريقة التي يمكن استخدامها للتحقيق في عمليات مختلفة في مناطق مختلفة والسفن في الحيوانات الحية. في هذا البروتوكول، وصفنا intravital المجهري الأوردة مساريق. هذا لا يمكن أن يؤديها في فترة قصيرة من الوقت مع نتائج استنساخه تظهر تفاعلات الكريات البيض البطاني في الجسم الحي. وصفنا بيئة التهابات بعد التحدي LPS من البطانة. ولكن في هذا نموذج واحد يمكن تطبيق العديد من أنواع مختلفة من حالات الالتهابات، مثل بكتيريا أو كيميائية أو بيولوجية والتحقيق في إدارة المخدرات وآثارها المباشرة على الحيوانات الحية وتأثيرها على تجنيد الكريات البيض. وقد تم تطبيق هذا البروتوكول بنجاح لعدد من العلاجات المختلفة من الفئران وآثارها على الاستجابة للالتهابات في الأوعية. هنا، نحن تصف التصور من الكريات البيضاء والصفائح الدموية التي وصفها fluorescently هذه مع رودامين 6G. بالإضافة إلى ذلك، يمكن لأي التصوير معين يكون المؤسسة العامةrformed باستخدام استهداف جزيئات fluorescently المسمى.
Introduction
والغرض من هذا البروتوكول هو لوصف أسلوب مبسط لintravital المجهري الأوردة مساريق في الفئران التي تعيش على الملاحظة المباشرة للتفاعلات الكريات البيض البطانية والكريات البيض الصفيحات في ظل ظروف التهابات.
وقد وضعت intravital المجهري لدراسة التفاعلات الكريات البيض البطاني في الجسم الحي في ظل ظروف التهابات 1،2، وهي ليست تافهة ولكنها مهمة لفهم التوظيف الكريات البيض الالتهابية وظيفة. تم تطوير طريقة وصفنا في هذا البروتوكول على أساس المنشورات التي تم نشرها مسبقا. على غرار تصور الصفائح الدموية التأسيس في خثرة المتزايد 3 وبالتوازي مع ما تم نشره في وقت سابق من 4، يتم فحص لمساريق الوريد exteriorized التي تنتقل عن طريق المجهر الضوئي. وهناك نماذج أخرى مختلفة من المجهري داخل حيوية مثل العضلات المشمرة الجرذان 5 أو كبد الفأر والجرذان 6.
وقد تم تطوير intravital المجهري من مساريق الوريد وتطبيقها في دراسات سابقة من قبل عدة مجموعات. وقد استخدمنا هذه التقنية لمراقبة الاختلافات في التوظيف الكريات البيض بين الفئران نوع البرية وhydroxylase1 تريبتوفان (Tph1) - / - الفئران التي تعاني من نقص السيروتونين غير العصبية ومقارنة النتائج مع الفئران التي تم المنضب دواء من قبل على المدى الطويل السيروتونين الصفائح الدموية تطبيق على امتصاص السيروتونين الانتقائية المانع فلوكستين 7. لقد درست أيضا التفاعلات الكريات البيض البطانية بعد العلاج فلوكستين الحادة 8.
في هذا البروتوكول ونحن نركز على intravital المجهري الأوردة مساريق، لأن هذا النموذج لا يمكن أن يؤديها بسرعة، ويسمح القياسات الصحيحة من التفاعلات الكريات البيض البطانية والصفيحات الكريات البيض. وهذا هو أكثر من ذلك بكثير صعبة وintravital المجهري من الأجهزة الأخرى، مثل العظام والكبد والجلد، أو العضلات المشمرة تستغرق وقتا طويلا. وضعل الموصوفة هنا هو المثل الأعلى للتقييم استنساخه من التهابات التفاعل خلية خلية بعد challengeing مع حافز التهابات، مثل حقن داخل الصفاق من lipopolysaccharide في.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وقد أجريت التجارب على الحيوانات فقط وفقا لقانون حماية الحيوان الألماني (TierSchG). وتم إيواء الفئران والتعامل معها وفقا للممارسة الحيوان جيدة كما حددتها FELASA (www.felasa.eu/guidelines.php) وهيئة الرفق بالحيوان الوطنية GV-سولاس (www.gv-solas.de/index.html). وافقت لجنة رعاية الحيوان من جامعة فرايبورغ وكذلك السلطات المحلية (Regierungspräsidium فرايبورغ) جميع التجارب على الحيوانات.
