Abstract
Microscopía intravital es un método que se puede utilizar para investigar diferentes procesos en diferentes regiones y vasos en los animales vivos. En este protocolo, se describe la microscopía intravital de venas mesenterio. Esto se puede realizar en un corto período de tiempo con resultados reproducibles que muestran interacciones leucocito-endotelial in vivo. Se describe un entorno inflamatoria después del desafío LPS del endotelio. Sin embargo, en este modelo se puede aplicar diferentes tipos de afecciones inflamatorias, como la bacteriana, química o biológica e investigar la administración de fármacos y sus efectos directos sobre el animal vivo y su impacto en el reclutamiento de leucocitos. Este protocolo se ha aplicado con éxito a un número de diferentes tratamientos de ratones y sus efectos sobre la respuesta inflamatoria en los vasos. En este documento, se describe la visualización de los leucocitos y plaquetas mediante el etiquetado con fluorescencia éstos con rodamina 6G. Además, cualquier formación de imágenes específico puede ser performed usando dirigidos moléculas marcadas con fluorescencia.
Introduction
El propósito de este protocolo es para describir una técnica simplificada de la microscopía intravital de las venas mesenterio en ratones vivos para la observación directa de las interacciones leucocito-endotelial y de leucocitos de plaquetas bajo condiciones inflamatorias.
Microscopía intravital fue desarrollado para estudiar las interacciones leucocito-endotelial in vivo en condiciones inflamatorias 1,2, que no es trivial pero importante para la comprensión de reclutamiento de leucocitos inflamatoria y función. El método se describe en este protocolo fue desarrollado en base a las publicaciones previamente publicados. Similar a la visualización de la incorporación de plaquetas en un trombo crece 3 y en paralelo a lo que se ha publicado a principios 4, una vena mesenterio exteriorizada es examinado por microscopía de luz transmitida. Hay varios otros modelos de la microscopía intra vitales tales como el músculo cremáster de ratas 5 o el hígado del ratón y ratas 6.
Microscopía intravital de vena mesenterio se ha desarrollado y aplicado en los estudios previos por varios grupos. Hemos utilizado esta técnica para observar las diferencias en el reclutamiento de leucocitos entre los ratones de tipo salvaje y hydroxylase1 triptófano (TPH1) - / - ratones, que son deficientes de la serotonina no neuronal y comparado los resultados a ratones cuyos serotonina plaquetaria se farmacológicamente empobrecido por largo plazo aplicación de la recaptación de serotonina un inhibidor de la fluoxetina 7. También hemos examinado las interacciones leucocito-endotelial después del tratamiento con fluoxetina aguda 8.
En este protocolo nos centramos en la microscopía intravital de venas mesenterio, ya que este modelo se puede realizar de forma rápida, y permite mediciones válidas de las interacciones leucocito-endotelio y plaquetas de leucocitos. Esto es mucho más difícil y lleva mucho tiempo en la microscopía intravital de otros órganos, como los huesos, el hígado, la piel o músculo cremáster. El modol se describe aquí es ideal para la evaluación reproducible de la interacción célula-célula inflamatoria después de challengeing con un estímulo inflamatorio, como la inyección intraperitoneal de lipopolisacárido.
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Protocol
Todos los experimentos con animales se realizaron de conformidad con la ley de protección animal Alemán (TierSchG). Los ratones fueron alojados y manipulen de conformidad con las buenas prácticas de los animales según la definición de FELASA (www.felasa.eu/guidelines.php) y el cuerpo nacional de bienestar animal de GV-SOLAS (www.gv-solas.de/index.html). El comité de bienestar de los animales de la Universidad de Friburgo, así como las autoridades locales (Regierungspräsidium Freiburg) aprobaron todos los experimentos con animales.
1. Manejo de Animales, Preparación e inducción de la inflamación
- Utilice 4-6 semanas de edad ratones machos con un rango de peso de 16 a 20 g. Nota: Si los ratones son más viejos o más pesado que presentan exceso de grasa que rodea el vaso, lo que limita la observación microscópica.
- Esterilizar todas las herramientas y mesa microscopio antes de la cirugía.
- Inyectar 20 mg / kg de LPS (lipopolisacárido) por vía intraperitoneal 4 horas antes de la microscopía en el ratón vivo para inducir una inflamm bacterianaación.
- Precalentar una solución salina al 0,9% en un baño de agua a 37 ° C para humidificar la cámara de plástico y el tejido mesenterio.
- Anestesiar al ratón con inyección intraperitoneal de ketamina (100 mg / kg) y xilazina (5 mg / kg) justo antes de que el procedimiento de microscopía. Anestesia alternativos se pueden utilizar, por ejemplo, 2% de inhalación de isoflurano. Confirmar anestesia adecuada por la pérdida de la respuesta a la estimulación refleja (dedo del pie o de la cola pellizco con una presión firme).
- Depilar el abdomen usando una máquina de afeitar y quitar el pelo suelto con una gasa saturada con etanol al 70%.
