Abstract
Прижизненные микроскопия является методом, который может быть использован для исследования различных процессов в различных регионах и сосуды в живых животных. В этом протоколе мы опишем прижизненный микроскопии брыжейки вен. Это может быть выполнено в течение короткого периода времени с воспроизводимыми результатами, показывающими, лейкоцитов-эндотелиальной взаимодействия в естественных условиях. Мы описываем воспалительный настройки после ЛПС эндотелия. Но в этой модели можно применить различные типы воспалительных состояний, как бактериальных, химических или биологических и исследовать введение препаратов и их прямое воздействие на живом и его влияние на лейкоцитов. Этот протокол был успешно применен к ряду различных обработок мышей и их воздействие на воспалительную реакцию в сосудах. Здесь, мы опишем визуализацию лейкоцитов и тромбоцитов флуоресцентно маркировка их с родамина 6G. Кроме того, любая конкретная изображений может быть реrformed помощью целенаправленных флуоресцентно меченных молекул.
Introduction
Целью данного протокола является описание упрощенную методику прижизненной микроскопии брыжейки вен в живых мышей для прямого наблюдения лейкоцитов-эндотелиальной и лейкоцитов тромбоцитов взаимодействий при воспалительных процессах.
Прижизненные микроскопии был разработан для изучения лейкоцитов-эндотелиальной взаимодействия в естественных условиях под воспалительных состояний 1,2, что не тривиальна, но важно для понимания воспалительной лейкоцитов и функции. Метод, который мы описали в этом протоколе был разработан на основе ранее опубликованных изданий. Подобно визуализации тромбоцитов включение в растущем тромба 3 и параллельно с тем, что было опубликовано ранее 4, выводили брыжейки вена рассмотрены передаваемой световой микроскопии. Есть различные другие модели внутри витал микроскопии, такие как кремастер мышцы крыс 5 или печени мыши и крысы 6.
Прижизненные микроскопия брыжейки вены была разработана и применяется в предыдущих исследованиях несколько групп. Мы использовали эту технику, чтобы наблюдать различия в лейкоцитов между мышами дикого типа и триптофана hydroxylase1 (Tph1) - / - мышей, которые дефицитный ненейронных серотонина и сравнили результаты мышам, чьи тромбоцитов серотонина фармакологически истощены долгосрочной перспективе ингибитор приложение избирательного обратного захвата серотонина флуоксетин 7. Мы также исследовали лейкоцитов-эндотелиальной взаимодействия после острого лечение флуоксетином 8.
В этом протоколе мы ориентируемся на прижизненной микроскопии брыжейки вен, потому что эта модель может быть выполнена быстро, и позволяет действительные измерения лейкоцитов-эндотелиальной и тромбоцитов лейкоцитов взаимодействий. Это гораздо более сложным и трудоемким в прижизненной микроскопии других органов, таких как кости, печени, кожи или мышц кремастер. Режимл описано здесь идеально подходит для воспроизводимого оценки воспалительного взаимодействия клетка-клетка после challengeing его с воспалительным стимулом, таким как внутрибрюшинной инъекции ЛПС.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все эксперименты на животных были проведены в соответствии с немецким законом о защите животных (TierSchG). Мыши были размещены и обрабатываются в соответствии с надлежащей практикой животных, как это определено FELASA (www.felasa.eu/guidelines.php) и тела национального благосостояния животных GV-СОЛАС (www.gv-solas.de/index.html). Благосостояния комитет животных из Университета Фрайбурга, а также местные органы власти (Regierungspräsidium Фрайбург) одобрил все эксперименты на животных.
1. Животное Обработка, подготовка и индукция воспаления
- Использование 4 - 6 недельных самцов мышей с массой от 16 - 20 г. Примечание: Если мыши старшего возраста или тяжелее они представляют лишний жир, окружающий сосуд, ограничивая микроскопическую наблюдение.
- Стерилизовать все инструменты и микроскоп таблицу до операции.
- Вводят 20 мг / кг ЛПС (липополисахарида) внутрибрюшинно 4 ч до микроскопии в живой мыши, чтобы вызвать бактериальную Inflammвания.
- Prewarm 0,9% солевой раствор в водяной бане при 37 ° С для увлажнения пластиковую камеру и брыжейки ткани.
