Abstract
Vi har utvecklat en screening plattform för att identifiera särskilda humana proteinkinaser för fosforylerade substrat som kan användas för att belysa nya signaltransduktionsvägar. Vårt tillvägagångssätt har användningen av ett bibliotek av renade GST-märkt humant proteinkinaser och ett rekombinant proteinsubstrat av intresse. Vi har använt denna teknik för att identifiera MAP / mikrotubul affinitetsreglerande kinas 2 (MARK2) som kinaset för en glukosreglerad ställe på CREB-Regulated Transkriptionell samaktivator 2 (CRTC2), ett protein som erfordras för betacellsproliferation, liksom den Axl familj av tyrosinkinaser som regulatorer av cellmetastaser genom fosforylering av adaptorproteinet ELMO. Vi beskriver denna teknik och diskutera hur den kan bidra till att skapa en heltäckande karta över hur celler svarar på stimuli från omgivningen.
Introduction
Proteinposttranslationella modifieringar (PTMs) är väsentliga för intracellulär kommunikation. Kanske bäst studerade av alla PTMs är fosforylering, katalyseras av proteinkinaser, som reglerar en myriad av proteinfunktioner, inklusive deras biokemisk aktivitet, subcellulär lokalisering, gestaltning och stabilitet. Identifieringen av fosforyleringssäten på målproteiner kan åstadkommas genom tryptisk fosfopeptidmappning eller genom nu standardiserade proteomik tekniker med användning av prover berikade för fosforylerade peptider 1,2. Medan tre fjärdedelar av den uttryckta proteomet förväntas fosforyleras 3 och en identifierad 200.000 fosforyleringssäten 5, med uppskattningar upp till 1 miljon 6, många av dessa har ingen tilldelad biologi, signalväg eller proteinkinas.
Medan identifiering av fosforylerade platser är relativt enkelt, en jämförelsevis större utmaning är attidentifiera besläktade kinas (s) som riktar sig mot dessa platser, en process som vi kallar kartläggning kinas: substratpar. Flera metoder för att identifiera kinas: substratpar har beskrivits, antingen börjar med ett kinas av intresse och letar efter sina substrat eller starta med ett substrat av intresse och försöka hitta en modifierande kinas experimentellt 7-11 eller beräknings 12. För att identifiera kinaser för en känd fosforylerat substrat, kan bioinformatik användas för att identifiera proteiner som innehåller en kort konserverad sekvens av aminosyror som flankerar den fosforylerade resten (konsensus plats), samt att identifiera kinaser som bildar ett utfällningsbart komplex med substratet. Men dessa metoder är tidskrävande och ofta inte uppfyller med framgång.
Vi utvecklade ett systematiskt funktionellt synsätt för att snabbt identifiera kinaser som kan fosforylerar ett givet substrat 13. Analys skärm ger utmärkt specifikhet, med mycket tydliga val för potentiella besläktade kinaser. Med tanke på den centrala roll fosforylering biologiska signalering, är skärmen användas för upptäckt i så gott som alla cellsignalvägar 14-16. Skärmen innefattar att genom en storskalig kinasanalys med ett bibliotek av humana proteinkinaser. Kinas har märkts med bakteriellt glutation-S-transferas (GST) protein och renas från cellextrakt däggdjurs, vilket betyder att de rekombinanta enzymerna - till skillnad från de som framställts från bakterier - alstras i närvaro av de uppströms proteinkinaser ofta krävs för rekombinanta enzymerna ha aktivitet in vitro. Faktum medan serin, treonin och tyrosin-kinasaktivitet som erfordras för nedströms-kinasaktivering är närvarande i jäst 10, kodar jästgenomet 122 proteinkinaser, vilket tyder på att däggdjurs kinome, med över 500 gener 17, har blivit avsevärt mer komplex för att Regulate processerna är unika för högre ordningens organismer. Dessutom kan effekten av olika stimuli som är relevanta för cellbiologi och mänskliga sjukdomar (såsom små molekyler, tillväxtfaktorer, hormoner, etc.) användas till 14,15 modulerar kinasaktivitet i ett lämpligt sammanhang.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Framställning av reagenser, tallrikar, och celler
- Gör 500 ml lysbuffert: 25 mM Tris pH 7,5, 150 mM NaCI, 50 mM NaF, 0,5 mM EDTA, pH 8,0, 0,5% TritonX-100, 5 mM beta-glycerofosfat, 5% glycerol. Förvaras vid 4 ° C. Omedelbart före användning, tillsätt 1 mM ditiotreitol (DTT), 1 mM fenylmetylsulfonylfluorid (PMSF) och 1 mM natriumvanadat. Efter detta steg är PMSF krävs inte i några sköljbuffert.
