Abstract
Microscopie intravitale est une méthode qui peut être utilisée pour étudier des processus différents dans les différentes régions et des vaisseaux chez les animaux vivants. Dans ce protocole, nous décrivons la microscopie intravitale de veines de mesentery. Ceci peut être réalisé en un court laps de temps avec des résultats reproductibles montrant les interactions des leucocytes-endothélial in vivo. Nous décrivons un cadre inflammatoire après LPS défi de l'endothélium. Mais dans ce modèle on peut appliquer de nombreux types différents de conditions inflammatoires, comme bactérienne, chimique ou biologique et d'enquêter sur l'administration de médicaments et de leurs effets directs sur l'animal vivant et son impact sur le recrutement des leucocytes. Ce protocole a été appliqué avec succès à un certain nombre de traitements différents de souris et de leurs effets sur la réponse inflammatoire dans les vaisseaux. Ici, nous décrivons la visualisation des leucocytes et des plaquettes par marquage par fluorescence de la rhodamine 6G avec ceux-ci. En outre, toute imagerie spécifique peut être performed en utilisant des molécules cibles marquées par fluorescence.
Introduction
Le but de ce protocole est de décrire une technique simplifiée de microscopie intravitale de veines de mesentery chez les souris vivant pour l'observation directe des interactions leucocytes-endothélial et leuco-plaquettaire dans des conditions inflammatoires.
Microscopie intravitale a été développé pour étudier les interactions leucocytes-endothélial in vivo dans des conditions inflammatoires 1,2, ce qui est non pas anodine mais importante pour comprendre le recrutement des leucocytes inflammatoires et la fonction. La méthode que nous décrivons dans ce protocole a été développé sur la base de publications publiées antérieurement. Semblable à la visualisation plaquettes incorporation dans un thrombus croissante 3 et parallèlement à ce qui a été publié plus tôt 4, une veine mésentérique extériorisé est examiné par microscopie lumière transmise. Il existe divers autres modèles de la microscopie intra-vital tels que le muscle crémaster de rats 5 ou le foie des souris et des rats 6.
Microscopie intravitale du mésentère veine a été développée et appliquée dans les études précédentes par plusieurs groupes. Nous avons utilisé cette technique pour observer des différences dans le recrutement des leucocytes entre les souris de type sauvage et le tryptophane hydroxylase1 (TPH1) - / - souris, qui sont déficientes de la sérotonine non-neuronales et comparé les résultats à des souris dont la sérotonine plaquettaire a été pharmacologiquement appauvri par à long terme inhibiteur de la demande d'un recaptage de la sérotonine fluoxétine 7. Nous avons également examiné les interactions leucocytes-endothélial après le traitement par la fluoxétine aiguë 8.
Dans ce protocole, nous nous concentrons sur la microscopie intravitale de veines de mesentery, parce que ce modèle peut être réalisé rapidement, et permet des mesures valides de interactions leucocytes-endothélial et des plaquettes-leucocytes. Cela est beaucoup plus difficile et beaucoup de temps dans la microscopie intravitale d'autres organes, tels que les os, le foie, la peau, ou le muscle crémaster. Le model décrite ici est idéale pour l'évaluation reproductible inflammatoire de l'interaction cellule-cellule avec challengeing après un stimulus inflammatoire, comme l'injection intraperitoneale de lipopolysaccharide.
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Protocol
Toutes les expériences sur les animaux ont été effectuées en conformité avec la loi de protection des animaux allemand (TierSchG). Les souris ont été logées et manipulés conformément aux bonnes pratiques de l'animal tel que défini par la FELASA (www.felasa.eu/guidelines.php) et le corps de bien-être animal nationale GV-SOLAS (www.gv-solas.de/index.html). Le comité de protection des animaux de l'Université de Fribourg ainsi que les autorités locales (Regierungspräsidium Freiburg) ont approuvé toutes les expérimentations animales.
