Abstract
हम उपन्यास संकेत पारगमन मार्ग को स्पष्ट करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, जो फॉस्फोरिलेटेड substrates के लिए समर्पित मानव प्रोटीन kinases की पहचान करने के लिए एक स्क्रीनिंग प्लेटफार्म विकसित किया है। हमारा दृष्टिकोण शुद्ध जीएसटी टैग मानव प्रोटीन kinases के एक पुस्तकालय और ब्याज की एक पुनः संयोजक प्रोटीन सब्सट्रेट के उपयोग की सुविधा है। हम CREB विनियमित Transcriptional coactivator 2 (CRTC2) पर एक ग्लूकोज विनियमित साइट के लिए काइनेज के रूप में नक्शे / सूक्ष्मनलिका आत्मीयता विनियमन काइनेज 2 (MARK2) की पहचान करने के लिए एक बीटा सेल प्रसार के लिए आवश्यक प्रोटीन, साथ ही इस तकनीक का इस्तेमाल किया है टाइरोसीन का एक्सल परिवार एडाप्टर प्रोटीन एल्मो के फोस्फोराइलेशन द्वारा सेल मेटास्टेसिस के नियामकों के रूप में kinases। हम इस तकनीक का वर्णन है और यह कोशिकाओं पर्यावरण उत्तेजनाओं का जवाब कैसे की एक व्यापक नक्शा स्थापित करने में मदद कैसे कर सकते हैं पर चर्चा की।
Introduction
प्रोटीन बाद translational संशोधनों (PTMs) इंट्रासेल्युलर संचार के लिए आवश्यक हैं। शायद सभी PTMs का अध्ययन किया सबसे अच्छा subcellular स्थानीयकरण, रचना, और स्थिरता, उनकी जैव रासायनिक गतिविधि सहित प्रोटीन कार्यों के असंख्य विनियमित जो प्रोटीन kinases, द्वारा उत्प्रेरित फास्फोरिलीकरण है। लक्ष्य प्रोटीन पर फास्फोरिलीकरण साइटों की पहचान tryptic phosphopeptide मानचित्रण द्वारा या फॉस्फोरिलेटेड पेप्टाइड्स 1,2 के लिए समृद्ध नमूने का उपयोग अब मानक प्रोटिओमिक तकनीक के द्वारा पूरा किया जा सकता है। व्यक्त proteome के तीन तिमाहियों 3 phosphorylated होने की उम्मीद है और एक 1 लाख 6 तक के अनुमान के साथ 200,000 फास्फोरिलीकरण साइटों 5 की पहचान कर रहे हैं, इनमें से कई मार्ग, या प्रोटीन काइनेज संकेत, कोई सौंपा जीव विज्ञान है।
फॉस्फोरिलेटेड साइटों की पहचान एक अपेक्षाकृत बड़ी चुनौती है, अपेक्षाकृत सरल है, जबकिसब्सट्रेट जोड़े: इन साइटों को लक्षित करता है कि आत्मीय काइनेज (एस), हम मानचित्रण काइनेज के रूप में देखें एक प्रक्रिया की पहचान। सब्सट्रेट जोड़े वर्णित किया गया है, या तो ब्याज की एक काइनेज के साथ शुरू और उसके substrates के लिए देख रहे हैं या ब्याज की एक सब्सट्रेट के साथ शुरू करने और एक संशोधित काइनेज प्रयोगात्मक 7-11 या computationally 12 खोजने का प्रयास: काइनेज की पहचान करने के लिए कई दृष्टिकोण। एक ज्ञात फॉस्फोरिलेटेड सब्सट्रेट के लिए kinases की पहचान करने के लिए, जैव सूचना विज्ञान सब्सट्रेट के साथ एक precipitable जटिल है कि फार्म kinases फॉस्फोरिलेटेड छाछ (आम सहमति साइट) flanking, साथ ही पहचान के अमीनो एसिड की एक छोटी संरक्षित अनुक्रम में होते हैं कि प्रोटीन की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। हालांकि, इन तरीकों समय लेने वाली होती हैं और अक्सर सफलता के साथ पूरा नहीं करते।