- Aplique un ungüento veterinario en los ojos del ratón para evitar la sequedad, mientras que bajo anestesia.
2. Cirugía
- Esterilizar el abdomen utilizando etanol al 70%. Este método no es un método estéril y podría ser letal al final del experimento.
- Realice una laparotomía media: Abra la piel del abdomen usando pequeñas, pinzas curvas y pequeñas tijeras. Identificar el epivasos gastrical y abrir el peritoneo en la región de la línea alba, para proteger a los vasos.
- Aplicar unas pocas gotas de solución salina precalentada en la cavidad abdominal para mantener el tejido húmedo.
- Leucocitos y plaquetas de la etiqueta fluorescente mediante la inyección de 50 l rodamina 6G (1 mg / ml) retro-orbital tal como se describe antes 9,10.
- Exteriorizar un bucle de lugar ileumand en una placa de Petri con un diámetro de 10 cm y asegúrese de mantener el tejido húmedo aplicando la 37 ° C precalentado solución salina (0,9%) cada dos minutos.
3. Microscopia intravital
- Coloque el ratón debajo del microscopio y traer la vena mesenterio con un diámetro de 200 a 300 micras en el centro de la vista. Elija un recipiente sin entorno de grasa visible.
- No toque los recipientes mesenterio evitando así la estimulación del endotelio. Maneje el bucle íleon cautela.
- Visualizar las interacciones célula endotelial de sangrecon un microscopio invertido o en posición vertical y una cámara usando un software de microscopio. Record sangre interacciones célula-endotelial de 1 min en 4 venas diferentes por ratón.
- La eutanasia el ratón por dislocación cervical después de la finalización de los experimentos de imagen.
4. Análisis
- Llevar a cabo el análisis fuera de línea y cegado para todos los parámetros. Llevar a cabo análisis utilizando cualquier programa de software adecuado.
- Confirme condiciones estables y interindividually comparables flujo sanguíneo en alta resolución de tiempo de cine-clips (velocidad de fotogramas máxima) se centraron en el flujo de glóbulos intraluminal.
- Cuantificar el número de leucocitos de rodadura. Para ello trazar una línea vertical a través de la vena y contar todos los leucocitos que cruzan esta línea en 1 min.
- Determinar la velocidad de laminación midiendo el tiempo una sola leucocitos necesita pasar una distancia de 50 m, mientras que de forma estable a rodar sobre el endotelio. Para ello, dibuja dos líneas verticales en una distancia de 50 m tediante la vena.
- Mida el tiempo de un leucocito representante deberá obtener de una línea a la other.Calculate la velocidad de los leucocitos al dividir 50 micras a través del tiempo necesario (m / s).
- Medir la adhesión de leucocitos en un campo de 0,04 mm 2. Para ello, dibuja un cuadrado con la longitud lateral de 200 micras en la vena.
- Cuente los leucocitos adherentes firmes, definidos como ningún movimiento visible durante 30 segundos, dentro de este cuadrado.
- Cuente el número de plaquetas con destino a uno de los leucocitos de cuantificar las interacciones de las plaquetas de leucocitos.
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Representative Results
Una visión general de la configuración experimental descrito en este protocolo se muestra en la Figura 1. Se muestra un ratón con un íleon de bucle exteriorizada y sus vasos, que se puede observar en la microscopía intravital. La Figura 2 muestra cierto grado de activación en los animales no tratados debido a el procedimiento en sí. Pero no hay casi ninguna de rodadura lenta o la adhesión firme de los leucocitos en comparación con los ratones tratados con LPS. Figura 2 también muestra los diferentes resultados de la microscopía intravital en ratones de tipo salvaje ya sea tratados con fluoxetina durante 3 semanas en el agua potable o los ratones no tratados. Figura 2A- C muestran los resultados sin cualquier desafío inflamatoria adicionalmente con LPS, mientras que los ratones de la Figura 2F-H fueron tratados con LPS en adición. Aquí podemos ver un mayor número de rodadura y los leucocitos adherentes, mientras que la velocidad de laminación disminuyó después de LPS desafío. Con estos experimentos pudimos demostrar que la serotonina plaquetaria es crucial para las etapas iniciales de reclutamiento de leucocitos en la inflamación 7.
En la Figura 3, la microscopía intravital se realizó sin desafío más LPS y justo después de tratamiento agudo con fluoxetina por vía intraperitoneal 2 horas antes de la cirugía. Aquí podemos ver un mayor número de leucocitos firmemente adheridas y velocidades de laminación más bajos en los ratones tratados con fluoxetina, lo que indica una influencia del tratamiento con fluoxetina aguda en leucocitos endotelial interacciones 8.
En la Figura 4 interacciones plaquetas leucocitos durante lipopolisacárido inducida peritonitis se visualizan dentro de una vena. Las plaquetas se formación de rosetas alrededor de los leucocitos y estos complejos están interactuando con la pared del vaso.
