Abstract
Intravitalmikroskopie ist eine Methode, die verwendet werden können, um verschiedene Prozesse in verschiedenen Regionen und Gefäße in lebenden Tieren zu untersuchen. In diesem Protokoll beschreiben wir Intravitalmikroskopie der Gekröse Adern. Dies kann in einem kurzen Zeitraum mit reproduzierbaren Ergebnissen, die Leukozyten-Endothel-Interaktionen in vivo durchgeführt werden. Wir beschreiben eine entzündliche Einstellung nach der LPS-Exposition des Endothels. Aber in diesem Modell kann man viele verschiedene Arten von entzündlichen Erkrankungen wie Bakterien, chemische oder biologische gelten, und untersuchen die Verabreichung von Arzneimitteln und deren direkte Auswirkungen auf die lebenden Tier und seine Auswirkungen auf die Rekrutierung von Leukozyten. Dieses Protokoll wurde erfolgreich in einer Reihe von verschiedenen Behandlungen von Mäusen und ihre Wirkungen auf entzündliche Reaktion in den Gefäßen eingesetzt. Hier beschreiben wir die Visualisierung von Leukozyten und Blutplättchen durch Fluoreszenzmarkierung diese mit Rhodamin 6G. Zusätzlich kann jede spezifische Bildgebung pe seinrformed durch gezielte fluoreszenzmarkierte Moleküle.
Introduction
Der Zweck dieses Protokolls ist es, ein vereinfachtes Verfahren der Intravitalmikroskopie der Gekröse Adern in lebenden Mäusen für die direkte Beobachtung der Leukozyten-Endothel und Leukozyten-Thrombozyten-Wechselwirkungen unter entzündlichen Erkrankungen zu beschreiben.
Intravitalmikroskopie wurde entwickelt, um Leukozyten-Endothel-Interaktionen in vivo unter entzündlichen Erkrankungen 1,2, das ist nicht trivial, aber wichtig für das Verständnis entzündlicher Leukozytenrekrutierung und Funktion zu untersuchen. Die Methode beschreiben wir in diesem Protokoll wurde auf der Grundlage zuvor veröffentlichten Publikationen entwickelt. Ähnlich Visualisierung Thrombozyten Einbau in eine wachsende Thrombus 3 und parallel zu dem, was bereits früher veröffentlicht 4 ist ein exteriorisierten Mesenterium Venendurchlichtmikroskopie untersucht. Es gibt verschiedene andere Modelle von intra-Vitalmikroskopie wie dem Cremastermuskel von Ratten 5 oder Leber der Maus und Ratten 6.
Intravitalmikroskopie Mesenterium Vene wurde entwickelt und in früheren Studien durch verschiedene Gruppen angewandt. Wir haben diese Technik verwendet werden, um Unterschiede in der Rekrutierung von Leukozyten zwischen Wildtyp-Mäusen und Tryptophan hydroxylase1 (Tph1) beobachten - / - Mäusen, die einen Mangel an nicht-neuronalen Serotonin und verglichen die Ergebnisse an Mäusen, deren Blutplättchen-Serotonin wurde pharmakologisch durch langfristige aufgebraucht sind Anwendung der ein selektiver Serotonin-Wiederaufnahmehemmer Fluoxetin 7. Wir haben auch Leukozyten-Endothel-Interaktionen nach akutem Fluoxetin-Behandlung 8 untersucht.
In diesem Protokoll konzentrieren wir uns auf Intravitalmikroskopie Mesenterium Venen, weil dieses Modell kann schnell durchgeführt werden und ermöglicht gültigen Messungen der Leukozyten-Endothel und Blutplättchen-Leukozyten-Wechselwirkungen. Dies ist viel schwieriger und zeitraub in Intravitalmikroskopie an anderen Organen, wie etwa Knochen, Leber, Haut oder M. cremaster. Der Modushier beschriebene l ist nach herausforderndes mit einem entzündlichen Stimulus, wie beispielsweise eine intraperitoneale Injektion von Lipopolysaccharid ideal zur reproduzierbaren Beurteilung von entzündlichen Zell-Zell-Interaktion.
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Protocol
Alle Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit dem Deutschen Tierschutzgesetz (TierSchG) durchgeführt. Die Mäuse wurden untergebracht ist und in Übereinstimmung mit der guten Tierpraxis gehandhabt wie FELASA (www.felasa.eu/guidelines.php) und der nationalen Tierschutzkörper GV-SOLAS (www.gv-solas.de/index.html) definiert. Die Tierschutzkomitee der Universität Freiburg sowie die lokalen Behörden (Regierungspräsidium Freiburg) stimmten allen Tierversuchen.