1. manipulation des animaux, préparation et induction de l'inflammation
- Utilisez 4-6 semaine Enfant souris mâles avec une gamme de poids de 16 - 20 g. Remarque: Si les souris sont plus âgés ou plus lourd qu'ils présentent graisse excessive entourant la cuve, limitant l'observation microscopique.
- Stériliser tous les outils et table de microscope avant la chirurgie.
- Injecter 20 mg / kg de LPS (lipopolysaccharide) par voie intraperitoneale quatre heures avant la microscopie dans la vie de souris pour induire une Inflamm bactérienneation.
- Préchauffer une solution saline à 0,9% dans un bain-marie à 37 ° C pour humidifier la chambre en matière plastique et le tissu mésentère.
- Anesthésier les souris avec une injection intraperitoneale de kétamine (100 mg / kg) et de xylazine (5 mg / kg) juste avant que la procédure de microscopie. Anesthésie alternatifs peuvent être utilisés, par exemple, 2% inhalation d'isoflurane. Confirmez anesthésie appropriée par la perte de la réponse à la stimulation réflexe (orteil ou pincement de la queue avec une pression ferme).
- Épiler l'abdomen à l'aide d'un rasoir et enlever les poils lâche avec de la gaze saturé avec de l'éthanol 70%.
- Appliquer vétérinaire pommade sur les yeux de la souris pour prévenir la sécheresse, tandis que sous anesthésie.
2. Chirurgie
- Stériliser l'abdomen en utilisant 70% d'éthanol. Cette méthode est une méthode non stérile et peut être mortelle à la fin de l'expérience.
- Effectuez une laparotomie médiane: Ouvrez la peau de l'abdomen à l'aide de petites pinces courbes et de petits ciseaux. Identifier l'épigastrical navires et ouvrir le péritoine dans la région de la ligne blanche, à protéger les vaisseaux.
- Appliquez quelques gouttes de sérum physiologique préchauffé dans la cavité abdominale de garder le tissu humide.
- des leucocytes et des plaquettes d'étiquetage par fluorescence en injectant 50 ul rhodamine 6G (1 mg / ml) rétro-orbitale, comme décrit avant 9,10.
- Extérioriser une boucle de ileumand lieu dans une boîte de Petri d'un diamètre de 10 cm et assurez-vous de garder le tissu humide en appliquant la 37 ° C préchauffé solution saline (0,9%) tous les autres minutes.
3. Microscopie intravitale
- Passer la souris sous le microscope et amener la veine mésentérique d'un diamètre de 200 à 300 um dans le centre de la vue. Choisissez un navire sans environnement gras visible.
- Ne pas toucher les vaisseaux mesentery évitant ainsi la stimulation de l'endothélium. Manipulez la boucle de l'iléon prudence.
- Visualiser les interactions entre cellules endothéliales sanguinsavec un microscope inversé ou verticale et une caméra à l'aide d'un logiciel d'microscope. Fiche sang des interactions des cellules endothéliales pendant 1 min à 4 veines différentes par souris.
- Euthanasier la souris par dislocation cervicale après l'achèvement d'expériences d'imagerie.
4. Analyse
- Effectuer l'analyse hors ligne et aveuglé pour tous les paramètres. Procéder à une analyse en utilisant n'importe quel logiciel approprié.
- Confirmez conditions stables et comparables interindividually flux sanguin en haute résolution temporelle ciné-clips (taux de trame maximale) ont porté sur les flux de globules intraluminal.
- Quantifier le nombre de leucocytes roulement. Avoisinant tracez une ligne verticale à travers la veine et compter tous les leucocytes qui traversent cette ligne en 1 min.
- Déterminer la vitesse de roulement en mesurant le temps d'une seule leucocytes a besoin de passer à une distance de 50 um tout en roulant de manière stable sur l'endothélium. Pour ce faire, tirer deux lignes verticales sur une distance de 50 um trâce la veine.