हम तेजी से एक दिया सब्सट्रेट 13 phosphorylate कर सकते हैं कि kinases की पहचान के लिए एक व्यवस्थित कार्यात्मक दृष्टिकोण विकसित किया है। स्क्रीन परख उत्कृष्ट विशिष्ट का उत्पादनसंभावित आत्मीय kinases के लिए बहुत स्पष्ट चयन के साथ अल्पसंख्यक,। जैविक सिगनल को फास्फोरिलीकरण की केन्द्रीयता को देखते हुए, स्क्रीन के लगभग सभी सेल संकेत दे रास्ते 14-16 में खोज के लिए उपयोगी है। स्क्रीन मानव प्रोटीन kinases के एक पुस्तकालय के साथ एक बड़े पैमाने पर काइनेज परख प्रदर्शन शामिल है। kinases बैक्टीरियल glutathione एस ट्रांस्फ़्रेज़ (जीएसटी) प्रोटीन के साथ चिह्नित किया गया है और पुनः संयोजक एंजाइमों जिसका मतलब है कि स्तनधारी सेल के अर्क से शुद्ध कर रहे हैं - बैक्टीरिया से तैयार उन लोगों के विपरीत - अक्सर के लिए आवश्यक नदी के ऊपर प्रोटीन kinases की उपस्थिति में उत्पन्न कर रहे हैं पुनः संयोजक एंजाइमों इन विट्रो में गतिविधि है। सेरीन, threonine, और tyrosine kinase गतिविधि डाउनस्ट्रीम काइनेज क्रियान्वयन के लिए आवश्यक है, जबकि वास्तव में, खमीर 10 में मौजूद हैं, खमीर जीनोम 500 से अधिक जीन 17 के साथ स्तनधारी kinome, क्रम में करने के लिए काफी अधिक जटिल हो गया है यह दर्शाता है कि 122 प्रोटीन kinases कूटबद्ध नियमोंउच्च आदेश जीवों के लिए अद्वितीय प्रक्रियाओं ते। इसके अलावा, कोशिका जीव विज्ञान और (जैसे छोटे अणुओं, वृद्धि कारक है, हार्मोन, के रूप में) मानव रोग के लिए प्रासंगिक विभिन्न उत्तेजनाओं के प्रभाव का एक उपयुक्त संदर्भ में 14,15 न्यूनाधिक kinase गतिविधि के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
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Protocol
अभिकर्मकों, प्लेट्स, और प्रकोष्ठों के 1. तैयारी
- 25 मिमी Tris पीएच 7.5, 150 मिमी NaCl, 50 मिमी NAF, 0.5 मिमी EDTA पीएच 8.0, 0.5% TritonX-100, 5 मिमी बीटा-glycerophosphate, 5% ग्लिसरॉल: 500 मिलीलीटर lysis बफर बनाओ। 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर। , उपयोग 1 मिमी dithiothreitol (डीटीटी), 1 मिमी phenylmethyl Sulfonyl फ्लोराइड (PMSF), और 1 मिमी सोडियम वैनेडेट जोड़ने के तुरंत पहले। इस कदम के बाद, PMSF किसी भी कुल्ला बफर में आवश्यक नहीं है।
- 200 मिमी Tris पीएच 7.5, 50 मिमी बीटा-glycerophosphate (परिवार कल्याण 216), 2 मिमी सोडियम वैनेडेट: 10x Kinase बफर के 20 मिलीलीटर बनाओ। -20 डिग्री सेल्सियस पर 1 मिलीलीटर ट्यूबों में अशेष और दुकान। , उपयोग 5 मिमी डीटीटी जोड़ने के तुरंत पहले।
- 300 माइक्रोन एडेनोसाइन ट्रायफ़ोस्फेट (एटीपी), 66 मिमी 2 MgCl, -20 डिग्री सेल्सियस पर 33 मिमी MnCl 2. 1 मिलीलीटर ट्यूबों में अशेष और दुकान: 10x एम एटीपी बफर के 20 मिलीलीटर बनाओ।
- 2x सोडियम dodecyl सल्फेट के 100 मिलीलीटर (एसडीएस) lysis बफर: 1.5 ग्राम TRIS आधार, 20 मिलीलीटर ग्लिसरॉल, 30 मिलीलीटर एच 2 ओ भंग और एचसीएल के साथ 6.8 पीएच को समायोजित करें। 40 जोड़ेमिलीलीटर 10% एसडीएस, 100 मिलीलीटर मात्रा समायोजित करें। 25 मिलीग्राम bromophenol नीले जोड़ें।
- स्पॉट तदनुसार 96 अच्छी तरह प्लेटें और लेबल प्लेटों के सेट में अच्छी तरह से प्रति एक जीएसटी काइनेज 14 एन्कोडिंग 25 एनजी / μl स्तनधारी अभिव्यक्ति प्लाज्मिड के 4 μl। उपयोग करें जब तक -20 डिग्री सेल्सियस पर सील और फ्रीज प्लेटें।
- अभिकर्मक के लिए 1-2 दिन पहले, सीओ 2 (अंतिम 5%) के साथ पूरक एक 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में संस्कृति HEK293T पूरा Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम (DMEM) + 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) में कोशिकाओं और एंटीबायोटिक दवाओं। और trypsin के साथ पारित होने के शेयर विस्तार के दौरान> 80% मिला हुआ बनने के लिए अनुमति नहीं है। 6 10 x 7 कोशिकाओं की एक न्यूनतम स्क्रीन (80% संगम पर HEK293T कोशिकाओं के लगभग 3 एक्स 15 सेमी व्यंजन) के लिए आवश्यक हैं।