1. Tier Handhabung, Vorbereitung und Induktion der Entzündung
- Verwenden Sie 4 - 6 Wochen alte männliche Mäuse mit einem Gewichtsbereich von 16 bis 20 g. Hinweis: Wenn die Mäuse älter sind oder schwerer präsentieren sie überschüssiges Fett rund um das Schiff, die Begrenzung der mikroskopischen Beobachtung.
- Sterilisieren Sie alle Werkzeuge und Mikroskoptisch vor der Operation.
- Injizieren Sie 20 mg / kg LPS (Lipopolysaccharid) intraperitoneal 4 Stunden vor der in den Wohn Maus Mikroskopie, eine bakterielle Inflamm induzierenation.
- Vorwärmen eines 0,9% igen Kochsalzlösung in einem Wasserbad bei 37 ° C, um die Kunststoffkammer und Mesenterium Gewebe zu befeuchten.
- Betäuben die Maus mit einer intraperitonealen Injektion von Ketamin (100 mg / kg) und Xylazin (5 mg / kg) unmittelbar vor der Mikroskopie Verfahren. Alternative Anästhesie verwendet werden kann, beispielsweise 2% Isofluran Einatmen. Überprüfen Sie die ordnungsgemäße Betäubung durch den Verlust der Reaktion auf Reflexstimulation (toe Prise oder Schwanz mit festem Druck).
- Enthaaren den Bauch mit einem Rasierer und entfernen Sie lose Haare mit Gaze mit Ethanol 70% gesättigt.
- Gelten vet Salbe auf die Augen der Maus an Trockenheit zu verhindern, während sie unter Anästhesie.
2. Chirurgie
- Sterilisieren Sie den Bauch mit 70% Ethanol. Dieses Verfahren ist kein Verfahren und sterile könnte tödliche am Ende des Experiments.
- Führen Sie eine mediane Laparotomie: Öffnen Sie die Bauchhaut mit kleinen, gebogenen Pinzette und eine kleine Schere. Identifizieren Sie die epigastrical Gefäße und öffnen Sie das Peritoneum im Bereich der Linea alba, um die Schiffe zu schützen.
- Geben Sie einige Tropfen von Kochsalzlösung vorgewärmt in die Bauchhöhle, um das Gewebe feucht zu halten.
- Label von Leukozyten und Blutplättchen durch die Injektion fluoreszenz 50 ul Rhodamin 6G (1 mg / ml) retroorbital wie zuvor beschrieben 9,10.
- Exteriorisieren eine Schleife von ileumand Ort in einem Petrischale mit einem Durchmesser von 10 cm und stellen Sie sicher, um das Gewebe feucht durch Anlegen der 37 ° C vorgewärmt halten Kochsalzlösung (0,9%) alle zwei Minuten.
3. Intravitalmikroskopie
- Platzieren Sie die Maus unter dem Mikroskop und bringen das Gekröse Vene mit einem Durchmesser von 200 bis 300 & mgr; m in der Mitte der Ansicht. Wählen Sie ein Schiff ohne sichtbare Fett Umgebung.
- Berühren Sie nicht die Gekröse Gefäße, wodurch die Stimulation des Endothels zu vermeiden. Behandeln Sie das Ileum Schleife vorsichtig.
- Visualisieren Blutkörperchen-Endothel-Interaktionenmit einem invertierten oder aufrechten Mikroskop und eine Kamera mit einem Mikroskop-Software. Nehmen Blutkörperchen-Endothel-Interaktionen für 1 min in 4 verschiedenen Adern pro Maus.
- Euthanize die Maus durch zervikale Dislokation nach Abschluss der Bildgebung Experimente.
4. Analyse
- Durchführung der Analyse offline und für alle Parameter geblendet. Durchführung von Analysen unter Verwendung einer geeigneten Software-Programm.
- Bestätigen stabile und inter vergleichbare Blutströmungsverhältnisse in hoher Zeitauflösung cine-Clips (maximale Bildrate) auf intraluminale Blutzellenstrom konzentriert.
- Quantifizierung der Anzahl von Roll Leukozyten. Dazu ziehen Sie eine vertikale Linie durch die Vene und zählen alle Leukozyten Überschreiten dieser Linie in 1 min.
- Bestimmen Sie Walzgeschwindigkeit durch Messen der Zeit eine einzige Leukozyten muss einen Abstand von 50 & mgr; m passieren, während stabil Rollen auf Endothel. Um dies zu tun, ziehen zwei vertikale Linien in einem Abstand von 50 & mgr; turch die Vene.