- Обезболить мышь с внутрибрюшинной инъекции кетамина (100 мг / кг) и ксилазина (5 мг / кг) непосредственно перед процедурой микроскопии. Альтернативные анестезия может быть использован, например, 2% изофлуран ингаляции. Подтвердите правильное обезболивания по потере ответ на рефлекторной стимуляции (палец или хвост щепотку с твердым давления).
- Депилировать живот с помощью бритвы и удалить распущенные волосы марлей, насыщенной 70% этанола.
- Применить ветеринар мазь на глазах мыши, чтобы предотвратить сухость, а под наркозом.
2. Хирургическое
- Стерилизовать живота с помощью 70% этанола. Этот метод не является стерильным способом и может привести к летальному исходу в конце эксперимента.
- Выполните средний лапаротомии: Откройте кожи живота с помощью небольших, изогнутые щипцы и маленькие ножницы. Определить EPIgastrical сосуды и откройте брюшины в области белой линии, чтобы защитить сосуды.
- Нанесите несколько капель физиологического раствора, предварительно нагретой в брюшную полость, чтобы сохранить ткани влажным.
- Этикетка лейкоцитов и тромбоцитов флуоресцентно путем введения 50 мкл родамина 6G (1 мг / мл) ретро-орбитально, как описано выше 9,10.
- Экстериоризироваться петлю ileumand поместить его в чашку Петри с диаметром 10 см и убедитесь, что держать ткань влажной путем применения 37 ° C, предварительно нагретую физиологический раствор (0,9%) каждую минуту.
3. Прижизненные микроскопия
- Место мыши под микроскопом и привести брыжейки вену с диаметром 200 - 300 мкм в центре зрения. Выберите судно без каких-либо видимых жировых обстановке.
- Не прикасайтесь брыжейки сосуды, тем самым избегая стимуляции эндотелия. Ручка подвздошной петли осторожно.
- Представьте клеток эндотелия-взаимодействий в кровис перевернутым или прямого микроскопа и камеры с использованием программного обеспечения микроскопа. Запись в крови клеток эндотелия-взаимодействия в течение 1 мин в 4 различных вен на мышь.
- Эвтаназии мышь смещением шейных позвонков после завершения экспериментов изображений.
4. Анализ
- Провести анализ в автономном режиме и ослеплен по всем параметрам. Провести анализ с использованием любого подходящего программного обеспечения.
- Подтвердите стабильные и interindividually сопоставимые условия кровотока в пора разрешением кино-клипов (максимальная частота кадров), направленные на просвете потока клеток крови.
- Определить число лейкоцитов прокатки. Therefor проведите вертикальную линию через вену и рассчитывать все лейкоциты, пересекающие эту линию в 1 мин.
- Определить скорость прокатки путем измерения времени одна лейкоцитов необходимо пройти расстояние 50 мкм, а стабильно прокатки на эндотелий. Для этого нарисуйте две вертикальные линии на расстоянии 50 мкм тhrough вены.
- Измерьте время представитель лейкоцитов должен получить от одной линии к other.Calculate скорость лейкоцитов путем деления 50 мкм в течение времени, необходимого (мкм / с).
- Измерьте адгезию лейкоцитов в поле 0,04 мм 2. Чтобы сделать это, нарисуйте квадрат с длиной стороны 200 мкм в вену.
- Граф твердым приверженцем лейкоцитов, определенные как не видимым движением в течение 30 сек, в течение этой площади.
- Подсчитайте количество тромбоцитов, связанных с одной лейкоцитов количественно тромбоцитов лейкоцитов взаимодействий.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Обзор экспериментальных условий, описанной в данном протоколе показано на рисунке 1. Это показывает, мышь с экстериоризированного подвздошной петли и его сосудов, которое можно наблюдать в прижизненной микроскопии. Рисунок 2 показывает определенную степень активации в необработанных животных вследствие Сама процедура. Но почти нет медленно прокатки или фирма адгезию лейкоцитов по сравнению с ЛПС-обработанных мышей. На фиг.2 также показаны различные результаты прижизненной микроскопии мышей дикого типа либо обрабатывали флуоксетином в течение 3 недель в питьевой воде или необработанных мышей. Рисунок 2А С показывают результаты без каких-либо дальнейших воспалительных вызов с ЛПС, в то время как мыши в рисунке 2F-H лечили ЛПС в дополнение. Здесь мы можем увидеть более высокие цифры прокатки и прилипшие лейкоцитов, в то время как скорость качения уменьшается после введения ЛПС. С помощью этих экспериментов мы могли показать, что тромбоцитов серотонина сrucial для начальных этапов лейкоцитов в воспаление 7.