2. अभिकर्मक
नोट: पूरे प्रोटोकॉल का प्रवाह संचित्र के लिए चित्रा 1 देखें।
- काइनेज प्लास्मिडों युक्त प्लेटों जमे हुए किया गया है, तो कमरे के तापमान एक से पिघलनाएन डी कुओं के तल पर किसी भी नमी इकट्ठा करने के लिए 3 मिनट के लिए 1,900 XG पर अपकेंद्रित्र।
- लिपिड आधारित अभिकर्मक अभिकर्मक के 312.7 μl के साथ कम सीरम मध्यम (जैसे, ऑप्टी सदस्य) के 8.6 मिलीलीटर मिलाएं। 5 मिनट के लिए बैठते हैं।
- एक छोटी मात्रा कैसेट के साथ लगे एक स्वचालित तरल निकालने की मशीन का उपयोग कर प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए कम सीरम माध्यम के 10 μl जोड़ें।
- एक छोटी मात्रा कैसेट के साथ लगे एक स्वचालित तरल निकालने की मशीन का उपयोग कर कदम 2.2 से घटाकर सीरम मध्यम / अभिकर्मक अभिकर्मक मिश्रण के साथ-साथ प्रति 10 μl जोड़ें। 20 से 45 मिनट के लिए बैठते हैं।
- पूरा DMEM के 80 मिलीलीटर में 7.5 x 10 5 कोशिकाओं / एमएल पर Resuspend 293T कोशिकाओं। अच्छी तरह से एक मानक मात्रा कैसेट के साथ लगे एक स्वचालित तरल निकालने की मशीन का उपयोग कर प्रति सेल निलंबन (यानी 7.5 x 10 4 कोशिकाओं) के 100 μl जोड़ें।
- वर्दी सेल वितरण के लिए माइक्रोस्कोप के तहत कुओं की जाँच करें और 24 घंटे के लिए इनक्यूबेटर पर लौटने।
3. जीएसटी काइनेज Pulldown
- च बनाओresh: एच 2 ओ के 540 μl के साथ 0.2 एम सोडियम वैनेडेट के 60 μl मिश्रण से 4 मिमी pervanadate समाधान एक दूसरे ट्यूब मिश्रण 30% पेरोक्साइड के 2.7 μl और पीबीएस के 1.4 मिलीलीटर में। एक साथ दो समाधान जोड़ें और उपयोग करने से पहले 15 मिनट के लिए बैठते हैं।
- (यह अच्छी तरह से में बहुत ज्यादा अशांति पैदा करता है के रूप में एक स्वचालित तरल निकालने की मशीन का उपयोग नहीं करते) 3.1 कदम में तैयार pervanadate के 2.5 μl के द्वारा पीछा किया, प्रत्येक कुएं में 0.25 एम 2 CaCl के 2 μl बांटना एक multichannel विंदुक का उपयोग करना। 10 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर एक थाली सेते हैं और फिर बर्फ पर जगह है।
- धारा 1 (अभिकर्मकों की तैयारी) में संकेत के रूप डीटीटी, PMSF, और सोडियम वैनेडेट जोड़कर lysis बफर के 35 मिलीलीटर की तैयारी।
- बर्फ पर प्लेटों में रखते हुए प्रत्येक अच्छी तरह से एक वैक्यूम खींचने की मशीन का उपयोग करने से मध्यम निकालें। इसके तत्काल बाद एक मानक कैसेट के साथ लगे एक स्वचालित तरल निकालने की मशीन का उपयोग कर 50 μl / अच्छी तरह से बर्फ के ठंडे lysis बफर जोड़ें। Lyse करने के लिए बर्फ पर 30 मिनट के लिए बैठते हैं (वैकल्पिक: बेनी सील द्वारा यहां यदि आवश्यक हो तो रोक सकताई और -80 डिग्री सेल्सियस पर भंडारण। बर्फ पर, पिघलना प्लेट) जारी रखने के लिए।
- 4 डिग्री सेल्सियस पर 3 मिनट के लिए 1,900 XG पर स्पिन प्लेटें।
- प्रत्येक अच्छी तरह से एक multichannel विंदुक का उपयोग करने से कोशिकाओं परिमार्जन और सभी सामग्री को स्थानांतरित उचित रूप से वी के नीचे 96 अच्छी तरह प्लेटें लेबल करने के लिए। 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 1,900 XG पर स्पिन प्लेटें।
- स्पिन के दौरान, एक कुल्ला के रूप में 100 μl / अच्छी तरह से (PMSF के बिना) बर्फ का ठंडा lysis बफर के साथ glutathione लेपित प्लेट (प्रत्येक 96 अच्छी तरह से थाली के लिए एक) भरें। बर्फ पर प्लेटों रखें।