1. التعامل مع الحيوان، إعداد وتحريض التهاب
- استخدام 4-6 الاسبوع الفئران الذكور القديم مع مجموعة وزن 16-20 جم. ملاحظة: إذا كانت الفئران الأكبر سنا أو أثقل ما يقدمونه الدهون الزائدة المحيطة السفينة، مما يحد من الملاحظة المجهرية.
- تعقيم جميع الأدوات والجدول المجهر قبل الجراحة.
- حقن 20 ملغ / كغ LPS (lipopolysaccharide في) البريتونى 4 ساعات قبل المجهري في فأر حي للحث على inflamm البكتيريةأوجه.
- Prewarm محلول ملحي 0.9٪ في حمام مائي عند 37 درجة مئوية لترطيب الغرفة البلاستيكية والأنسجة مساريق.
- تخدير الفأر مع حقن داخل الصفاق من الكيتامين (100 ملغ / كلغ) وزيلازين (5 ملغ / كلغ) الحق قبل إجراء الفحص المجهري. التخدير بديلة يمكن استخدامها، على سبيل المثال، 2٪ استنشاق الأيزوفلورين. تأكيد التخدير المناسبة عن فقدان استجابة لتحفيز رد الفعل (أخمص القدمين أو قرصة الذيل مع الضغط الثابت).
- يزيل الشعر البطن باستخدام آلة الحلاقة وإزالة الشعر فضفاضة مع الشاش مشبعة الايثانول 70٪.
- تطبيق مرهم التعليم والتدريب المهني على العينين من الماوس لمنع جفاف، في حين تحت التخدير.
2. جراحة
- تعقيم البطن باستخدام الايثانول 70٪. هذه الطريقة ليست طريقة عقيمة، ويمكن أن تكون قاتلة في نهاية التجربة.
- إجراء عملية فتح البطن وسيطة: فتح جلد البطن استخدام، ملقط منحنية الصغيرة ومقص صغير. التعرف على برنامج التحصين الموسعسفن gastrical وفتح الغشاء البريتوني في منطقة ألبا، لحماية السفن.
- تطبيق بضع قطرات من المياه المالحة prewarmed في تجويف البطن للحفاظ على الأنسجة رطبة.
- كريات الدم البيضاء والصفائح الدموية التسمية التي fluorescently حقن 50 ميكرولتر رودامين 6G (1 ملغ / مل) الرجعية orbitally كما هو موضح قبل 9،10.
- من الداخل للظاهر حلقة من مكان ileumand ذلك في petridish التي يبلغ قطرها 10 سم والتأكد من الحفاظ على الأنسجة رطبة عن طريق تطبيق 37 ° C prewarmed محلول ملحي (0.9٪) في كل دقيقة أخرى.
3. حيوي داخلي المجهر
- ضع الماوس تحت المجهر وتحقيق الوريد مساريق التي يبلغ قطرها 200-300 ميكرون في وسط الرأي. اختيار سفينة بلا محيط الدهون المرئية.
- لا تلمس السفن مساريق بالتالي تجنب تحفيز البطانة. التعامل مع حلقة الدقاق بحذر.
- تصور الدم خلايا البطانية التفاعلاتمع مجهر مقلوب أو تستقيم وكاميرا باستخدام برنامج المجهر. سجل الدم التفاعلات خلية البطانية لمدة 1 دقيقة في 4 عروق مختلفة في الماوس.
- الموت ببطء الماوس عن طريق خلع عنق الرحم بعد الانتهاء من تجارب التصوير.
تحليل 4.
- إجراء تحليل للاتصال وأعمى لجميع المعلمات. إجراء تحليل باستخدام أي برنامج مناسب.
- تأكيد ظروف مستقرة وقابلة للمقارنة interindividually تدفق الدم في ارتفاع الوقت قرار سينمائية مقاطع (معدل الإطار الأقصى) على داخل اللمعة تدفق خلايا الدم.