- Gör 20 ml 10x kinasbuffert: 200 mM Tris pH 7,5, 50 mM beta-glycerofosfat (FW 216), 2 mM natrium vanadat. Delprov i 1 ml-rör och förvaras vid -20 ° C. Omedelbart före användning, tillsätt 5 mM DTT.
- Gör 20 ml 10x M-ATP-buffert: 300 pM adenosintrifosfat (ATP), 66 mM MgCl2, 33 mM MnCb 2. Alikvot i 1 ml-rör och förvaras vid -20 ° C.
- Gör 100 ml 2x natriumdodecylsulfat (SDS) lysbuffert: 1,5 g Tris-bas, 20 ml glycerol, 30 ml H2O Lös upp och justera pH till 6,8 med HCl. Lägg 40ml 10% SDS, justera volymen till 100 ml. Lägg 25 mg bromfenolblått.
- Spot 4 il 25 ng / l däggdjurs expressionsplasmid som kodar en GST-kinas 14 per brunn i uppsättningar av 96-brunnsplattor och etikettplattor därefter. Seal och fryst plattor vid -20 ° C fram till användning.
- 1-2 dagar före transfektion, kultur HEK293T-celler i komplett Dulbeccos modifierade Eagles medium (DMEM) + 10% fetalt bovint serum (FBS) och antibiotika i en 37 ° C inkubator kompletterat med CO 2 (slutlig 5%). Passage med trypsin och inte låta beståndet att bli> 80% sammanflytande under expansion. Minst 6 x 10 7 celler erfordras för skärmen (ca 3 x 15 cm rätter av HEK293T celler vid 80% konfluens).
2. Transfektion
Anm: Se Figur 1 för ett flödesschema över hela protokollet.
- Om plattor innehållande kinas plasmider har frysts, tina vid rumstemperatur ennd centrifugera vid 1900 xg under 3 min för att samla all fukt i botten av brunnarna.
- Blanda 8,6 ml reducerad serummedium (t.ex. OPTI-MEM) med 312,7 il lipidbaserat transfektionsreagens. Låt stå i 5 minuter.
- Tillsätt 10 pl av reducerat serummedium till varje brunn med användning av en automatiserad vätske flaska försedd med en liten volym kassett.
- Lägg 10 | il per brunn av den reducerade serummedium / transfektion reagensblandning från steg 2,2 med användning av en automatiserad vätske flaska försedd med en liten volym kassett. Låt sitta i 20 till 45 minuter.
- Resuspendera 293T-celler vid 7,5 x 10 5 celler / ml i 80 ml fullständigt DMEM. Tillsätt 100 ni cellsuspension (dvs. 7,5 x 10 4 celler) per brunn med användning av en automatiserad vätske flaska försedd med en standardvolym kassett.
- Kontrollera brunnar under mikroskop för likformig cellfördelning och återgå till inkubatorn under 24 h.