- सेंट्रीफ्यूज से वि नीचे प्लेटों निकालें। एक बार में एक, एक कागज तौलिया पर lysis बफर और धब्बा बाहर मिलाने के लिए एक सिंक पर glutathione प्लेटों पलटना। नीचे गोली को परेशान नहीं करने के लिए सावधान किया जा रहा है, थाली झुकने और एक multichannel विंदुक का उपयोग करके glutathione प्लेटों के लिए वि नीचे प्लेटों से lysis बफर स्थानांतरण। प्लेटों को कवर किया और बाध्य करने के लिए कम से कम 2 घंटे के लिए बर्फ पर छोड़ दें।
- 2 घंटा बाध्यकारी कदम के अंत के निकट, टी, यह सुनिश्चित करने के लिए एक रेडियोधर्मिता कार्य केंद्र तैयारवह आवश्यक सुरक्षा सावधानियों रेडियोधर्मी काम के लिए जगह में हैं। 30 डिग्री सेल्सियस के लिए सेट संकरण ओवन।
- इस स्तर पर की आवश्यकता नहीं है धारा 1. PMSF में संकेत के रूप में जोड़ने डीटीटी और सोडियम वैनेडेट द्वारा lysis बफर के 200 मिलीलीटर तैयार करें।
- Lysis बफर बाहर मिलाने और एक कागज तौलिया पर दाग एक सिंक पर glutathione प्लेटों उलटें। कुल्ला कुओं (PMSF के बिना) 100 μl lysis बफर के साथ 3x। आगे बढ़ने के लिए तैयार है जब तक कुल्ला में उन्हें रखने के लिए - कुओं सूखी बैठ मत देना।
- 10x शेयर गिराए और एक मानक मात्रा कैसेट के साथ लगे एक स्वचालित तरल निकालने की मशीन का उपयोग कर 1x केबी के 50 μl के साथ 1. कुल्ला प्लेटें एक बार धारा में संकेत के रूप डीटीटी जोड़कर 1x काइनेज बफर (केबी) के 55 मिलीलीटर की तैयारी। समाधान के लिए तैयार है जब तक कुओं में 1x केबी छोड़ दो:
- 15.9 मिलीलीटर तक 530 हित के सब्सट्रेट के माइक्रोग्राम, माइलिन बुनियादी प्रोटीन की 500 ग्राम (MBP), 10x के 2.65 मिलीलीटर केबी, 1 एम डीटीटी का 13.25 μl, और एच 2 ओ के लिए 500 जोड़कर समाधान एक तैयार करें।
- 2.5 मिलीलीटर 10x एम एटीपी, 500 μCi gamma- 32 पी एटीपी, और एच 2 ओ के लिए 10 मिलीलीटर जोड़कर रेडियोधर्मिता कार्य क्षेत्र में समाधान बी तैयार करें।
- अच्छी तरह से इंजेक्शन बल के कारण मिश्रण में एड्स एक अपराधी पिपेट का उपयोग प्रति समाधान बी के 20 μl जोड़ें। कवर और 30 मिनट के लिए 30 डिग्री सेल्सियस संकरण ओवन में सेते हैं।
- 30 मिनट के बाद, बर्फ के लिए वापस प्लेटें हस्तांतरण। प्रत्येक अच्छी तरह से एक मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग करने के लिए 2x एसडीएस lysis बफर के 50 μl जोड़ें। अगले कदम के लिए इस बिंदु पर आगे बढ़ना है, या सुविधाजनक तक -20 डिग्री सेल्सियस पर एल्यूमीनियम पन्नी और दुकान के साथ प्लेटों सील कर सकते हैं।
4. रनिंग, धुंधला, और सुखाने जैल
नोट: सभी काम एक क्षेत्र DESIGNA में किया जाना चाहिएरेडियोधर्मिता के लिए टेड।
- संकरण ओवन पर मुड़ें और 85 डिग्री सेल्सियस के लिए निर्धारित किया है। कमरे के तापमान पर पिघलना प्लेटें। एक बार जब ओवन ओवन और 10 मिनट के नमूनों denature करने के लिए सेते तापमान, स्थानांतरण प्लेटों पर पहुँच गया है।
- एक मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग कर प्रत्येक प्रतिक्रिया के 15 μl के साथ लोड 26-अच्छी तरह से पूर्व डाली जैल एक बार में कई कुओं को भरने के लिए। देखभाल के सभी सुझावों इसी अच्छी तरह से पहले नमूने को जोड़ने के साथ पंक्ति में है कि लिया जाना चाहिए। इस अनिगमित एटीपी शामिल है के रूप ट्रैकिंग डाई (नीली रेखा) जेल के नीचे का भाग मत देना 150 वी पर जेल चला।
