Abstract
We hebben een screeningsplatform dedicated humane eiwitkinasen gefosforyleerd identificeren substraten die kunnen worden gebruikt om nieuwe signaaltransductieroutes ophelderen ontwikkeld. Onze aanpak biedt het gebruik van een bibliotheek van gezuiverde GST-gelabeld humaan proteïne kinasen en een recombinant eiwit substraat plaats. We hebben gebruik gemaakt van deze technologie MAP / microtubule-affiniteit regulerende kinase 2 (MARK2) identificeren als de kinase voor glucose gereguleerde plaats op CREB Regulated Transciptie coactivator 2 (CRTC2), een eiwit dat nodig is voor betaceldeling, alsmede de Axl familie van tyrosinekinasen als regulatoren van cel metastase door fosforylering van de adapter eiwit ELMO. We beschrijven deze technologie en te bespreken hoe het kan helpen om een uitgebreide kaart van hoe cellen reageren op prikkels uit de omgeving vast te stellen.
Introduction
Protein post-translationele modificaties (PTMs) zijn essentieel voor intracellulaire communicatie. Misschien is het beste bestudeerd van PTMs is fosforylering gekatalyseerd door proteïne kinases, die een groot aantal eiwit functies, waaronder hun biochemische activiteit, subcellulaire lokalisatie, conformatie, stabiliteit en reguleren. De identificatie van fosforyleringsplaatsen op doeleiwitten kan door tryptische fosfopeptidekartering of nu standaard proteomische technieken waarbij monsters verrijkt gefosforyleerde peptides 1,2. Terwijl driekwart van het tot expressie proteoom verwachting worden gefosforyleerd 3 en een geïdentificeerde 200.000 fosforyleringslocaties 5, met schattingen tot 1 miljoen 6, veel van deze geen toegewezen biologie, signaalweg of proteïne kinase.
Terwijl de identificatie van gefosforyleerd sites is relatief eenvoudig, een relatief grotere uitdaging is omidentificeren van de verwante kinase (s) die deze plaatsen gericht een werkwijze we noemen mapping kinase: substraat paren. Verschillende benaderingen voor het identificeren van kinase: substraat paren zijn beschreven, beginnend met een kinase van belang zijn en op zoek naar de substraten of het starten met een substraat van belang en een poging om een modificerend kinase experimenteel 11/07 of computationeel 12 te vinden. Om kinases een bekende gefosforyleerd substraat identificeren, kan bioinformatica worden gebruikt om eiwitten die een korte geconserveerde sequentie van aminozuren aan weerszijden van de gefosforyleerde residu (de consensus plaatse), alsook het identificeren van kinasen die een bezinkbare complex met het substraat bevat te identificeren. Echter, deze methoden zijn tijdrovend en vaak niet met succes bekroond.
We ontwikkelden een systematische functionele benadering om snel kinasen die een bepaald substraat 13 kan fosforyleren identificeren. Het scherm test produceert uitstekende specifieketeit, met een zeer duidelijke keuze voor potentiële verwante kinases. Gezien de centrale plaats van fosforylering biologische signalering, het scherm is nuttig voor ontdekking in nagenoeg alle cellen signaalroutes 14-16. Het scherm omvat het uitvoeren van een grootschalig kinase assay met een bibliotheek van menselijk eiwit kinasen. De kinasen zijn gelabeld met bacteriële glutathion S-transferase (GST) eiwit worden gezuiverd uit zoogdiercellen celextracten, hetgeen betekent dat de recombinante enzymen - anders dan die bereid uit bacteriën - gegenereerd in aanwezigheid van het stroomopwaartse eiwit kinasen vaak nodig voor het recombinante enzymen activiteit in vitro. Inderdaad, terwijl serine, threonine en tyrosine kinase-activiteit vereist voor downstream kinase activatie aanwezig in gist 10 zijn, de gist genoom codeert 122 proteïnekinasen, wat aangeeft dat het zoogdier kinome, meer dan 500 genen 17 is geworden aanzienlijk complexer om regulaTÉ de processen die uniek zijn voor hogere orde organismen. Bovendien kan het effect van verschillende stimuli voor celbiologie en menselijke ziekten (bijvoorbeeld kleine moleculen, groeifactoren, hormonen, enz.) Worden gebruikt om relevante 14,15 moduleren kinaseactiviteit in een geschikte omgeving.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Voorbereiding van de reagentia, platen, en cellen
- Voeg 500 ml lysis buffer: 25 mM Tris pH 7,5, 150 mM NaCl, 50 mM NaF, 0,5 mM EDTA pH 8,0, 0,5% Triton X-100, 5 mM beta-glycerofosfaat, 5% glycerol. Bewaar bij 4 ° C. Onmiddellijk vóór gebruik, voeg 1 mM dithiothreitol (DTT), 1 mM fenylmethylsulfonylfluoride (PMSF), en 1 mM natriumvanadaat. Na deze stap wordt PMSF niet vereist in spoelbuffer.
