Introduction
Brystkreft er blant de vanligste kreftformer som påvirker den kvinnelige befolkningen over hele verden. Over 1,3 millioner tilfeller av brystkreft er rapportert hvert år på verdensbasis 1,2. Selv om tumorcellene har tradisjonelt vært betraktet som biologisk homogent og meget proliferativ, har det blitt tydelig at brystkreft er genetisk og klinisk heterogen. Motstand mot utbredte kreft narkotika er et kjennetegn på avanserte brystkreft, som fører til dødelighet hos de fleste pasienter gjennom sin tilrettelegging av kreft progresjon og avstand metastase tre.
MicroRNAs (mirnas) er en klasse av små RNA-molekyler ca. 22 nukleotider lange som regulerer genuttrykk ved å blokkere mRNA oversettelse eller formidling av mRNA degradering 4. Mer enn 2000 forskjellige mirnas har hittil blitt identifisert hos mennesker, som er knyttet til menneskelige sykdommer 5. Et økende rekke studier have viste at mirnas kan fungere som onkogener og tumorundertrykkere, og er ofte dysregulerte i tumorer 6. mirnas sterkt påvirke alle de primære tumordannelse ved å styre de store regulatorer av cellesyklusprogresjon, begynnende alderdom, apoptose og autophagy, sammen med de av tumorcelle motilitet, invasjon og metastase 7.
Avvikende miRNA uttrykket har også blitt assosiert med kliniske implikasjoner som scene, differensiering, prognose og respons på adjuvant behandling 8. Spesielt økte Mir-146 uttrykk er korrelert med dårlig prognose i lungekreftpasienter 9. En annen studie har vist at mistet ekspresjon av miRNA-let7b er knyttet til ondartede fenotyper og følgelig dårlig overlevelse 6. Forstå typer celler og strukturer som uttrykker mirnas er en viktig del av å forstå mekanikken gjennom hvilke endringer i miRNA uttrykket innflytelse celle ogvev fenotyper 10. Visse mirnas funnet å bli utskilt i stromale celler er tatt av epitelceller og spesielt handle på sine mål. I samme ånd, er MIR-212 og MIR-132 utskilt av stroma og regulere epithelial-stromal interaksjoner som kreves for ductal utvekst under brystkjertelen utvikling 11. Det overordnede målet med denne artikkelen er å forklare en detaljert protokoll for å oppdage miRNA uttrykket i brystkreft vev gjennom miRNA in situ hybridisering. Vi har optimalisert alle forutsetninger for å analysere nivået av miRNA-489 uttrykk i brystkreftpasientprøver. For dette formål er det benyttet en DIG merket låst nukleinsyre (LNA) probe i vårt eksperiment. Noen av nukleotider hadde en LNA modifikasjon, det vil si, en metylenbro som forbinder de to 'oksygenatom og 4' karbonatom i ryggraden ribose som fester nukleotid slik at den forblir "er låst på plass" etter hybridisering. Som et resultat, er det mye vanskeligerefor den hybridiserte komplisert å denaturere 12,13.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne studien ble godkjent av Institutional Review Board av Chonnam National University Hwasun sykehus og University of South Carolina. TMA prøver sammensatt av brystkreft og matchet tilstøtende normale bryst vev ble levert av biobank av Chonnam National University Hwasun Hospital, et medlem av Korea Biobank Network.
1. Løsning Forberedelse
- Forbered en L av DNase og RNase fritt vann. Gjør alle kjemiske løsninger ved hjelp dietylpyrokarbonat (DEPC) behandlet vann. Behandle en liter vann med 500 ul DEPC og inkuberes i 3 timer ved romtemperatur. Autoklaver vann for å inaktivere DEPC.
Forsiktig: Ikke pust DEPC siden det er kjent kreftfremkallende. - Forbered 1x PBS fra 10x PBS bruker DEPC behandlet vann.
- Forbered 20x SSC (oppløse 175,3 g NaCl og 88,2 g natriumcitrat i 800 ml vann, justere pH til 7,0 med noen dråpe 14 N løsning av HCl og justere volumet til en L med water), 4% paraformaldehyd, 95% etanol, 80% etanol under anvendelse av DEPC behandlet vann.
- Tilsett 8 ml trietanolamin og 1,05 ml av HCl i 590 ml DEPC-behandlet vann og tilsett 1,5 ml eddiksyreanhydrid for acetylering.
- Forbered 50 pg / pl proteinase K i buffer (50 mM Tris-HCl, pH 8,0 i DEPC behandlet vann).
- Forbered hybridisering buffer bestående av 500 ul formamid, 250 ul av 20 x SSC, 100 ul av 50 x Denhardts løsning, 12,5 ul av t-RNA, 2,5 ul av sildesperm-DNA, 30 pl av RVC, 0,02 g av blokkerende reagens- og 50 ul av DEPC vann. Forbered frisk.
2. brystvev Seksjoner
- Skjær 5 mikrometer formalinfiksert parafin-embedded seksjoner med mikrotom og bruke delen for å lade lysbilde 14.