- जैल विघटित और एक छुरी या यह फिल्मों overexpose जाएगा के रूप में सीधे बढ़त का उपयोग अनिगमित एटीपी (नीली रेखा) से काट डाला। लेबल कंटेनर में जैल की जगह और 15 मिनट के लिए Coomassie दाग के साथ कवर।
- संक्षेप में, Coomassie दाग को दूर पानी के साथ जैल कुल्ला, और समाधान destain जोड़ें। जैल Destain प्रोटीन स्पष्ट रूप से दिखाई दे रहे हैं जब तक। MBP के लिए एक बैंड और सब्सट्रेट के लिए एक बैंड चाहिएप्रत्येक नमूने के लिए दिखाई।
- जैल सुखाने के लिए:
- फिल्टर पेपर की एक बड़ी चादर कट और ड्रायर पर जगह है।
- यह चिकनी है जब तक आसुत जल में एक सिलोफ़न चादर गीले और मुक्त शिकन, और कागज के शीर्ष पर जगह है।
- जैल के आदेश की एक नोट बनाने, सिलोफ़न शीट के शीर्ष पर जैल निर्धारित करना। एक दूसरे सिलोफ़न चादर गीले और जैल के शीर्ष पर जगह है।
- एक अच्छा वर्दी सतह के लिए सभी बुलबुले (एक थाली सील रोलर इस के लिए अच्छी तरह से काम करता है) बाहर रोल। , फ्लैप बंद वैक्यूम मोड़ पर है, और 80 डिग्री सेल्सियस पर 3 घंटे के लिए जैल सूखी।
- जैल सूख रहे हैं एक बार, संकेत तेज करने के लिए एक स्क्रीन का उपयोग Xar फिल्म के लिए उन्हें बेनकाब। सरन लपेटो या एक प्लास्टिक बैग के साथ कैसेट लपेटें और ठंढ बाहर रखने के लिए टेप के साथ सील। -80 डिग्री सेल्सियस रात भर में कैसेट की दुकान।
5. Xar फिल्मों के विकास
- अगले दिन, फ्रीजर से कैसेट को हटाने और कमरे के तापमान पर पिघलना करते हैं। में फिल्म का विकासएक darkroom निर्माता के निर्देशों के अनुसार एक फिल्म प्रोसेसर का उपयोग।
नोट: काइनेज-सब्सट्रेट जोड़े के सबूत के लिए फिल्मों की जांच करना। एक दूसरा अब जोखिम भी कमजोर फास्फोरिलीकरण घटनाओं का पता लगाने के लिए उपयोगी हो सकता है।
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Representative Results
एक स्क्रीन से प्रतिनिधि परिणाम चित्रा 2 में दिखाया गया है। 180 kinases CRTC2 साथ ही साथ क्लासिक काइनेज परख सब्सट्रेट माइलिन बुनियादी प्रोटीन (MBP) से हूँ 268-283 को इसी जीएसटी टैग पेप्टाइड सब्सट्रेट का उपयोग जांच की गई। केवल दो kinases, MARK2 और अत्यधिक संबंधित काइनेज MARK3 CRTC2 पेप्टाइड phosphorylated। यह कई phosphorylatable अवशेष शामिल हैं और जेल के नीचे की ओर, 18 केडीए पर चलाता है के रूप में MBP, सभी assays में एक आंतरिक नियंत्रण के रूप में शामिल है। इस विशिष्टता की एक व्याख्या के लिए अनुमति देता है: कुछ काइनेज मजबूती के साथ एक सब्सट्रेट और MBP phosphorylate जाएगा। यहाँ नोट के इस प्रकार हमेशा परख में पृष्ठभूमि फास्फोरिलीकरण है, वहाँ (कोई काइनेज नियंत्रण यानी) अकेले जीएसटी युक्त कुओं हमेशा कुछ अंतर्जात kinase गतिविधि को शुद्ध करता है। इस सब्सट्रेट के फास्फोरिलीकरण असली है कि बाहर से इनकार नहीं करता है, यह कम चयनात्मक हो सकता है काइनेज स्थापित करने के लिए इन विट्रो में सुझाव है कि।यह काइनेज-सब्सट्रेट विशिष्टता के बारे में निष्कर्ष आकर्षित करने के लिए मेगावाट भिन्न की कई substrates के शामिल करने के लिए विशेष रूप से जानकारीपूर्ण है।
चित्रा प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण कदम दिखा 1. फ़्लोचार्ट। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