- تحديد عدد الكريات البيض المتداول. لذلك رسم خط عمودي عن طريق الوريد وعد كل الكريات البيض عبور هذا الخط في 1 دقيقة.
- تحديد سرعة المتداول عن طريق قياس الوقت تحتاج الكريات البيض واحدة واحدة لتمرير مسافة 50 ميكرون بينما المتداول ثابت على البطانة. للقيام بذلك، ووضع اثنين من خطوط عمودية في مسافة 50 ميكرون رhrough الوريد.
- قياس الوقت يحتاج إلى الكريات البيض تمثيلية للحصول من سطر واحد إلى other.Calculate سرعة الكريات البيض بقسمة 50 ميكرون من خلال الوقت اللازم (ميكرون / ثانية).
- قياس التصاق الكريات البيض في مجال 0،04 مم 2. للقيام بذلك، رسم مربع مع طول ضلع 200 ميكرون في الوريد.
- عد الكريات البيض ملتصقة حازمة، الذي يعرف بأنه أي تحرك ملموس لمدة 30 ثانية، في هذه الساحة.
- حساب عدد الصفائح الدموية بد أن الكريات البيض واحدة لتحديد التفاعلات الصفيحات الكريات البيض.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
وأظهرت لمحة عامة عن وضع تجريبي الموصوفة في هذا البروتوكول في الشكل 1. ويظهر الماوس مع exteriorized الدقاق حلقة وسفنها، والتي يمكن ملاحظتها في intravital المجهري الشكل 2 يوضح درجة معينة من التنشيط في الحيوانات غير المعالجة نظرا ل الإجراء نفسه. ولكن هناك تقريبا أي المتداول بطيئة أو الالتصاق القوي من الكريات البيض بالمقارنة مع الفئران LPS المعاملة الشكل 2 يدل أيضا على نتائج مختلفة من intravital المجهري في الفئران wildtype إما تعامل مع فلوكستين لمدة 3 أسابيع في مياه الشرب أو الفئران غير المعالجة. الشكل 2A- C تظهر النتائج دون أي تحد التهابات آخر مع LPS، بينما تم علاج الفئران في الشكل 2F-H مع LPS بالإضافة إلى ذلك. هنا يمكننا أن نرى أعدادا أكبر من المتداول والكريات البيض ملتصقة، في حين انخفضت سرعة المتداول بعد التحدي LPS. مع هذه التجارب فإننا يمكن أن تظهر أن الصفائح الدموية السيروتونين هو crucial للخطوات الأولية لتجنيد الكريات البيض في التهاب 7.
في الشكل 3، تم إجراء intravital المجهري دون مزيد من LPS التحدي وفقط بعد العلاج حادة مع فلوكستين البريتونى 2 ساعة قبل الجراحة. هنا يمكننا أن نرى أعدادا أكبر من الكريات البيض ملتصقة بقوة وانخفاض السرعات المتداول في فلوكستين معاملة الفئران، مما يشير إلى تأثير العلاج فلوكستين الحادة على الكريات البيض البطانية التفاعلات 8.
في الشكل هي تصور التفاعلات 4 الصفيحات الكريات البيض خلال lipopolysaccharide في يسببها التهاب الصفاق داخل الوريد. الصفائح الدموية rosetting حول الكريات البيض وهذه المجمعات تتفاعل مع جدار الوعاء الدموي.