На рисунке 3, прижизненной микроскопии проводили без дальнейших ЛПС и сразу после острого лечения флуоксетином внутрибрюшинно 2 ч до операции. Здесь мы можем увидеть более высокие номера твердо прилипших лейкоцитов и более низких скоростях прокатки в флуоксетин мышей,, указывая на влияние острой флуоксетин лечения на лейкоцитов-эндотелиальной взаимодействия 8.
На рисунке 4 тромбоцитов лейкоцитов взаимодействия во время липополисахарида индуцированной перитонита визуализируются в вену. Тромбоциты rosetting вокруг лейкоцитов и эти комплексы взаимодействуют со стенкой сосуда.
Рисунок 1. Обзор Настройки экспериментальной. (B), прижизненные микроскоп с помещены мыши (красная стрелка) под объективной (черная стрелка). Источник света (черный наконечник) и камеры (красный наконечник) отмечены. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2. Прижизненные микроскопия После 3-недельного администрации флуоксетина мышей дикого типа или без ЛПС. Редактировался 7 (а) количество лейкоцитов прокатки без LPS-стимуляции. (B), лейкоцитов скорость без стимуляции ЛПС. (С) Количество прочно прилипающих лейкоцитов без стимуляции ЛПС.(D) Пример судна необработанной WT мыши без ЛПС. (Е) Пример сосуде флуоксетин обработанных мышей без ЛПС. (F) Количество лейкоцитов прокатки после LPS-стимуляции. (G), лейкоцитов скорость после стимуляции ЛПС. (Н) Количество прочно прилипающих лейкоцитов после стимуляции ЛПС. (Я) Пример судна необработанной WT мыши после введения ЛПС. (J) Пример сосуде флуоксетин обработанных мышей после инъекции ЛПС. Масштаб бар = 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: Прижизненные микроскопия После Острая Флуоксетин Challenge 2 ч до операции сиз ЛПС. Измененный 8 А) Количество лейкоцитов прокатки без LPS-стимуляции. Б) лейкоцитов скорость без стимуляции ЛПС. С) Количество лейкоцитов твердо прилипшие без стимуляции ЛПС. D) Пример судна необработанной WT мыши без ЛПС. Е) Пример судна острого флуоксетин обработке мыши без ЛПС. Масштаб бар = 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4:. Тромбоцитами лейкоцитов взаимодействия в естественных условиях Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Представитель картина тромбоцитов лейкоцитов Интердействия в мышей в естественных условиях в течение липополисахарида индуцированной перитонита в жилах. Перепечатка из 11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В этом мы расскажем подготовку и исполнение прижизненной микроскопии брыжейки вен мышей в естественных условиях. Этот метод дает нам возможность наблюдать лейкоцитов-эндотелиальной и тромбоцитов эндотелиальных взаимодействий 11 непосредственно в живом организме.
В качестве первого ответа на воспаление эндотелия активируется и взаимодействует с лейкоцитами и тромбоцитами, в результате прокатки, адгезии и переселения 12. Но лейкоциты и тромбоциты взаимодействуют с образуя так называемый, тромбоцитов, лейкоцитов, преимущественно комплексы тромбоцитов нейтрофилов комплексы (PNCs) и тромбоцитов моноцитов комплексы (ЧВК) 13,14 которые пребывают взаимодействия можно наблюдать и количественно в этом методе.
Кроме того, этот метод позволяет исследовать активацию эндотелия с маркерами, как VCAM-1 или ICAM-1 (например, после тромбоцитов / лейкоцитов взаимодействий) 15.
Физический стимул самой процедуры вызывает определенную степень активации эндотелия, что приводит к видимому прокатки лейкоцитов (но почти не медленно прокатки и не фирма адгезии). Это означает, что эксперт должен обрабатывать брыжейки с большой осторожностью. Если есть слишком много активации вызвано нефти обработки это приведет к повышению числа прокатки и прилипшие лейкоцитов. Для достижения воспроизводимых число 30 - 80 прокатных лейкоцитов в минуту у мышей дикого типа экзаменатора должен быть обучен.