- Die Zeit messen, ein Vertreter Leukozyten muss von einer Zeile zur other.Calculate die Geschwindigkeit der Leukozyten durch Teilen 50 um über den Zeitraum (& mgr; m / s) zu erhalten.
- Messen Leukozytenadhäsion in einem Bereich von 0,04 mm 2. Dazu zeichnen Sie ein Quadrat mit der Seitenlänge von 200 & mgr; m in die Vene.
- Zählen Sie die fest haftenden Leukozyten, definiert als ohne sichtbare Bewegung für 30 Sekunden, in diesem Platz.
- Zählen Sie die Anzahl von Blutplättchen an einem Leukozyten verpflichtet, Plättchen-Leukozyten-Wechselwirkungen zu quantifizieren.
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Representative Results
Ein Überblick über die in diesem Protokoll beschriebenen experimentellen Anordnung ist in Abbildung 1 dargestellt. Es zeigt eine Maus mit einem exteriorisierten Ileum-Loop und ihre Gefäße, die in Intravitalmikroskopie beobachtet werden kann, Fig. 2 zeigt bestimmte Aktivierungsgrad bei unbehandelten Tieren durch das Verfahren selbst. Aber es gibt fast keinen langsamen Rollen oder feste Adhäsion von Leukozyten im Vergleich zu LPS-behandelten Mäusen. 2 zeigt auch die verschiedenen Ergebnisse der Intravitalmikroskopie in Wildtyp-Mäusen entweder mit Fluoxetin für 3 Wochen behandelt in dem Trinkwasser oder unbehandelten Mäusen. Figur 2A- C zeigen die Ergebnisse ohne weitere entzündliche Herausforderung mit LPS, während Mäuse in 2F-H wurden mit LPS zusätzlich behandelt. Hier können wir eine höhere Anzahl von Walzen und adhärenten Leukozyten zu sehen, während die Walzgeschwindigkeit verringert nach der LPS-Herausforderung. Mit diesen Experimenten konnten wir zeigen, dass Thrombozyten Serotonin ist crucial für die ersten Schritte der Rekrutierung von Leukozyten in Entzündungs 7.
In 3 wurde Intravitalmikroskopie ohne weitere LPS und kurz nach der Akutbehandlung mit Fluoxetin intraperitoneal 2 Stunden vor der Operation durchgeführt. Hier können wir eine höhere Anzahl von fest haftenden Leukozyten und geringeren Rollgeschwindigkeiten in Fluoxetin behandelten Mäusen zu sehen, was auf einen Einfluss der akuten Fluoxetin-Behandlung auf Leukozyten-Endothel-Interaktionen 8.
In Abbildung 4 Plättchen-Leukozyten-Interaktionen während Lipopolysaccharid induzierte Peritonitis innerhalb einer Vene sichtbar gemacht. Blutplättchen sind um die Leukozyten Rosetten und diese Komplexe mit der Gefäßwand in Wechselwirkung.
Abbildung 1. Übersicht über die Experimental-Einstellungen. (A) ein anästhesierten Maus mit exteriorisierten Ileum-Loop und seine Mesenterium Gefäße (schwarzer Pfeil). (B) Intravitalmikroskop mit der Maus platziert (roter Pfeil) unter dem Ziel (schwarzer Pfeil). Lichtquelle (schwarzer Pfeil) und die Kamera (rote Pfeilspitze) sind gekennzeichnet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2. Intravitalmikroskopie Nach 3-Wochen Verabreichung von Fluoxetin zu Wildtyp-Mäusen entweder mit oder ohne LPS-Challenge. Geändert von 7 (A) Anzahl der Walz Leukozyten ohne LPS-Stimulation. (B) Leukozyten-Geschwindigkeit ohne LPS-Stimulation. (C) Zahl der fest haftenden Leukozyten ohne LPS-Stimulation.(D) Beispiel für ein Gefäß mit einer unbehandelten WT Maus ohne LPS-Exposition. (E) Beispiel für ein Gefäß eines Fluoxetin behandelten Maus ohne LPS-Exposition. (F) Zahl der Walz Leukozyten nach LPS-Stimulation. (G) Leukocyte Geschwindigkeit nach LPS-Stimulation. (H) Zahl der fest haftenden Leukozyten nach LPS-Stimulation. (I) Beispiel für ein Gefäß mit einer unbehandelten WT der Maus nach der LPS-Herausforderung. (J) Beispiel für ein Gefäß eines Fluoxetin behandelten Maus nach der LPS-Exposition. Maßstabsbalken = 100 & mgr; m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3: Intravitalmikroskopie Nach Akute Fluoxetine Challenge 2 h vor der Operation mitout LPS Herausforderung. Geändert von 8 A) Zahl der Walz Leukozyten ohne LPS-Stimulation. B) Leukozyten-Geschwindigkeit ohne LPS-Stimulation. C) Zahl der fest haftenden Leukozyten ohne LPS-Stimulation. D) Beispiel für ein Gefäß mit einer unbehandelten WT Maus ohne LPS-Exposition. E) Beispiel für ein Gefäß mit einem spitzen Fluoxetin behandelten Maus ohne LPS-Exposition. Maßstabsbalken = 100 & mgr; m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abb. 4: Plättchen-Leukozyten-Wechselwirkungen in vivo Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Repräsentatives Bild der Plättchen-Leukozyten interAktionen in Mäusen in vivo während Lipopolysaccharid induzierte Peritonitis in Adern. Sonderdruck aus 11.