Merk: brystvev brukt her ble utarbeidet tidligere fra Korea Biobank Network.
3. Tissue Forberedelse
- Fjern parafin from vevet ved å dyppe objektglass i Coplin jar 2x i frisk xylen i 10 minutter hver, og rehydrere vevet seksjon av 5 min inkubering i avtagende konsentrasjoner av etanol (100%, 95% og 80%) i DDH 2 O. Utfør dette trinnet i en avtrekkshette.
- Dyppes vev i DEPC behandlet vann i 5 min. På dette punktet gjør grensene rundt vev seksjon med hydrofobe barriere penn.
- Fest vevet med 4% PFA i 15 minutter etterfulgt av en vask med PBS.
- Dyppes vev i 0,3% Triton X-100 / PBS i 10 minutter, fulgt av en vask med PBS.
- Inkuber prøven med 50 pg / pl proteinase K-løsning i 15 min ved 37 ° C. Deretter inkuberes vevssnitt med trietanolamin og eddiksyreanhydrid i 5 minutter ved romtemperatur, etterfulgt av en vask med PBS. Ingen PBS vask er nødvendig mellom Proteinase K-behandling og trietanolamin / eddiksyreanhydrid behandling.
4. Hybridisering
- Vask vevet grundig og incubate vevet seksjon med hybridiseringsbuffer for 2 til 3 timer ved værelsestemperatur. Vanligvis 120 ul hybridiseringsbuffer er nok til å dekke vevet delen.
- Fortynnet 5'-DIG merket LNA probe til endelig konsentrasjon på 15:00 i 120 mL hybridisering løsning. Ettersom aksje konsentrasjonen vanligvis er 40 ng / mL, tilsett 3 mL av lager til 120 mL hybridisering buffer og inkuberes blandingen ved 95 ° C i 5 min.
- Inkuber vev seksjon med sonde over natten ved 54 ° C (TM) i et fuktighetskammer. Typisk 120 mL er nok til å dekke en del. Lag fuktighet ved hjelp av to våte papirhåndklær. Den ideelle størrelsen på kammeret er 10 inches av 8 inches.
- Merk: Tm kan være forskjellig for ulike miRNA. 54 ° C er omtale for MIR-489.
5. stringens Wash
- Vask vev med 5x SSC i 7 minutter (etter hybridisering trinnet, RNase frie vilkårene ikke lenger er nødvendig).
- Vask vevet delen viddh 1x SSC i 7 minutter to ganger ved 57 ° C.
- Vask vev seksjon med 0,2 x SSC i 7 minutter ved 57 ° C.
- Vask vev seksjon med 0,2 x SSC i 7 minutter ved romtemperatur.
- Inkuber vev seksjon i PBS i 10 min.
6. Blokkering
- Inkuber vev seksjon med blokkeringsbuffer ved romtemperatur i 1 time i et fuktighetskammer (For at blokkeringsbuffer tilsett 2 ml FBS, 10 ul Tween-20 og 3 ul av BSA i 18 m av PBS. Lagres blokkeringsbuffer ved 4 ° C).
7. primært antistoff Inkubasjon og utvikling
- Fortynn 1: 300 anti-DIG-AP-antistoff i blokkeringsbuffer og inkuber vevet delen med antistoff ved 4 ° C over natten.
- Vask delene med vaskebuffer 3 ganger, for 5 min hver (buffer levert av development kit).
- Utvikle vevet delen med et kommersielt kit for alkalisk fosfatase som produserer CY-tre fluoriserende lys. <li> Vask seksjon med vaskebuffer i 5 min. Flekken seksjon med 100 ul 2,5 ng / mL Hoechst fargestoff i 5 min etterfulgt av en 5 min vask med vaskebuffer.
- Monter delen med montering buffer i henhold til produsentens protokoll. Bruk 15 mL per vev seksjonen og tørk dreven monteringsløsning med vev tørk. Tett lysbilde med klar neglelakk for å hindre lekkasje.
- Observer delen fluorescerende mikroskop hjelp med 10X objektiv så total forstørrelse er 100X.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Human brystkreft vev ble anvendt for å bestemme miRNA-489 uttrykk. Melkekjertler kanalen og epitelceller ble funnet å uttrykke betydelig høyere miRNA-489 nivåer enn ved svulstvev i to pasienter (figur 1A og 1B). Dette viser klart at miRNA-489 uttrykk har gått tapt i svulstvev, tyder svulst undertrykkende aktivitet av miRNA-489. For ytterligere å bekrefte disse resultater, tumorvev og tilstøtende normalt vev fra den samme pasient ble sammenlignet. Som observert i figur 2A og 2B, ble normalt vev funnet å uttrykke mer miRNA-489 enn dens tilstøtende tumorvev. 10 mikrometer i bildene indikerer skala bar. Bilder ble tatt ved hjelp 10X objektiv.