- Maak 20 ml van 10x kinase buffer: 200 mM Tris pH 7,5, 50 mM beta-glycerofosfaat (FW 216), 2 mM natriumvanadaat. Aliquot in 1 ml buizen en bewaar bij -20 ° C. Onmiddellijk vóór gebruik, voeg 5 mM DTT.
- Maak 20 ml van 10x M-ATP buffer: 300 uM adenosine trifosfaat (ATP), 66 mM MgCl2, 33 mM MnCl 2. Aliquot in 1 ml buizen en bewaar bij -20 ° C.
- Voeg 100 ml 2x natriumdodecylsulfaat (SDS) lysis buffer: 1,5 g Tris-base, 20 ml glycerol, 30 ml H2O Lossen en de pH op 6,8 met HCl. Voeg 40ml 10% SDS, het volume aanpassen tot 100 ml. Voeg 25 mg broomfenolblauw.
- Spot 4 pl 25 ng / pl zoogdierlijke expressieplasmide dat codeert voor een GST-kinase 14 per putje in sets van 96 well platen en platen label dienovereenkomstig. Verbinding en bevriezen platen bij -20 ° C tot gebruik.
- 1-2 dagen voor transfectie, kweek HEK293T cellen in compleet Dulbecco's gemodificeerd Eagle medium (DMEM) + 10% foetaal runderserum (FBS) en antibiotica in een 37 ° C incubator aangevuld met CO 2 (laatste 5%). Passage met trypsine en niet toestaan dat de voorraad tot> 80% confluent worden tijdens expansie. Een minimum van 6 x 10 7 cellen voor het scherm (ongeveer 3 x 15 cm schalen van HEK293T cellen bij 80% confluentie).
2. Transfectie
Opmerking: zie figuur 1 een stroomdiagram van complete protocol.
- Als platen met kinase plasmiden zijn bevroren, ontdooien bij kamertemperatuur eennd centrifugeren bij 1900 xg gedurende 3 min om eventueel vocht te verzamelen op de bodem van putjes.
- Meng 8,6 ml gereduceerd serum medium (bijv OPTI-MEM) met 312,7 pl lipide-gebaseerde transfectie reagens. Laat zitten voor 5 min.
- Voeg 10 ul gereduceerd serum medium aan elk putje met behulp van een geautomatiseerde vloeistof dispenser uitgerust met een klein volume cassette.
- Voeg 10 ul per putje van de gereduceerde serum medium / transfectiereagens mengsel uit stap 2.2 onder toepassing van een geautomatiseerde vloeistof dispenser uitgerust met een klein volume cassette. Laat zitten voor 20 tot 45 min.
- Resuspendeer 293T cellen op 7,5 x 10 5 cellen / ml in 80 ml compleet DMEM. Voeg 100 ul celsuspensie (bijvoorbeeld 7,5 x 10 4 cellen) per putje met behulp van een geautomatiseerde vloeistof dispenser uitgerust met een standaardvolume cassette.
- Controle putjes onder microscoop voor gelijkmatige celverdeling en terugkeren naar incubator gedurende 24 uur.