3. GST-kinas Pulldown
- Gör fresh: 4 mM pervanadat lösning genom blandning av 60 pl av 0,2 M natrium vanadat med 540 ^ il H2O I ett andra rör blanda 2,7 | il av 30% väteperoxid och 1,4 ml PBS. Lägg de två lösningarna tillsammans och låt stå i 15 minuter före användning.
- Med hjälp av en flerkanalspipett (använd inte en automatisk flytande dispenser som det skapar för mycket turbulens i brunnen) fördela 2 il 0,25 M CaCl2 i varje brunn, följt av 2,5 ìl av pervanadat framställd i steg 3.1. Inkubera varje platta vid 37 ° C under 10 minuter och placera sedan på is.
- Förbered 35 ml lysbuffert genom tillsats DTT, PMSF och natriumvanadat som anges i avsnitt 1 (Framställning av reagenser).
- Hålla plattor på is, ta bort mediet från varje brunn med en vakuumsug. Omedelbart till 50 pl / brunn av iskall lysbuffert användning av en automatiserad vätske flaska försedd med en standardkassett. Låt sitta 30 minuter på is för att lysa (tillval: kan stanna här om det behövs genom att försegla plate och lagring vid -80 ° C. För att fortsätta, tina plattorna på is).
- Spin plattorna vid 1900 xg under 3 min vid 4 ° C.
- Skrapa celler från varje brunn med en flerkanalig pipett och överföra allt innehåll på lämpligt sätt märkt V-botten 96-hålsplattor. Spin plattorna vid 1900 xg under 10 min vid 4 ° C.
- Under spinn, fyll glutation belagda plattor (en för varje 96-brunnsplatta) med 100 | il / brunn av iskall lysbuffert (utan PMSF) såsom en sköljning. Håll plattor på is.
- Ta bort V-botten plattor från centrifugen. En i taget, invertera glutation plattorna över ett handfat att skaka ut lysbufferten och skamfläck på en pappershandduk. Överför lysbuffert från V-botten plattor till glutation plattorna genom att luta plattan och med hjälp av en flerkanalspipett, var noga med att inte störa pelleten i botten. Täckplåtar och lämna på is under minst 2 timmar för att binda.
- Nära slutet av 2 timmar bindningssteget, förbereda en radioaktivitet arbetsstation, säkerställa tHan nödvändiga säkerhetsåtgärder finns på plats för radioaktivt arbete. Ställ hybridiseringsugn till 30 ° C.
- Förbered 200 ml lysbuffert genom att tillsätta DTT och natriumvanadat som anges i avsnitt 1. PMSF krävs inte i detta skede.
- Vänd glutation plattorna över ett handfat att skaka ut lysbufferten och torka på en pappershandduk. Skölj brunnarna 3x med 100 | il lysbuffert (utan PMSF). Låt inte brunnarna sitta torka - förvara dem i skölj tills redo att fortsätta.
- Förbered 55 ml 1x kinasbuffert (KB) genom att späda 10x lager och lägga DTT som anges i avsnitt 1. Skölj plattorna en gång med 50 il 1x KB hjälp av en automatiserad vätskeframmatare utrustad med en standardvolym kassett. Lämna 1x KB i brunnar tills lösning A är klar:
- Bered lösning A genom att tillsätta 500 till 530 | j, g av substratet av intresse, 500 ^ g basiskt myelinprotein (MBP), 2,65 ml 10 x KB, 13,25 ^ il 1 M DTT, och H2O upp till 15,9 ml.
- Bered Lösning B i radioaktivitetsarbetsområdet genom att tillsätta 2,5 ml 10x M-ATP, 500 ^ Ci gamma-32P ATP, och H2O till 10 ml.
- Tillsätt 20 pl av lösning B per brunn med en repeater pipett som hjälper till att blanda grund av utstötningskraft. Täck och inkubera i 30 ° C hybridisering ugn under 30 minuter.