الشكل 1. نظرة عامة على إعدادات التجريبية. (أ) الماوس مخدرة مع exteriorized الدقاق حلقة والأوعية مساريق لها (السهم الأسود). (B) مجهر حيوي داخلي مع الماوس وضعت (السهم الأحمر) تحت الهدف (السهم الأسود). مصدر الضوء (رأس السهم الأسود) وكاميرا (رأس السهم الأحمر) يتم وضع علامة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2. حيوي داخلي المجهري بعد الإدارة 3 أسابيع من فلوكسيتين إلى الفئران Wildtype سواء مع أو بدون LPS التحدي. معدلة من 7 (A) عدد الكريات البيض المتداول دون LPS التحفيز. (B) خلايا الدم البيضاء السرعة دون التحفيز LPS. (C) عدد الكريات البيض ملتصقة بقوة دون التحفيز LPS.(D) مثال على سفينة لWT الماوس غير المعالجة دون التحدي LPS. (E) مثال على السفينة على فأرة الحاسوب المعالجة فلوكستين دون التحدي LPS. (F) عدد الكريات البيض المتداول بعد LPS التحفيز. (G) خلايا الدم البيضاء السرعة بعد التحفيز LPS. (H) عدد الكريات البيض ملتصقة بقوة بعد التحفيز LPS. (I) مثال على السفينة من الفأرة WT غير المعالجة بعد التحدي LPS. (J) مثال على السفينة على فأرة الحاسوب المعالجة فلوكستين بعد التحدي LPS. على نطاق وبار = 100 ميكرون. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 3: حيوي داخلي المجهري بعد الحادة فلوكسيتين التحدي 2 ساعة قبل الجراحة معمن LPS التحدي. معدلة من 8 A) عدد الكريات البيض المتداول دون LPS التحفيز. B) خلايا الدم البيضاء السرعة دون التحفيز LPS. C) عدد الكريات البيض ملتصقة بقوة دون التحفيز LPS. D) مثال على سفينة لWT الماوس غير المعالجة دون التحدي LPS. E) مثال على السفينة من الماوس المعالجة فلوكستين الحاد دون التحدي LPS. على نطاق وبار = 100 ميكرون. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 4: التفاعلات الصفائح الدموية الكريات البيض في الجسم الحي الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
صور تمثيلية الصفيحات الكريات البيض بينالإجراءات في الفئران في الجسم الحي خلال lipopolysaccharide في يسببها التهاب الصفاق في الأوردة. طبع من 11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
هنا نحن تصف إعداد وأداء intravital المجهري الأوردة مساريق الفئران في الجسم الحي. هذا الأسلوب يتيح لنا الفرصة لمراقبة الكريات البيض البطانية والصفائح الدموية البطانية التفاعلات 11 مباشرة في الكائن الحي.
كاستجابة مبكرة لالتهاب البطانة يحصل على تنشيط ويتفاعل مع كريات الدم البيضاء والصفائح الدموية مما أدى إلى المتداول، التصاق والتهجير 12. لكن الكريات البيض تتفاعل أيضا مع الصفائح الدموية تشكيل ما يسمى والمجمعات الصفيحات الكريات البيض، في الغالب مجمعات الصفائح الدموية العدلة (PNCs) والمجمعات الصفائح الدموية-الوحيدات (بعد غد) 13،14. هذه التفاعلات يمكن ملاحظة وكميا في هذا الأسلوب.
بالإضافة إلى هذا الأسلوب يسمح بالتحقيق تفعيل البطانة مع علامات مثل VCAM-1 أو ICAM-1 (على سبيل المثال، بعد التفاعلات الصفائح الدموية / الكريات البيض) 15.
الحافز المادي للالإجراء في حد ذاته يؤدي إلى درجة معينة من تفعيل البطانية، الأمر الذي يؤدي إلى المتداول المرئي من الكريات البيض (ولكن تقريبا لا المتداول بطيئة ولا التصاق متين). وهذا يعني أن الفاحص يحتاج إلى معالجة مساريق مع عناية كبيرة. إذا كان هناك الكثير من تفعيل الناجمة عن النفط الخام التعامل مع الامر سوف يؤدي إلى أرقام مرتفعة من المتداول والكريات البيض ملتصقة. للوصول إلى عدد استنساخه من 30-80 الكريات البيض المتداول في الدقيقة الواحدة في البرية من نوع الفئران الفاحص لابد من المدربين.
انسداد ف selectin / PSGL التفاعل يمكن أن يكون بمثابة عنصر تحكم لتأكيد التفاعل بين الكريات البيض مع البطانة. فإنه يستبعد أن الكريات البيض وسلبي "تعلق" إلى البطانة، وهو السيناريو الذي قد يحدث إذا تم تخفيض تدفق الدم بقوة.