3. GST-kinase Pulldown
- Maak fresh: 4 mM pervanadaat oplossing door het mengen van 60 ui van 0,2 M natrium vanadaat met 540 ui H2O In een tweede buis mix 2,7 pl 30% peroxide en 1,4 ml PBS. Voeg de twee oplossingen bij elkaar en laat zitten voor 15 min voor gebruik.
- Met behulp van een multichannel pipet (geen geautomatiseerde vloeistof dispenser gebruiken omdat dit zorgt voor te veel turbulentie in de put) afzien 2 pl 0,25 M CaCl2 in elk putje, gevolgd door 2,5 pi van het bereid in stap 3.1 pervanadaat. Incubeer elke plaat bij 37 ° C gedurende 10 minuten en plaats op ijs.
- Bereid 35 ml lysisbuffer door het toevoegen van DTT, PMSF en natriumvanadaat zoals aangegeven in artikel 1 (Voorbereiding van de reagentia).
- Houden platen op ijs, verwijder medium uit elk putje met een stofzuiger aspirator. Voeg onmiddellijk 50 ul / putje ijskoude lysisbuffer behulp van een automatische vloeistof dispenser uitgerust met een standaard cassette. Laat zitten 30 min op ijs Lyse (optioneel: kan hier indien nodig stoppen door verzegeling plate en bewaren bij -80 ° C. Om door te gaan, dooi platen op ijs).
- Spin platen bij 1900 g gedurende 3 min bij 4 ° C.
- Schrapen cellen van elk putje met behulp van een multichannel pipet en de overdracht van alle inhoud op de juiste wijze gemerkt V-bodem met 96 putjes. Spin platen bij 1900 xg gedurende 10 min bij 4 ° C.
- Tijdens rotatie, vul glutathion beklede platen (één voor elke 96-well plaat) met 100 ul / putje ijskoude lysisbuffer (zonder PMSF) als spoeling. Houd platen op ijs.
- Verwijder V-bodemplaten van de centrifuge. Een voor een, keren de glutathion platen over een wastafel te schudden uit de lysisbuffer en vlek op een papieren handdoek. Transfer lysisbuffer van de V-bodemplaten met glutathion platen door het kantelen van de plaat en met een multichannel pipet voorzichtig om de pellet te verstoren onderaan. Afdekplaten en laat op ijs voor minimaal 2 uur te binden.
- Dicht bij het einde van de 2 uur binden stap, bereiden een radioactiviteit werkstation, zodat tHij nodige voorzorgsmaatregelen zijn getroffen voor radioactief werk. Stel hybridisatie oven tot 30 ° C.
- Bereid 200 ml lysisbuffer door toevoeging van DTT en natriumvanadaat zoals aangegeven in hoofdstuk 1. PMSF is niet vereist in dit stadium.
- Keer de glutathion platen over een wastafel te schudden uit de lysisbuffer en dep op een papieren handdoek. Spoel putjes 3x met 100 ul lysisbuffer (zonder PMSF). Niet laten putten zitten droog - bewaar ze op spoelen tot klaar om verder te gaan.
- Maak 55 ml van 1 x kinasebuffer (KB) door verdunning van de 10x voorraad en het toevoegen van DTT zoals aangegeven in hoofdstuk 1. Spoel platen eenmaal met 50 pl 1x KB behulp van een geautomatiseerde vloeistof dispenser uitgerust met een standaardvolume cassette. Vertrekken 1x KB in putten tot oplossing A is klaar:
- Bereid een oplossing door toevoeging van 500 tot 530 ug van het substraat plaats, 500 ug myeline basisch eiwit (MBP), 2,65 ml 10 x KB, 13,25 pl 1 M DTT en H 2 O tot 15,9 ml.
- Bereid Oplossing B in de radioactiviteit werkgebied door het toevoegen van 2,5 ml 10x M-ATP, 500 uCi gamma 32P ATP en H 2 O tot 10 ml.
- Voeg 20 ul van Solution B per putje met behulp van een repeater pipet die helpt bij het mengen als gevolg van het uitwerpen van kracht. Dek af en incubeer bij 30 ° C hybridisatie oven 30 min.