- Efter 30 minuter, överför plattorna tillbaka till is. Tillsätt 50 pl av 2x SDS lysbuffert till varje brunn med hjälp av en flerkanalspipett. Kan fortskrida vid denna punkt till nästa steg, eller försegla plattorna med aluminiumfolie och förvara vid -20 ° C tills praktiskt.
4. springa, Färgning och torkning Gel
Obs: Allt arbete ska utföras på ett DesignA områdeted för radioaktivitet.
- Sätt på hybridiseringsugn och inställd på 85 ° C. Tina plattorna vid rumstemperatur. När ugnen har nått temperatur, överföringsplattor till ugnen och Inkubera i 10 min för att denaturera prover.
- Last 26 brunnar prefabricerade geler med 15 pl av varje reaktion med hjälp av en flerkanalspipett att fylla flera brunnar på en gång. Man måste vara försiktig att alla tips i linje med motsvarande väl innan du lägger prover. Kör gelen vid 150 V. Låt inte spårningsfärgen (blå linje) avrinning av botten av gelén eftersom det innehåller unincorporated ATP.
- Demon geler och avbröt unincorporated ATP (blå linje) med en skalpell eller rak kant eftersom det kommer att överexponera filmerna. Placera gelerna i märkta behållare och täck med Coomassie färgning för 15 minuter.
- Ta bort Coomassie fläcken, kortvarigt geler med vatten och tillsätt avfärgning lösning. Avfärgning gelerna tills proteinerna är tydligt synliga. Ett band för MBP och ett band för substratet börvara synlig för varje prov.
- Att torka gelerna:
- Skär ett stort ark av filterpapper och placera den på tork.
- Blöt en cellofanblad i destillerat vatten tills den är slät och skrynkla gratis, och placera den på toppen av papperet.
- Lägg gelerna ovanpå cellofan ark, vilket gör en anteckning i storleksordningen geler. Blöt en andra cellofan ark och placera ovanpå gelerna.
- Kavla ut alla bubblor (en platta tätningsrulle fungerar bra för detta) för en fin likformig yta. Stäng luckan, slå på vakuum och torka gelema för 3 timmar vid 80 ° C.
- När geler är torra, utsätter dem för XAR-film med hjälp av en skärm för att intensifiera signalen. Linda kassett med plastfolie eller en plastpåse och försegla med tejp för att hålla ut frost. Förvara kassetten vid -80 ° C över natten.
5. Utveckling XAR-filmer
- Följande dag, ta bort kassetten från frysen och låt tina vid rumstemperatur. Utveckla filmen iett mörkrum med användning av en filmprocessor enligt tillverkarens instruktioner.
Obs: Undersök filmer för bevis på kinassubstratparen. En sekund längre exponering kan också vara användbart för att detektera svagare fosforyleringsställen händelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Representativa resultat från en skärm visas i figur 2. 180 kinaser screenades med användning av ett GST-märkta peptidsubstrat motsvarande AA 268-283 från CRTC2 liksom den klassiska kinas analyssubstrat basiskt myelinprotein (MBP). Endast två kinaser, MARK2 och mycket relaterade kinas MARK3 fosforylerade den CRTC2 peptiden. MBP ingår som en intern kontroll i alla analyser, eftersom det innehåller många fosforylerbart rester och löper på 18 kDa, mot botten av gelen. Detta gör det möjligt för en tolkning av specificitet: en del kinas kommer kraftigt fosforylera ett substrat och MBP. Att notera är att brunnarna innehållande enbart GST (dvs inga kinas kontroller) alltid rena några endogena kinasaktivitet, sålunda finns det alltid bakgrunds fosforylering i analysen. Medan detta inte utesluter att fosforyleringen av substratet är verklig, betyder antyder att i in vitro inställning av kinaset kan vara mindre selektiv.Det är särskilt informativt att inkludera flera substrat av olika MW att dra slutsatser om kinassubstratspecificitet.