- Mesurer le temps un leucocyte représentant a besoin d'obtenir d'une ligne à l'other.Calculate la vitesse des leucocytes en divisant 50 um à travers le temps nécessaire (um / s).
- Mesurer l'adhérence des leucocytes dans un domaine de 0,04 mm 2. Pour ce faire, dessiner un carré avec la longueur de côté de 200 um dans la veine.
- Comptez le nombre de leucocytes adhérents fermes, définis comme aucun mouvement visible pendant 30 secondes, dans ce carré.
- Comptez le nombre de plaquettes liés à l'un des leucocytes à quantifier les interactions plaquettes-leucocytes.
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Representative Results
Un aperçu de la création expérimentale décrite dans ce protocole est montré à la figure 1. Il montre une souris avec un iléon boucle extériorisée et ses navires, qui peut être observé en microscopie intravitale. La figure 2 montre certain degré d'activation chez les animaux non traités en raison de la procédure elle-même. Mais il n'y a presque pas de roulement lent ou adhésion ferme des leucocytes par rapport à des souris LPS-traités. La figure 2 montre également les différents résultats de la microscopie intravitale chez les souris de type sauvage soit traité avec fluoxetine pendant 3 semaines dans l'eau potable ou des souris non traitées. Figure 2A C montrer les résultats sans aucune autre défi inflammatoire avec LPS, tandis que les souris de la figure 2F-H ont été traités avec LPS en plus. Ici, nous pouvons voir un nombre plus élevé de roulement et leucocytes adhérents, tandis que la vitesse de roulement a diminué après LPS. Avec ces expériences, nous avons pu montrer que la sérotonine plaquettaire est crucial pour les étapes initiales de recrutement des leucocytes dans l'inflammation 7.
Dans la figure 3, la microscopie intravitale a été réalisée sans autres LPS et juste après le traitement aigu avec la fluoxétine par voie intrapéritonéale 2 heures avant la chirurgie. Ici, nous pouvons voir un plus grand nombre de leucocytes fermement adhérentes et des vitesses de roulement inférieurs chez la souris sous fluoxétine ont, indiquant une influence du traitement par la fluoxétine aiguë sur les interactions leucocytes-endothélial 8.
Dans la figure 4 interactions plaquettes-leucocytes pendant lipopolysaccharide induite péritonite sont visualisées dans une veine. Les plaquettes sont de rosettes autour des leucocytes et ces complexes sont en interaction avec la paroi du vaisseau.
Figure 1. Vue d'ensemble des paramètres expérimentaux. (A) Une souris anesthésié avec extériorisé iléon-boucle et ses navires de mesentery (flèche noire). (B) de microscope intravitale avec la souris placé (flèche rouge) sous l'objectif (flèche noire). Source de lumière (flèche noire) et la caméra (flèche rouge) sont marqués. S'il vous plaît, cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2. Microscopie intravitale Après 3 semaines d'administration de la fluoxétine à des souris de type sauvage avec ou sans LPS Challenge. Modifié à partir de 7 (A) Nombre de leucocytes roulant sans LPS-stimulation. (B) la vitesse des leucocytes sans stimulation par le LPS. (C) Nombre de leucocytes fermement adhérentes sans stimulation par le LPS.(D) Exemple d'un navire d'une souris WT non traité sans LPS. (E) Exemple d'un navire d'une souris d'fluoxetine-traité sans LPS. (F) Nombre de leucocytes roulement après LPS-stimulation. (G) la vitesse de leucocytes après stimulation par le LPS. (H) Nombre de leucocytes fermement adhérentes après stimulation par le LPS. (I) Exemple d'un navire d'une souris WT non traité après LPS. (J) Exemple d'un navire d'une souris d'fluoxetine-traité après LPS. Barre d'échelle = 100 um. S'il vous plaît, cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3: Microscopie intravitale Après aiguë fluoxétine Challenge 2 h avant la chirurgie Avecsur LPS Challenge. Modifié à partir de 8 A) Nombre de leucocytes roulant sans LPS-stimulation. B) la vitesse des leucocytes sans stimulation par le LPS. C) Nombre de leucocytes fermement adhérentes sans stimulation par le LPS. D) Exemple d'un navire d'une souris WT non traité sans LPS. E) Exemple d'un navire d'une souris fluoxetine-traité aiguë sans LPS. Barre d'échelle = 100 um. S'il vous plaît, cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4:. Interactions plaquettes de leucocytes in vivo S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Image représentative de l'inter-plaquettaire leucocytesactions chez la souris in vivo au cours de lipopolysaccharide induit une péritonite dans les veines. Réimpression à partir de 11.