Закупорка Р-селектина / PSGL-взаимодействия может служить в качестве контроля для подтверждения взаимодействие лейкоцитов с эндотелием. Это исключает, что лейкоциты пассивно "прилагается" к эндотелию, сценарий, который может произойти, если поток крови сильно снижается.
Диаметр Брыжейка судно колеблется около 200 - 300 мкм. Следовательно, этот способ не подходит для оценки микроциркуляции в капиллярах, но основное вниманиена лейкоцитов-эндотелиальной взаимодействия в малых, воспаленных венах, по основному месту для переселения лейкоцитов. По сравнению с другими внутри жизненно важных методов микроскопии, таких как модели кремастер, этот метод легче узнать и может быть выполнена в течение более короткого периода времени.
Одним из наиболее важных ограничений этого метода является то, что мыши, должны быть молодыми без особого брыжейки жира, чтобы иметь хороший вид в сосуды, так что этот способ не может быть выполнена после длительного кормления или лечения исследований.
После того, как эксперт обучен, различные воспалительные состояния могут быть изучены с помощью этого метода, например, применение LPS, тиогликолевой, TNF, или гистамина. Более конкретные визуализации конкретных клеток крови может быть достигнуто с помощью целевых флуоресцентно меченных молекул. В целом, этот метод легко учиться и быстрый способ изучить лейкоцитов-эндотелиальной и тромбоцитов лейкоцитов взаимодействий в живой организм.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Rhodamine 6G | Sigma-Aldrich | 989-38-8 | |
| Lipopolysaccharides from Escherichia coli 055:B5 | Sigma-Aldrich | L2637 |
References
- Lehr, H. A., Vollmar, B., Vajkoczy, P., Menger, M. D. Intravital fluorescence microscopy for the study of leukocyte interaction with platelets and endothelial cells. Methods in enzymology. 300, 462-481 (1999).
- Atherton, A., Born, G. V. Quantitative investigations of the adhesiveness of circulating polymorphonuclear leucocytes to blood vessel walls. The Journal of physiology. 222, 447-474 (1972).
- Duerschmied, D., et al. Serotonin stimulates platelet receptor shedding by tumor necrosis factor-alpha-converting enzyme (ADAM17). Journal of thrombosis and haemostasis : JTH. 7, 1163-1171 (2009).
- Chauhan, A. K., et al. ADAMTS13: a new link between thrombosis and inflammation. The Journal of experimental medicine. 205, 2065-2074 (1084).
- Baez, S. An open cremaster muscle preparation for the study of blood vessels by in vivo microscopy. Microvascular research. 5, 384-394 (1973).
- Leister, I., et al. A peritoneal cavity chamber for intravital microscopy of the liver under conditions of pneumoperitoneum. Surgical endoscopy. 17, 939-942 (2003).
- Duerschmied, D., et al. Platelet serotonin promotes the recruitment of neutrophils to sites of acute inflammation in mice. Blood. 121, 1008-1015 (2013).
- Herr, N., et al. Acute fluoxetine treatment induces slow rolling of leukocytes on endothelium in mice. PloS one. 9, e88316 (2014).
- Yardeni, T., Eckhaus, M., Morris, H. D., Huizing, M., Hoogstraten-Miller, S.
- Steel, C. D., Stephens, A. L., Hahto, S. M., Singletary, S. J., Ciavarra, R. P. Comparison of the lateral tail vein and the retro-orbital venous sinus as routes of intravenous drug delivery in a transgenic mouse model. Lab animal. 37, 26-32 (2008).
- Duerschmied, D., Bode, C., Ahrens, I.
- Wagner, D. D., Frenette, P. S. The vessel wall and its interactions. Blood. 111, 5271-5281 (2008).
- Gawaz, M., Fateh-Moghadam, S., Pilz, G., Gurland, H. J., Werdan, K. Platelet activation and interaction with leucocytes in patients with sepsis or multiple organ failure. European journal of clinical investigation. 25, 843-851 (1995).
- Sarma, J., et al. Increased platelet binding to circulating monocytes in acute coronary syndromes. Circulation. 105, 2166-2171 (2002).
- Sumagin, R., Sarelius, I. H. TNF-alpha activation of arterioles and venules alters distribution and levels of ICAM-1 and affects leukocyte-endothelial cell interactions. American journal of physiology. Heart and circulatory physiology. 291, H2116-H2125 (2006).