Figur 1. Flödesschema som visar viktiga steg i protokollet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Exempel på skärmen resultatet. Autoradiografer av en skärm av version 1 av biblioteket (180 humana proteinkinaser) utförs med hjälp av GST-peptidsubstratet motsvarar aa 268-283 av mus CRTC2 (återges från Jansson et al., 2008). MBP är myelinbasprotein anges. Den höga graden av erubstrate urval av närstående kinaser är en funktion på skärmen. Varje bana representerar reaktionsprodukterna från en distinkt kinasanalys. MARK3 (Gel 1) och MARK2 (Gel 16), att de enda kinaser fosforylerar TORC2 268-283 peptid, anges. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Eftersom de ursprungliga publikationer som beskriver tillvägagångssättet 14,15, har det ursprungliga biblioteket 180 GST-kinaser utökats till 420 medlemmar, eller ca 80% av det humana proteinet kinome. Med den utökade biblioteket, protokollet som beskrivs tar 4-5 dagar och sedan 1-4 dagar att utveckla filmer (som anses nödvändigt), vilket skulle kunna förkortas genom användning av phosphorimaging och digital signalförstärkning. Det finns flera viktiga steg där man måste vidtas (se figur 1 för översikt av protokoll). För det första är hälsa lager av celler (mykoplasma fri, aldrig tilläts nå sammanflödet under expansion, och behandlades med trypsin vid varje passage) under satsexpansionsfasen och i de 96 brunnar vid tidpunkten för transfektion. Celler bör vara enhetligt seedade, och 80% sammanflytande när transfektion sker (steg 1,5).
För det andra, är det idealiskt under transfektion att använda ett automatiserat vätske dispenser för att minimera volym transfER-fel, vilket begränsar koefficient variationer ("cvs") mellan brunnar. För små volymer, passar dispensern med en mindre volym kassettgränser reagensförlust till följd av minskade döda volymer och ökar utdelnings noggrannhet. Behandlingssteget med natrium pervanadat, en pan tyrosinfosfatas-inhibitor, användes som en allmän stimulans för att öka fosforylering status rikt kinaser. Införande av kalcium vid detta steg ökar cellmatris adhesion, förebygga cellförlust på grund av avrundning framkallas av långvarig pervanadat behandling. Detta steg bör göras med strikt iakttagande 10 minuters inkubationstid.
För det tredje, för kinasanalysen själv, det finns flera faktorer vid valet av rekombinanta substratet: peptider, proteindomäner, eller intakta proteiner så stora som 120 kDa kan alla användas. Om en specifik fosforyleringssäte är känd, är ett peptidsubstrat den mest rättfram metod, men måste vara tillräckligt stor för att upptäckapå en SDS-PAGE-gel. Sålunda kan peptidsubstrat fuseras till GST och renades från bakterier för att ge en molekylvikt av> 25. Större proteiner har den fördelen att de sannolikt viks och deras fosforylerbara rester exponeras som de skulle vara i cellen, men kommer med nackdelen att de kommer att omfatta ytterligare rester som kan vara fosforylerat och ger signal i analysen. Vår inställning är att köra en skärm med hjälp av ett peptidsubstrat som består av 15-20 aminosyror som omger en rest som är känd för att fosforyleras in vivo och är känd för att reglera en biologisk händelse, eftersom det gör validering av kandidat kinaser från skärmen både in vitro och in vivo mycket snabbare.
Sist idealt mängden protein ansatser eller överstiger 1 pg per brunn; detta naturligtvis varierar med molekylvikt av substratet. Mindre protein per brunn kan ge meningsfulla hits, men "mer är bättre" regeln eftersom det ökar signal: noiSE. Standard är icke-gradientgeler rekommenderas som gradientgeler spricker alltför ofta under torkningen. Efter torkning av geler, detektering av en radioaktiv signal över bakgrund med en geigermätare ger en utmärkt indikation på framgång av analysen.