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Discussion
Nous décrivons ici la préparation et la performance de la microscopie intravitale de veines de mésentère des souris in vivo. Cette méthode nous donne l'occasion d'observer les interactions leucocytes-endothélial et des plaquettes-endothélial 11 directement dans l'organisme vivant.
Comme un début de réponse à l'inflammation de l'endothélium obtient activé et interagit avec les leucocytes et les plaquettes entraînant dans le laminage, l'adhérence et la transmigration 12. Mais leucocytes interagissent également avec les plaquettes formant dits, complexes plaquettes leucocytes, principalement des complexes plaquettes neutrophiles (PNCS) et complexes plaquettes monocytes (SMP) 13,14 .Ces interactions peuvent être observables et quantifiables dans cette méthode.
En outre, cette technique permet d'instruction activation de l'endothélium avec des marqueurs comme VCAM-1 ou ICAM-1 (par exemple, après les interactions plaquettes / leucocytes) 15.
Le stimulus physique de la procédure elle-même provoque un certain degré d'activation endothéliale, ce qui conduit à un laminage visible de leucocytes (mais presque pas de roulement lent et pas d'adhérence ferme). Cela implique que l'examinateur doit gérer le mésentère avec grand soin. Si il ya trop activation causée par la manipulation brut, il se traduira par un nombre élevé de roulement et leucocytes adhérents. Pour atteindre un certain nombre reproductible de 30 - 80 leucocytes roulement par minute chez les souris de type sauvage, l'examinateur doit être formé.
Le blocage de la P-sélectine / PSGL-interaction pourrait servir de témoin pour confirmer l'interaction des leucocytes avec l'endothélium. Il exclut que les leucocytes sont passivement "attachés" à l'endothélium, un scénario qui peut se produire si le flux sanguin est fortement réduite.
diamètre des vaisseaux du mésentère varie environ de 200 à 300 um. Par conséquent, cette méthode ne convient pas pour évaluer la microcirculation dans les capillaires, mais se concentresur les interactions leucocytes-endothélial dans de petites veines enflammées, le lieu principal de la transmigration des leucocytes. Par rapport aux autres méthodes de microscopie intra-vitaux tels que le modèle de crémaster, cette méthode est plus facile à apprendre et peut être effectuée dans une période de temps plus courte.
Une des limitations les plus importantes de cette méthode est que les souris doivent être jeune sans beaucoup de graisse du mésentère d'avoir une bonne vue dans les vaisseaux, de sorte que cette méthode ne peut pas être effectuée après des études d'alimentation ou de traitement longs.
Une fois que l'examinateur est formé, différentes conditions inflammatoires peuvent être examinées avec cette méthode, comme l'application de LPS, thioglycollate, TNFa ou l'histamine. Plus d'imagerie spécifique de certaines cellules sanguines peut être réalisé en utilisant des molécules cibles marquées par fluorescence. Globalement, cette méthode est facile à apprendre et un moyen rapide pour examiner les interactions des leucocytes-endothélial et plaquettes leucocytes dans un organisme vivant.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Rhodamine 6G | Sigma-Aldrich | 989-38-8 | |
| Lipopolysaccharides from Escherichia coli 055:B5 | Sigma-Aldrich | L2637 |
References
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