पुस्तकालय (180 मानव प्रोटीन kinases) के संस्करण 1 के एक स्क्रीन के चित्रा स्क्रीन परिणाम 2. उदाहरण। Autoradiographs (जैनसन से reproduced एट अल।, 2008) माउस CRTC2 के आ 268-283 के लिए इसी जीएसटी पेप्टाइड सब्सट्रेट का उपयोग किया। MBP, माइलिन बुनियादी प्रोटीन संकेत दिया है। एस के उच्च स्तरसंबंधित kinases द्वारा ubstrate चयन स्क्रीन की एक विशेषता है। प्रत्येक लेन एक अलग काइनेज परख से प्रतिक्रिया उत्पादों का प्रतिनिधित्व करता है। MARK3 (जेल 1) और MARK2 (जेल 16), केवल kinases TORC2 268-283 पेप्टाइड phosphorylate करने के लिए, संकेत कर रहे हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
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Discussion
दृष्टिकोण 14,15 का वर्णन मूल प्रकाशनों के बाद से, 180 जीएसटी kinases के मूल पुस्तकालय मानव प्रोटीन kinome के 420 सदस्यों, या ~ 80% करने के लिए विस्तारित किया गया है। विस्तार किया पुस्तकालय के साथ, के रूप में वर्णित प्रोटोकॉल (आवश्यक समझा रूप में) phosphorimaging और डिजिटल सिग्नल बढ़ाने के उपयोग से छोटा किया जा सकता है, जो फिल्मों विकसित करने के लिए 4-5 दिन और उसके बाद 1-4 दिन लगते हैं। ध्यान रखा जाना चाहिए जहां कई महत्वपूर्ण कदम (प्रोटोकॉल के अवलोकन के लिए चित्रा 1 देखें) कर रहे हैं। सबसे पहले, कोशिकाओं के शेयर के स्वास्थ्य की है (माइकोप्लाज्मा मुक्त, विस्तार के दौरान संगम तक पहुँचने के लिए अनुमति नहीं है, और प्रत्येक बीतने पर trypsin के साथ इलाज) बैच विस्तार चरण के दौरान और अभिकर्मक के समय में 96 अच्छी तरह से प्लेट में। अभिकर्मक जगह (1.5 चरण) लेता है जब कोशिकाओं को समान रूप से वरीयता प्राप्त किया, और 80% मिला हुआ होना चाहिए।
दूसरा, यह मात्रा स्ि्न्ंतरर कम करने के लिए एक स्वचालित तरल निकालने की मशीन का उपयोग करने के लिए अभिकर्मक के दौरान आदर्श हैएर त्रुटियों, इस प्रकार कुओं के बीच बदलाव के गुणांक ("सीवीएस") सीमित। कारण कम मृत मात्रा और शुद्धता के वितरण के लिए बढ़ जाती है एक छोटी मात्रा कैसेट सीमा अभिकर्मक हानि के साथ निकालने की मशीन फिटिंग छोटे संस्करणों के लिए। सोडियम pervanadate, एक पैन टाइरोसीन फॉस्फेट अवरोध करनेवाला, के साथ इलाज के कदम लक्ष्य kinases के फास्फोरिलीकरण स्थिति को बढ़ाने के लिए एक सामान्य प्रोत्साहन के रूप में प्रयोग किया जाता है। इस कदम पर कैल्शियम के शामिल किए जाने की वजह से लंबे समय तक pervanadate उपचार द्वारा हासिल गोलाई लिए सेल नुकसान को रोकने, सेल मैट्रिक्स आसंजन बढ़ जाती है। यह कदम 10 मिनट ऊष्मायन समय के लिए सख्त पालन के साथ किया जाना चाहिए।
सभी का इस्तेमाल किया जा सकता है, 120 केडीए के रूप में के रूप में बड़े पेप्टाइड्स, प्रोटीन डोमेन, या बरकरार प्रोटीन: तीसरा, काइनेज परख खुद के लिए, कई पुनः संयोजक सब्सट्रेट का चयन करते समय विचार कर रहे हैं। एक विशिष्ट फास्फोरिलीकरण साइट में जाना जाता है, तो एक पेप्टाइड सब्सट्रेट सबसे सीधे आगे दृष्टिकोण है, लेकिन पता लगाने के लिए काफी बड़े होने की जरूरत हैएक एसडीएस पृष्ठ जेल पर। इस प्रकार, पेप्टाइड substrates> 25 की एक मेगावाट देने के लिए बैक्टीरिया से जीएसटी से जुड़े हुए हैं और शुद्ध किया जा सकता है। बड़ा प्रोटीन वे संभावना जोड़ रहे हैं और वे सेल में हो सकता है, फिर भी वे फॉस्फोरिलेटेड हो सकता है और परख में संकेत दे सकता है कि अतिरिक्त अवशेष शामिल होंगे खामी के साथ आ जाएगा के रूप में उनके phosphorylatable अवशेषों अवगत कराया कि फायदा है। हमारी प्राथमिकता यह दोनों स्क्रीन से उम्मीदवार kinases के सत्यापन renders के रूप में, विवो में phosphorylated होने के लिए जाना जाता है और एक जैविक घटना को विनियमित करने के लिए जाना जाता है कि एक अवशेषों आसपास के 15-20 अमीनो एसिड से बना एक पेप्टाइड सब्सट्रेट का उपयोग एक स्क्रीन चलाने के लिए है इन विट्रो में और ज्यादा तेजी से विवो में।