Eftersom skärmen är in vitro och ytterligare nivåer av komplexitet existerar in vivo måste en kandidat-kinas (er) för ett givet substrat valideras i celler. Specifikt kan skärmen identifiera en familjemedlem som har den biokemiska kapacitet att fosforylera substratet in vitro, men uttrycks inte i samma celltyp eller i samma subcellulär avdelning som substratet. Till exempel, medan MARK2 och MARK3 var båda träffar i en skärm för kinas som kan fosforylera CRTC2 på Ser275, bara MARK2 bildade ett komplex med underlaget i celler 14. Följande är en rad ytterligare experiment som kan användas för att bekräfta den fysiologiska betydelsen av en kandidat kinas. First, rörlighetsskiftningar av substratet på SDS-PAGE efter samuttryck av kandidat kinaset kan användas som en bekräftelse kontroll. Lämpliga kontroller såsom samtransfektionsexperiment av en katalytiskt inaktiv kinas kan bekräfta specificiteten. För det andra, kan substratet immunoprecipiteras från cellextrakt som har inkuberats med 32 P-ortofosfat att bekräfta inkorporeringen av fosfat i substratet i närvaro av vildtyp och inte en katalytiskt inaktiv kinas. För det tredje kan en fosfospecifik antikropp genereras mot phosphoacceptor sekvensen (om det är känt) och används för att bekräfta en ökning av substratfosforylering när kinas är överuttryckt. En sekundär screening med användning av en mutant substrat som bär en icke-fosforylerbara rest vid målstället kan bekräfta specificiteten före generering av en phosphoantibody, en särskilt viktig kontroll med större domän och fullängds proteinsubstrat. Farmakologisk hämning metoder för att hämma en candidatum kinas kan också användas, men försiktighet måste iakttas som hämning av relaterade kinaser är en underskattad verklighet. Senast, RNAi-medierad tysta kandidat kinas (er) i celler följde och western blotting för att övervaka förlust av målplatsen fosforylering med en fosfospecifik antikropp kan utföras.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av NSERC bidrag 386634. Vi vill tacka medlemmarna i Screaton Lab för bra diskussioner.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lysis buffer | Made in house | See Protocol step 1.1 | |
| 10x kinase buffer | Made in house | See Protocol step 1.2 | |
| 10x M-ATP | Made in house | See Protocol step 1.3 | |
| Human kinase plasmids | Orfeome, Invitrogen, Origene | GST-tagged in house | |
| 96 well plates | Fisher Scientific | CS003595 | |
| 293T cells | ATCC | CRL-11268 | |
| DMEM | Fisher Scientific | SH3002201 | supplement with 100 U/ml penicillin, 100 μg/ml streptomycin, 10% fetal calf serum. |
| CO2 incubator | Sanyo | MCO-17AIC | |
| 15 cm cell culture dishes | Fisher Scientific | 877224 | |
| Reduced serum medium | Invitrogen | 22600-050 | |
| Lipid-based transfection reagent | Invitrogen | 11668-019 | |
| Automated liquid dispenser | Thermo Scientific | 5840300 | |
| Small cassette attachment | Thermo Scientific | 24073295 | |
| Standard cassette attachment | Thermo Scientific | 14072670 | |
| 4 mM pervanadate | Made in house | See Protocol step 3.1 | |
| 0.25 M CaCl2 | Made in house | ||
| Multichannel pipette (20-200 μl) | Labnet | p4812-200 | |
| Multichannel pipette (1-10 μl) | Thermo Scientific | 4661040 | |
| V-bottom 6-well plates | Evergreen Scientific | 290-8116-01V | |
| Glutathione coated 96-well plates | Fisher Scientific | PI-15240 | |
| Hybridization oven | Biostad | 350355 | |
| GST tagged substrate | Made in house | ||
| Myelin Basic Protein (MBP) | Sigma | M1891 | |