- Na 30 min, overdrachtsplaten naar ijs. Voeg 50 ul van 2 x SDS lysis buffer aan elk putje met een multichannel pipet. Kan gaan op dit punt naar de volgende stap, of sluit de platen met aluminiumfolie en bewaar bij -20 ° C tot handig.
4. Running, kleuring, en drogen Gels
Let op: Alle werkzaamheden moeten in een gebied designa worden uitgevoerdted voor radioactiviteit.
- Schakel hybridisatie oven ingesteld op 85 ° C. Ontdooi platen bij kamertemperatuur. Eenmaal heeft oventemperatuur, overdracht platen oven en incubeer gedurende 10 minuten om monsters denatureren bereikt.
- Load 26-goed pre-cast gels met 15 pi van elke reactie met behulp van een multichannel pipet om meerdere putten te vullen in een keer. Zorg moet worden genomen dat alle tips uitgelijnd met bijbehorende goed voor het toevoegen van samples. Draaien gel op 150 V. Laat niet de tracking kleurstof (blauwe lijn) run off van de bodem van de gel, omdat dit bevat de niet opgenomen ATP.
- Demonteer de gels en snijd de niet opgenomen ATP (blauwe lijn) met een scalpel of een rechte rand als het de films zal overbelichten. Plaats de gels in geëtiketteerde containers en bedek met Coomassie vlek gedurende 15 minuten.
- Verwijder de Coomassie vlek, kort spoel de gels met water en voeg destain oplossing. Destain de gelen tot de eiwitten zichtbaar. Een band voor MBP en een band voor het substraat moetzichtbaar voor elk monster.
- Drogen de gels:
- Snijd een groot vel papier filter en plaats het op de droger.
- Bevochtig een cellofaan blad in gedestilleerd water tot het glad en kreukvrij, en plaats deze op de top van het papier.
- Leg de gels op de top van het cellofaan vel, het maken van een nota van de orde van gels. Bevochtig een tweede vel cellofaan en bovenop de gels.
- Uitrollen alle luchtbellen (een plaat afdichting roller werkt goed voor dit) voor een mooie uniform oppervlak. Sluit de flap, zet het vacuüm en droog de gels 3 uur bij 80 ° C.
- Zodra gels zijn droog, stel ze niet bloot aan XAR film met behulp van een scherm om het signaal te versterken. Wikkel de cassette met Saran Wrap of een plastic zak en sluit met tape om buiten te houden vorst. Bewaar de cassette bij -80 ° C overnacht.
5. Het ontwikkelen van XAR Films
- De volgende dag, verwijder cassette uit diepvries en laat ontdooien bij kamertemperatuur. Ontwikkelen van de film ineen donkere kamer met een film processor volgens de instructies van de fabrikant.
Let op: Controleer de films voor het bewijs van kinase-substraat paren. Een tweede langere blootstelling kan ook nuttig zijn om zwakkere fosforylering gebeurtenissen detecteren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Representatieve resultaten van een scherm worden getoond in Figuur 2. 180 kinasen werden gescreend met behulp van een GST-gelabeld peptidesubstraat overeenkomende met aa 268-283 van CRTC2 evenals de klassieke kinase assay substraat myeline basisch eiwit (MBP). Slechts twee kinasen, MARK2 en de nauw verwante kinase gefosforyleerd MARK3 de CRTC2 peptide. MBP wordt opgenomen als een interne controle in alle assays, zoals het bevat veel fosforyleerbare residuen en loopt bij 18 kDa, naar de onderkant van de gel. Dit zorgt voor een interpretatie van de specificiteit: sommige kinase zal robuust fosforyleren een substraat en MBP. Opvallend hierbij is dat de putjes met GST alleen (dwz zonder kinase controles) altijd zuiveren aantal endogene kinase-activiteit, waardoor er steeds fosforylatie achtergrond in de assay. Hoewel dit niet uitsluit dat de fosforylering van het substraat reëel, is het suggereren dat de in vitro instellen van het kinase kan minder selectief zijn.Het is bijzonder leerzaam om meerdere substraten van verschillende MW tot conclusies ten aanzien van kinase-substraat specificiteit te trekken bevatten.