पिछले है, प्रोटीन दृष्टिकोण के आदर्श राशि या अच्छी तरह से प्रति एक ग्राम से अधिक है; निश्चित रूप से इस सब्सट्रेट की मेगावाट के साथ बदलता रहता है। अच्छी तरह से प्रति कम प्रोटीन सार्थक हिट उपज कर सकते हैं, लेकिन यह संकेत बढ़ जाती है के रूप में नियम लागू होता है 'और अधिक बेहतर है': हनोईएसई। ढाल जैल सुखाने के दौरान भी अक्सर दरार के रूप में मानक, गैर-ढाल जैल सिफारिश कर रहे हैं। जैल सूखने के बाद, एक गीजर काउंटर के साथ पृष्ठभूमि पर एक रेडियोधर्मी संकेत का पता लगाने परख की सफलता का एक उत्कृष्ट संकेत देता है।
स्क्रीन विट्रो में है और जटिलता के अतिरिक्त स्तर विवो में मौजूद हैं, एक दिया सब्सट्रेट के लिए एक उम्मीदवार काइनेज (एस) की कोशिकाओं में मान्य किया जाना चाहिए। विशेष रूप से, स्क्रीन अभी तक एक ही प्रकार की कोशिका में या सब्सट्रेट के रूप में एक ही subcellular डिब्बे में व्यक्त नहीं कर रहा है इन विट्रो में सब्सट्रेट phosphorylate करने के लिए जैव रासायनिक क्षमता है कि एक परिवार के सदस्य, पहचान कर सकते हैं। MARK2 और MARK3 दोनों हिट Ser275 पर CRTC2 phosphorylate सकता है कि काइनेज के लिए एक स्क्रीन में थे, जबकि उदाहरण के लिए, केवल MARK2 14 कोशिकाओं में सब्सट्रेट के साथ एक जटिल गठन किया था। एक उम्मीदवार काइनेज की शारीरिक प्रासंगिकता पुष्टि करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि अतिरिक्त प्रयोगों की एक श्रृंखला निम्न हैं। देवदारअनुसूचित जनजाति, उम्मीदवार काइनेज के Coexpression निम्नलिखित एसडीएस पृष्ठ पर सब्सट्रेट की गतिशीलता पारियों एक पुष्टिकरण नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है। उचित नियंत्रण एक catalytically निष्क्रिय काइनेज के ऐसे cotransfection विशिष्टता की पुष्टि कर सकते हैं। दूसरा, सब्सट्रेट एक catalytically निष्क्रिय काइनेज wildtype की उपस्थिति में सब्सट्रेट में फॉस्फेट के समावेश पुष्टि करने के लिए 32 पी orthophosphate साथ incubated और नहीं दिया गया है कि सेल के अर्क से immunoprecipitated जा सकता है। तीसरा, एक phosphospecific एंटीबॉडी phosphoacceptor अनुक्रम के खिलाफ उत्पन्न (अगर जाना जाता है) और काइनेज overexpressed है जब सब्सट्रेट फास्फोरिलीकरण में वृद्धि की पुष्टि करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। लक्ष्य साइट पर एक गैर phosphorylatable छाछ ले जाने के एक उत्परिवर्ती सब्सट्रेट का उपयोग एक माध्यमिक स्क्रीन से पहले एक phosphoantibody, बड़ा डोमेन और पूर्ण लंबाई प्रोटीन substrates के साथ एक विशेष रूप से महत्वपूर्ण नियंत्रण की पीढ़ी के लिए विशिष्टता की पुष्टि कर सकते हैं। भेषज निषेध एक उम्मीदवार को बाधित करने के लिए दृष्टिकोणतारीख काइनेज भी इस्तेमाल किया जा सकता है, फिर भी सावधानी संबंधित kinases के निषेध के रूप में प्रयोग किया जाना चाहिए एक underappreciated वास्तविकता है। पिछले है, किया जा सकता है कोशिकाओं में उम्मीदवार काइनेज (एस) के मुंह बंद करने का पीछा किया और पश्चिमी सोख्ता एक phosphospecific एंटीबॉडी के साथ लक्ष्य साइट फास्फोरिलीकरण के नुकसान पर नजर रखने के लिए आरएनएआई की मध्यस्थता।