| Repeater pipette (1 ml) | Eppendorf | 22266209 | |
| 32P gamma-ATP | Perkin Elmer | BLU502Z500UC | |
| 2x SDS lysis buffer (100 ml) | Made in house | See Protocol step 1.4 | |
| 26-well precast TGX gels | BioRad | 567-1045 | gel percentage required is dependent on the molecular weight of the substrate of interest |
| Coomassie stain | Made in house | 0.1% Coomassie R250, 10% acetic acid, 40% methanol | |
| Coomassie destain | Made in house | 10% acetic acid, 20% methanol | |
| Labeled gel containers | Made in house | Used plastic lids from empty tip boxes, just big enough to contain one gel | |
| Whatman filter paper | Fisher Scientific | 57144 | |
| Cellophane sheets (2) | BioRad | 165-0963 | |
| Gel dryer | Labconco | 4330150 | |
| Double emulsion autoradiography film | VWR | IB1651454 | |
| Film cassette | Fisher Scientific | FBAC-1417 | |
| Intensifying screen | Fisher Scientific | FBIS-1417 | |
| Plate sealing rubber roller | Sigma | R1275 |
References
- Meisenhelder, J., Hunter, T., van der Geer, P. Phosphopeptide mapping and identification of phosphorylation sites. Curr Protoc Mol Biol. 18, Unit 18 19 (2001).
- Doll, S., Burlingame, A. L. Mass spectrometry-based detection and assignment of protein posttranslational modifications. ACS chem. 10, 63-71 (2015).
- Sharma, K., et al. Ultradeep human phosphoproteome reveals a distinct regulatory nature of Tyr and Ser/Thr-based signaling. Cell rep. 8, 1583-1594 (2014).
- Cohen, P. The regulation of protein function by multisite phosphorylation--a 25 year update. Trends Biochem Sci. 25, 596-601 (2000).
- Walsh, C. T. Posttranslation Modification of Proteins: Expanding Nature's Inventory. , 1st edn, Roberts and Company Publishers. (2006).
- Boersema, P. J., et al. In-depth qualitative and quantitative profiling of tyrosine phosphorylation using a combination of phosphopeptide immunoaffinity purification and stable isotope dimethyl labeling. Mol Cell Proteomics. 9, 84-99 (2010).
- Hutti, J. E., et al. A rapid method for determining protein kinase phosphorylation specificity. Nat Methods. 1, 27-29 (2004).
- Johnson, S. A., Hunter, T. Kinomics: methods for deciphering the kinome. Nat Methods. 2, 17-25 (2005).
- Pawson, T., Nash, P. Assembly of cell regulatory systems through protein interaction domains. Science. 300, 445-452 (2003).
- Zhu, H., et al. Analysis of yeast protein kinases using protein chips. Nat Genet. 26, 283-289 (2000).
- Shah, K., Shokat, K. M. A chemical genetic approach for the identification of direct substrates of protein kinases. Methods Mol Biol. 233, 253-271 (2003).
- Zou, L., et al. PKIS: computational identification of protein kinases for experimentally discovered protein phosphorylation sites. BMC bioinform. 14, 247 (2013).
- Varjosalo, M., et al. Application of active and kinase-deficient kinome collection for identification of kinases regulating hedgehog signaling. Cell. 133, 537-548 (2008).
- Jansson, D., et al. Glucose controls CREB activity in islet cells via regulated phosphorylation of TORC2. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 10161-10166 (2008).
- Fu, A., Screaton, R. A. Using kinomics to delineate signaling pathways: control of CRTC2/TORC2 by the AMPK family. Cell Cycle. 7, 3823-3828 (2008).
- Abu-Thuraia, A., et al. Axl phosphorylates elmo scaffold proteins to promote rac activation and cell invasion. Mol Cell Biol. 35, 76-87 (2015).
- Manning, G., Whyte, D. B., Martinez, R., Hunter, T., Sudarsanam, S. The protein kinase complement of the human genome. Science. 298, 1912-1934 (2002).