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Discussion
Hier beschreiben wir die Vorbereitung und Durchführung der Intravitalmikroskopie der Gekröse Venen von Mäusen in vivo. Diese Methode gibt uns die Möglichkeit, Leukozyten-Endothel und Thrombozyten-Endothel-Interaktionen 11 direkt im lebenden Organismus zu beobachten.
Als einer der ersten Reaktion auf das Endothel Entzündung aktiviert wird und interagiert mit von Leukozyten und Blutplättchen, was zu rollen, Adhäsion und Trans 12. Aber auch Leukozyten mit Thrombozyten bilden sogenannte interagieren, Plättchen-Leukozyten-Komplexe, überwiegend plättchen Neutrophilen Komplexe (PNCs) und Thrombozyten-Monozyten-Komplexe (PMC) 13,14 .Diese Wechselwirkungen beobachtet, und bei dieser Methode quantifiziert werden.
Zusätzlich erlaubt diese Technik die Untersuchung Endothel Aktivierung mit Markern wie VCAM-1 oder ICAM-1 (beispielsweise nach dem Blutplättchen / Leukozyten-Wechselwirkungen) 15.
Die physikalischen Reiz des Verfahrens selbst verursacht ein gewisses Maß an Endothelzellen-Aktivierung, die zu sichtbaren Rollen der Leukozyten (aber fast keine langsam rollenden und keine feste Adhäsion) führt. Dies bedeutet, dass der Prüfer muss die Gekröse mit größter Sorgfalt zu behandeln. Wenn es zu viel Aktivierung durch rohe Handhabung verursacht wird es in erhöhten Zahlen von Wälz- und adhärenten Leukozyten führen. Um eine reproduzierbare Zahl von 30 zu erreichen - 80 Roll Leukozyten pro Minute in Wildtyp-Mäusen der Prüfer geschult werden.
Blockierung der P-Selektin / PSGL-Wechselwirkung könnte als Kontrolle zu dienen, um die Interaktion von Leukozyten mit Endothel bestätigen. Er schließt, dass Leukozyten passiv "angeschlossen" an das Endothel, ein Szenario, das auftreten kann, wenn der Blutfluss stark reduziert wird.
Gekröse Gefäßdurchmesser im Bereich von etwa 200 bis 300 & mgr; m. Daher ist dieses Verfahren nicht geeignet, um die Mikrozirkulation in den Kapillaren zu bewerten, sondern fokussiertauf Leukozyten-Endothel-Interaktionen in kleinen, entzündeten Venen, der primäre Ort für die Transmigration von Leukozyten. Im Vergleich zu anderen intra-vital Mikroskopieverfahren wie dem Cremaster-Modell, ist dieses Verfahren einfacher zu lernen und kann in einer kürzeren Zeit durchgeführt werden.
Eine der wichtigsten Grenzen dieser Methode ist, dass die Mäuse brauchen, jung zu sein, ohne viel Gekröse Fett um eine gute Sicht in die Gefäße aufweisen, so dass dieses Verfahren nicht nach langen Fütterung oder Therapiestudien durchgeführt werden.
Sobald der Prüfer wird trainiert, können verschiedene entzündliche Zustände mit diesem Verfahren untersucht werden, wie zum Beispiel Anwendung von LPS, Thioglycolat, TNFa oder Histamin. Präziser Bildgebung von bestimmten Blutzellen kann mit gezielten fluoreszenzmarkierte Moleküle erreicht werden. Insgesamt ist dieses Verfahren einfach zu erlernen und eine schnelle Möglichkeit, Leukozyten-Endothel und Thrombozyten-Leukozyten-Wechselwirkungen in einem lebenden Organismus zu untersuchen.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Rhodamine 6G | Sigma-Aldrich | 989-38-8 | |
| Lipopolysaccharides from Escherichia coli 055:B5 | Sigma-Aldrich | L2637 |
References
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