Figuur 1. Stroomschema toont belangrijke stappen in het protocol. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2. Voorbeeld van scherm uitkomst. Autoradiogrammen van een scherm van versie 1 van de library (180 humane eiwitkinasen) uitgevoerd met behulp GST-peptidesubstraat overeenkomende met aa 268-283 van muis CRTC2 (overgenomen uit Jansson et al., 2008). MBP wordt myeline basisch eiwit aangegeven. De hoge substrate selectie door verwante kinases is een kenmerk van het scherm. Elke baan stelt de reactieproducten van een afzonderlijke kinase assay. MARK3 (Gel 1) en MARK2 (Gel 16), de enige kinases om TORC2 268-283 peptide fosforyleren, worden aangegeven. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Aangezien de oorspronkelijke publicaties waarin de benadering 14,15, is de oorspronkelijke bibliotheek van 180 GST-kinases uitgebreid met 420 leden, en ~ 80% van het humane eiwit kinome. Met de uitgebreide bibliotheek, het protocol zoals beschreven duurt 4-5 dagen en dan 1-4 dagen om films te ontwikkelen (als noodzakelijk geacht), die door het gebruik van fosforimaging en digitale verhoging signaal kon worden ingekort. Er zijn een aantal belangrijke stappen waarbij zorg moet worden genomen (zie figuur 1 voor overzicht protocol). Ten eerste is de gezondheid van de voorraad cellen (mycoplasma vrije, niet mogen confluentie bereiken tijdens expansie en behandeld met trypsine bij elke passage) tijdens de batch expansiefase en in de 96 putjesplaten bij de transfectie. De cellen moeten gelijkmatig gezaaid zijn, en 80% confluent bij transfectie plaatsvindt (Stap 1.5).
Ten tweede is ideaal tijdens de transfectie van een automatische vloeistof dispenser volume transf minimaliserener fouten, waardoor het beperken van coëfficiënt van variaties ("cvs") tussen de putten. Voor kleine volumes, de montage van de dispenser met een kleiner volume cassette grenzen reagens verlies als gevolg van lagere volumes en doden stijgt doseren nauwkeurigheid. De behandelingsstap met natrium pervanadaat een pan tyrosine fosfatase inhibitor wordt gebruikt als een algemene stimulans fosforylatiestatus van target kinasen te verhogen. Opname van calcium bij deze stap verhoogt cel-matrix adhesie, het voorkomen van cel verlies als gevolg van afronding uitgelokt door langdurige pervanadaat behandeling. Deze stap moet worden gedaan met een strikte naleving van de 10 minuten incubatietijd.
Ten derde, het kinase assay zelf, zijn er verschillende overwegingen bij de keuze van het recombinante substraat: peptides, eiwitdomeinen of intacte proteïnen zo groot als 120 kDa kunnen allemaal worden gebruikt. Wanneer een specifiek fosforylatieplaats bekend is, een peptide substraat de straight-forward benadering, maar moet groot genoeg zijn om te kunnen waarnemenOp een SDS-PAGE gel. Aldus kan peptidensubstraten worden gefuseerd aan GST en gezuiverd uit bacteriën een MW> 25 geven. Grotere eiwitten hebben het voordeel dat ze waarschijnlijk zijn gevouwen en de fosforyleerbare residuen blootgesteld zouden in de cel, maar hebben het nadeel dat ze additionele residuen die gefosforyleerd kunnen zijn en geeft signaal in de assay. Onze voorkeur gaat uit naar een scherm bestuurd door een peptidesubstraat opgebouwd uit 15-20 aminozuren rond een residu dat bekend is gefosforyleerd in vivo en is bekend om een biologische gebeurtenis te regelen, aangezien dit maakt van de kandidaatgenen kinases van het scherm beiden in vitro en in vivo sneller.
Last, idealiter de hoeveelheid eiwit aanpak of meer dan 1 ug per putje; dit natuurlijk afhankelijk van het MW van het substraat. Minder eiwit per putje kan zinvolle treffers opleveren, maar de 'meer is beter' geldt als het verhoogt signaal: noise. Standaard worden niet-gradiëntgels aanbevolen als gradiëntgels kraken te vaak tijdens het drogen. Na drogen van de gelen, detectie van een radioactief signaal over achtergrond met een geigerteller geeft een goede indicatie van slagen van de test.