Figura 1. Vista general de los parámetros experimentales. (A) Un ratón anestesiado con exteriorizada íleo-loop y sus vasos mesenterio (flecha negro). (B) microscopio intravital con el ratón colocado (flecha roja) por debajo del objetivo (flecha negro). Fuente de luz (punta de flecha negro) y la cámara (punta de flecha roja) se marcan. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. Microscopia intravital Después de 3 semanas de administración de fluoxetina con ratones wildtype con o sin LPS desafío. Modificado de 7 (A) Número de leucocitos rodantes sin LPS-estimulación. (B) la velocidad de leucocitos y sin estimulación con LPS. (C) Número de leucocitos firmemente adheridas sin estimulación con LPS.(D) Ejemplo de un buque de un ratón WT sin tratar y sin LPS desafío. (E) Ejemplo de un buque de un ratón tratado con fluoxetina sin LPS desafío. (F) Número de leucocitos de rodadura después de LPS-estimulación. (G) la velocidad de leucocitos después de la estimulación con LPS. (H) Número de leucocitos firmemente adherentes después de la estimulación con LPS. (I) Ejemplo de un buque de un ratón WT sin tratar después de LPS desafío. (J) Ejemplo de un buque de un ratón tratado con fluoxetina después de LPS desafío. Barra de escala = 100 micras. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Microscopia intravital Después Fluoxetina Desafío aguda 2 horas antes de la cirugía concabo LPS desafío. Modificado de 8 A) Número de leucocitos rodantes sin LPS-estimulación. B) la velocidad de leucocitos y sin estimulación con LPS. C) Número de leucocitos firmemente adheridas sin estimulación con LPS. D) Ejemplo de un buque de un ratón WT sin tratar y sin LPS desafío. E) Ejemplo de un buque de un ratón tratado con fluoxetina aguda sin LPS desafío. Barra de escala = 100 micras. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4:. Interacciones plaquetas leucocitos in vivo Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Imagen representativa de entre plaquetas leucocitosacciones en ratones in vivo durante lipopolisacárido inducida por peritonitis en las venas. Reimpresión del 11.
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Discussion
Aquí se describe la preparación y el rendimiento de la microscopía intravital de las venas mesenterio de ratones in vivo. Este método nos da la oportunidad de observar las interacciones leucocito-endotelial y plaquetarios endotelial 11 directamente en el organismo vivo.
Como una respuesta temprana a la inflamación del endotelio se activa e interactúa con los leucocitos y las plaquetas que resulta en la rodadura, la adherencia y la transmigración 12. Pero leucocitos también interactúan con las plaquetas formando los llamados, complejos plaquetas leucocitos, predominantemente complejos plaquetas neutrófilos (PNC) y complejos de plaquetas monocitos (EMP) 13,14 .Estos interacciones pueden ser observados y cuantificados en este método.
Además, esta técnica permite la investigación de la activación del endotelio con marcadores como VCAM-1 o ICAM-1 (por ejemplo, después de las interacciones de plaquetas / leucocitos) 15.
El estímulo físico del propio procedimiento causa un cierto grado de activación endotelial, lo que conduce a la rodadura visible de los leucocitos (pero casi ninguna de laminación lento y no adhesión firme). Esto implica que el examinador necesita para manejar el mesenterio con gran cuidado. Si hay demasiada activación causado por el manejo de crudo que se traducirá en números elevados de rodadura y los leucocitos adherentes. Para llegar a un número reproducible de 30-80 leucocitos rodantes por minuto en los ratones de tipo salvaje, el examinador tiene que ser entrenado.
La obstrucción de P-selectina / PSGL-interacción podría servir como un control para confirmar la interacción de leucocitos con el endotelio. Se descarta que los leucocitos son pasivamente "unidos" al endotelio, un escenario que puede ocurrir si el flujo sanguíneo se reduce considerablemente.
Diámetro del vaso Mesenterio oscila aproximadamente 200 a 300 micras. Por lo tanto, este método no es adecuado para evaluar la microcirculación en los capilares, pero se centraen las interacciones leucocito-endotelial en pequeñas venas inflamadas, el lugar principal de la transmigración de los leucocitos. En comparación con otros métodos de microscopía intra-vitales tales como el modelo cremáster, este método es más fácil de aprender y se puede realizar en un período de tiempo más corto.
Una de las limitaciones más importantes de este método es que los ratones tienen que ser joven sin mucha grasa mesenterio tener una buena vista hacia los vasos, por lo que este método no se puede realizar después de los estudios de alimentación o tratamientos largos.
Una vez que el examinador está entrenado, diferentes condiciones inflamatorias pueden ser examinados con este método, tales como la aplicación de LPS, tioglicolato, TNFa o histamina. Más de imágenes específica de las células de sangre particulares se puede lograr mediante el uso de moléculas dirigidas marcadas fluorescentemente. En general, este método es fácil de aprender y de una manera rápida para examinar las interacciones leucocito-endotelio y plaquetas de leucocitos en un organismo vivo.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Rhodamine 6G | Sigma-Aldrich | 989-38-8 | |
| Lipopolysaccharides from Escherichia coli 055:B5 | Sigma-Aldrich | L2637 |
References
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