ويتراوح قطرها السفينة مساريق حول 200-300 ميكرون. ومن هنا، وهذه الطريقة ليست مناسبة لتقييم دوران الأوعية الدقيقة في الشعيرات الدموية، ولكن يركزعلى التفاعلات الكريات البيض البطاني في، التهاب الأوردة الصغيرة، المكان الرئيسي لهجرة الكريات البيض. بالمقارنة مع الطرق المجهري داخل الحيوية الأخرى مثل نموذج المشمرة، وهذه الطريقة أسهل للتعلم ويمكن القيام بها في فترة زمنية أقصر.
واحدة من القيود أهم من هذا الأسلوب هو أن الفئران يجب أن تكون من الشباب دون الكثير من الدهون مساريق لديك وجهة نظر جيدة في الأوعية، وذلك أن هذا الأسلوب لا يمكن أن يؤديها بعد دراسات التغذية أو العلاج الطويلة.
مرة واحدة يتم تدريب الفاحص، يمكن فحص حالات الالتهابات المختلفة مع هذا الأسلوب، مثل تطبيق LPS، thioglycollate، TNFα أو الهستامين. لا يمكن أن يتحقق التصوير أكثر تحديدا من خلايا الدم معينة باستخدام استهداف جزيئات fluorescently المسمى. عموما، هذه الطريقة سهلة للتعلم وطريقة سريعة لفحص التفاعلات الكريات البيض البطانية والصفيحات الكريات البيض في الكائن الحي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Rhodamine 6G | Sigma-Aldrich | 989-38-8 | |
| Lipopolysaccharides from Escherichia coli 055:B5 | Sigma-Aldrich | L2637 |
References
- Lehr, H. A., Vollmar, B., Vajkoczy, P., Menger, M. D. Intravital fluorescence microscopy for the study of leukocyte interaction with platelets and endothelial cells. Methods in enzymology. 300, 462-481 (1999).
- Atherton, A., Born, G. V. Quantitative investigations of the adhesiveness of circulating polymorphonuclear leucocytes to blood vessel walls. The Journal of physiology. 222, 447-474 (1972).
- Duerschmied, D., et al. Serotonin stimulates platelet receptor shedding by tumor necrosis factor-alpha-converting enzyme (ADAM17). Journal of thrombosis and haemostasis : JTH. 7, 1163-1171 (2009).
- Chauhan, A. K., et al. ADAMTS13: a new link between thrombosis and inflammation. The Journal of experimental medicine. 205, 2065-2074 (1084).
- Baez, S. An open cremaster muscle preparation for the study of blood vessels by in vivo microscopy. Microvascular research. 5, 384-394 (1973).
- Leister, I., et al. A peritoneal cavity chamber for intravital microscopy of the liver under conditions of pneumoperitoneum. Surgical endoscopy. 17, 939-942 (2003).
- Duerschmied, D., et al. Platelet serotonin promotes the recruitment of neutrophils to sites of acute inflammation in mice. Blood. 121, 1008-1015 (2013).
- Herr, N., et al. Acute fluoxetine treatment induces slow rolling of leukocytes on endothelium in mice. PloS one. 9, e88316 (2014).
- Yardeni, T., Eckhaus, M., Morris, H. D., Huizing, M., Hoogstraten-Miller, S.
- Steel, C. D., Stephens, A. L., Hahto, S. M., Singletary, S. J., Ciavarra, R. P. Comparison of the lateral tail vein and the retro-orbital venous sinus as routes of intravenous drug delivery in a transgenic mouse model. Lab animal. 37, 26-32 (2008).
- Duerschmied, D., Bode, C., Ahrens, I.
- Wagner, D. D., Frenette, P. S. The vessel wall and its interactions. Blood. 111, 5271-5281 (2008).
- Gawaz, M., Fateh-Moghadam, S., Pilz, G., Gurland, H. J., Werdan, K. Platelet activation and interaction with leucocytes in patients with sepsis or multiple organ failure. European journal of clinical investigation. 25, 843-851 (1995).
- Sarma, J., et al. Increased platelet binding to circulating monocytes in acute coronary syndromes. Circulation. 105, 2166-2171 (2002).
- Sumagin, R., Sarelius, I. H. TNF-alpha activation of arterioles and venules alters distribution and levels of ICAM-1 and affects leukocyte-endothelial cell interactions. American journal of physiology. Heart and circulatory physiology. 291, H2116-H2125 (2006).