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Acknowledgments
इस काम NSERC अनुदान द्वारा समर्थित किया गया 386634. हम उपयोगी विचार विमर्श के लिए Screaton लैब के सदस्यों को धन्यवाद देना चाहूंगा।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lysis buffer | Made in house | See Protocol step 1.1 | |
| 10x kinase buffer | Made in house | See Protocol step 1.2 | |
| 10x M-ATP | Made in house | See Protocol step 1.3 | |
| Human kinase plasmids | Orfeome, Invitrogen, Origene | GST-tagged in house | |
| 96 well plates | Fisher Scientific | CS003595 | |
| 293T cells | ATCC | CRL-11268 | |
| DMEM | Fisher Scientific | SH3002201 | supplement with 100 U/ml penicillin, 100 μg/ml streptomycin, 10% fetal calf serum. |
| CO2 incubator | Sanyo | MCO-17AIC | |
| 15 cm cell culture dishes | Fisher Scientific | 877224 | |
| Reduced serum medium | Invitrogen | 22600-050 | |
| Lipid-based transfection reagent | Invitrogen | 11668-019 | |
| Automated liquid dispenser | Thermo Scientific | 5840300 | |
| Small cassette attachment | Thermo Scientific | 24073295 | |
| Standard cassette attachment | Thermo Scientific | 14072670 | |
| 4 mM pervanadate | Made in house | See Protocol step 3.1 | |
| 0.25 M CaCl2 | Made in house | ||
| Multichannel pipette (20-200 μl) | Labnet | p4812-200 | |
| Multichannel pipette (1-10 μl) | Thermo Scientific | 4661040 | |
| V-bottom 6-well plates | Evergreen Scientific | 290-8116-01V | |
| Glutathione coated 96-well plates | Fisher Scientific | PI-15240 | |
| Hybridization oven | Biostad | 350355 | |
| GST tagged substrate | Made in house | ||
| Myelin Basic Protein (MBP) | Sigma | M1891 | |
| Repeater pipette (1 ml) | Eppendorf | 22266209 | |
| 32P gamma-ATP | Perkin Elmer | BLU502Z500UC | |
| 2x SDS lysis buffer (100 ml) | Made in house | See Protocol step 1.4 | |
| 26-well precast TGX gels | BioRad | 567-1045 | gel percentage required is dependent on the molecular weight of the substrate of interest |
| Coomassie stain | Made in house | 0.1% Coomassie R250, 10% acetic acid, 40% methanol | |
| Coomassie destain | Made in house | 10% acetic acid, 20% methanol | |
| Labeled gel containers | Made in house | Used plastic lids from empty tip boxes, just big enough to contain one gel | |
| Whatman filter paper | Fisher Scientific | 57144 | |
| Cellophane sheets (2) | BioRad | 165-0963 | |
| Gel dryer | Labconco | 4330150 | |
| Double emulsion autoradiography film | VWR | IB1651454 | |
| Film cassette | Fisher Scientific | FBAC-1417 | |
| Intensifying screen | Fisher Scientific | FBIS-1417 | |
| Plate sealing rubber roller | Sigma | R1275 |
References
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