Aangezien het scherm in vitro en hogere mate van complexiteit bestaan in vivo, moet een kandidaat kinase (s) voor een bepaald substraat worden bevestigd in cellen. In het bijzonder kan het scherm een familielid dat de biochemische vermogen aan het substraat in vitro fosforyleren heeft nog niet tot expressie gebracht in hetzelfde celtype of in hetzelfde subcellulair compartiment als het substraat identificeren. Terwijl bijvoorbeeld MARK2 en MARK3 beiden hits in een scherm kinase dat CRTC2 kan fosforyleren op Ser275, maar MARK2 vormde een complex met het substraat 14 cellen. De volgende zijn een aantal aanvullende experimenten die kan worden gebruikt om de fysiologische relevantie van een gegadigde kinase bevestigen. Sparst, mobiliteit verschuivingen van het substraat op SDS-PAGE na co-expressie van de gegadigde kinase kan worden gebruikt als bevestiging control. Passende controles dergelijke cotransfectie van een katalytisch inactief kinase kan bevestigen specificiteit. Ten tweede kan het substraat worden geïmmunoprecipiteerd van celextracten die zijn geïncubeerd met 32P-orthofosfaat om opname van fosfaat in het substraat te bevestigen bij aanwezigheid van het wildtype en niet een katalytisch inactieve kinase. Ten derde kan een fosfospecifiek antilichaam opgewekt tegen phosphoacceptor sequentie (indien bekend) en gebruikt om een toename van substraatfosforylering bevestigen wanneer het kinase wordt overexpressie. Een secundaire screening met een mutant substraat dat een niet-fosforyleerbare residu op de doelplaats kan specificiteit bevestigen voordat genereren van een phosphoantibody, een bijzonder belangrijke controle bij grotere domein en full-length eiwit substraten. Farmacologische remming zal een candi remmendatum kinase kan ook worden gebruikt, maar voorzichtigheid moet worden uitgeoefend remming verwante kinasen een underappreciated werkelijkheid. Last, RNAi-gemedieerde silencing van de gegadigde kinase (s) in cellen gevolgd en western blotting verlies van doelwitplaats fosforylering met een fosfospecifiek antilichaam monitor kan worden uitgevoerd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door NSERC subsidie 386634. Wij willen de leden van de Screaton Lab bedanken voor nuttig discussies.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lysis buffer | Made in house | See Protocol step 1.1 | |
| 10x kinase buffer | Made in house | See Protocol step 1.2 | |
| 10x M-ATP | Made in house | See Protocol step 1.3 | |
| Human kinase plasmids | Orfeome, Invitrogen, Origene | GST-tagged in house | |
| 96 well plates | Fisher Scientific | CS003595 | |
| 293T cells | ATCC | CRL-11268 | |
| DMEM | Fisher Scientific | SH3002201 | supplement with 100 U/ml penicillin, 100 μg/ml streptomycin, 10% fetal calf serum. |
| CO2 incubator | Sanyo | MCO-17AIC | |
| 15 cm cell culture dishes | Fisher Scientific | 877224 | |
| Reduced serum medium | Invitrogen | 22600-050 | |
| Lipid-based transfection reagent | Invitrogen | 11668-019 | |
| Automated liquid dispenser | Thermo Scientific | 5840300 | |
| Small cassette attachment | Thermo Scientific | 24073295 | |
| Standard cassette attachment | Thermo Scientific | 14072670 | |
| 4 mM pervanadate | Made in house | See Protocol step 3.1 | |
| 0.25 M CaCl2 | Made in house | ||
| Multichannel pipette (20-200 μl) | Labnet | p4812-200 | |
| Multichannel pipette (1-10 μl) | Thermo Scientific | 4661040 | |
| V-bottom 6-well plates | Evergreen Scientific | 290-8116-01V | |
| Glutathione coated 96-well plates | Fisher Scientific | PI-15240 | |
| Hybridization oven | Biostad | 350355 | |
| GST tagged substrate | Made in house | ||
| Myelin Basic Protein (MBP) | Sigma | M1891 | |
| Repeater pipette (1 ml) | Eppendorf | 22266209 | |
| 32P gamma-ATP | Perkin Elmer | BLU502Z500UC | |
| 2x SDS lysis buffer (100 ml) | Made in house | See Protocol step 1.4 | |
| 26-well precast TGX gels | BioRad | 567-1045 | gel percentage required is dependent on the molecular weight of the substrate of interest |
| Coomassie stain | Made in house | 0.1% Coomassie R250, 10% acetic acid, 40% methanol | |
| Coomassie destain | Made in house | 10% acetic acid, 20% methanol | |
| Labeled gel containers | Made in house | Used plastic lids from empty tip boxes, just big enough to contain one gel | |
| Whatman filter paper | Fisher Scientific | 57144 | |
| Cellophane sheets (2) | BioRad | 165-0963 | |
| Gel dryer | Labconco | 4330150 | |
| Double emulsion autoradiography film | VWR | IB1651454 | |
| Film cassette | Fisher Scientific | FBAC-1417 | |
| Intensifying screen | Fisher Scientific | FBIS-1417 | |
| Plate sealing rubber roller | Sigma | R1275 |
References
- Meisenhelder, J., Hunter, T., van der Geer, P. Phosphopeptide mapping and identification of phosphorylation sites. Curr Protoc Mol Biol. 18, Unit 18 19 (2001).
- Doll, S., Burlingame, A. L. Mass spectrometry-based detection and assignment of protein posttranslational modifications. ACS chem. 10, 63-71 (2015).
- Sharma, K., et al. Ultradeep human phosphoproteome reveals a distinct regulatory nature of Tyr and Ser/Thr-based signaling. Cell rep. 8, 1583-1594 (2014).
- Cohen, P. The regulation of protein function by multisite phosphorylation--a 25 year update. Trends Biochem Sci. 25, 596-601 (2000).
- Walsh, C. T. Posttranslation Modification of Proteins: Expanding Nature's Inventory. , 1st edn, Roberts and Company Publishers. (2006).
- Boersema, P. J., et al. In-depth qualitative and quantitative profiling of tyrosine phosphorylation using a combination of phosphopeptide immunoaffinity purification and stable isotope dimethyl labeling. Mol Cell Proteomics. 9, 84-99 (2010).
- Hutti, J. E., et al. A rapid method for determining protein kinase phosphorylation specificity. Nat Methods. 1, 27-29 (2004).
- Johnson, S. A., Hunter, T. Kinomics: methods for deciphering the kinome. Nat Methods. 2, 17-25 (2005).
- Pawson, T., Nash, P. Assembly of cell regulatory systems through protein interaction domains. Science. 300, 445-452 (2003).
- Zhu, H., et al. Analysis of yeast protein kinases using protein chips. Nat Genet. 26, 283-289 (2000).
- Shah, K., Shokat, K. M. A chemical genetic approach for the identification of direct substrates of protein kinases. Methods Mol Biol. 233, 253-271 (2003).
- Zou, L., et al. PKIS: computational identification of protein kinases for experimentally discovered protein phosphorylation sites. BMC bioinform. 14, 247 (2013).
- Varjosalo, M., et al. Application of active and kinase-deficient kinome collection for identification of kinases regulating hedgehog signaling. Cell. 133, 537-548 (2008).
- Jansson, D., et al. Glucose controls CREB activity in islet cells via regulated phosphorylation of TORC2. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 10161-10166 (2008).
- Fu, A., Screaton, R. A. Using kinomics to delineate signaling pathways: control of CRTC2/TORC2 by the AMPK family. Cell Cycle. 7, 3823-3828 (2008).
- Abu-Thuraia, A., et al. Axl phosphorylates elmo scaffold proteins to promote rac activation and cell invasion. Mol Cell Biol. 35, 76-87 (2015).
- Manning, G., Whyte, D. B., Martinez, R., Hunter, T., Sudarsanam, S. The protein kinase complement of the human genome. Science. 298, 1912-1934 (2002).