Figur 1: Uttrykk for MIR-489 i normalt brystvev. Begge normale duct struktur og kreftceller vises på samme seksjon. Vev er fra forskjellige brystkreftpasienter. Normal melkekanalen og melkekjertlene uttrykke miRNA-489 mens fraværende i svulstvev. Scale bar = 10 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2:. Uttrykk for MIR-489 i Breast Cancer Patient Pair A vev micro array ble brukt til å studere Mir-489 uttrykk i en brystkreftpasient. En representant pasient par er vist her. Scale bar = 10 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Målet med denne studien var å bestemme nivået av miRNA uttrykket i brystkreft vev ved hjelp av miRNA in situ hybridisering. Det må bemerkes at i dette eksperimentet, ble alle betingelser optimalisert for brystkreft vev. Videre optimalisering kan være nødvendig for andre typer vev. Alle oppløsninger må gjøres med DEPC vann og alle containere som skal brukes skylles med DEPC behandlet vann og deretter autoklavert. Selv små RNase forurensning kan påvirke det endelige utfallet av eksperimentet. Som miRNA er et meget kort sekvens, er det nødvendig å anvende en LNA probe for å lette bedre hybridisering med target. Videre, etter vev fiksering, behandling med RNase-fritt Proteinase K er absolutt nødvendig ellers proteiner kan forstyrre hybridiseringen av proben med den endogene miRNA. I tillegg, før inkubering av vevet delen med sonden, idet sistnevnte må være kokt til 95 ° C for å utfolde seg ethvertsekundære strukturer.
Etter inkubering over natten, er det viktig å vaske med varierende konsentrasjoner av SSC ved den temperatur som er nevnt ovenfor i protokollen for å redusere ikke-spesifikk binding. For utvikling av fluorescens, inkuber vev seksjon med substrat i minst 1 time. Det anbefales å observere seksjonen gjennom inkubasjon slik at overutbygging kan unngås. Sørg for å montere delen med monterings media følger med settet.
Det er en begrensende faktor som man bør ta i betraktning. Hvis målet miRNA uttrykket er lavere i vevet vil det være vanskelig å oppdage sitt uttrykk ved hjelp av denne teknikken. Det er alltid lurt å utføre denne protokollen med en positiv kontroll som U6 så teknikken kan bekreftes og alle reagenser er sikret å være i arbeid, og de er RNase gratis.
Det er mulig å bruke biotin-merket probe i stedet for DIG merket probe i tilfelle av svake tegnal med DIG-merket probe. Signalforsterkning er mulig ved bruk av biotin-avidin-systemet. Avidin har sterk affinitet for biotin. Ved å utnytte denne affinitet, er det mulig å merke biotin sonde med avidin-biotin duplex som er feste med alkalisk fosfatase. Ved hjelp av denne strategien, er det mulig å forsterke signalet for lav rikelig miRNA også.
Feltet av miRNA er raskt voksende, siden mirnas spiller avgjørende roller i viktige cellulære prosesser og er sterkt knyttet til kreftutvikling. Videre kan disse mirnas også anvendes som biomarkør i kreftdiagnose. Flere studier har indikert en sterk sammenheng mellom miRNA uttrykk og kliniske parametere som tumorstadium tyder mulig anvendelse av miRNA uttrykket i kreft prognose. Denne teknikken kan også brukes til ekspresjon miRNA analyse i andre krefttyper. For eksempel ble uttrykk for MIR-182 og MIR-503 analysert i tykktarm kreft pasient vev bruker i situ hybridisering 15.
Tradisjonelle genekspresjonsanalyser kan avdekke miRNA ekspresjonsnivået i vevet, men det kan ikke avsløre det sted der konstruksjonen miRNA blir uttrykt. Ved å bruke denne teknikken, kan man enkelt finne miRNA uttrykket nivå samt plassering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ELF-97 | Life technology | E6604 | |
| 50x Denhard't | Life technology | 750018 | |
| t-RNA | Roche | 109541 | Reconstitute in DEPC water |
| Herring Sperm DNA | Promega | D1815 | |
| Roche Blocking | Roche | 11096176001 | |
| RVC | Fisher | 50-812-650 | Before use spin down it at 16.1 RCF and take supernatant |
| miR-489 probe | Exiqon | 38599-01 | |
| Nuclease free BSA | Roche | 711454 | |
| Primary antibody-anti DIG | Roche | 11093274910 | |
| Diethyl Pyrocarbonate | Sigma | 1609478 |
References
- Shah, N. R., Chen, H. MicroRNAs in pathogenesis of breast cancer: Implications in diagnosis and treatment. World J Clin Oncol. 5, 48-60 (2014).
- Tang, H., et al. miR-185 suppresses tumor proliferation by directly targeting E2F6 and DNMT1 and indirectly upregulating BRCA1 in triple-negative breast cancer. Mol Cancer Ther. 13, 3185-3197 (2014).
- Ye, X. M., et al. Epigenetic silencing of miR-375 induces trastuzumab resistance in HER2-positive breast cancer by targeting IGF1R. BMC Cancer. 14, 134 (2014).
- Oneyama, C., et al. MicroRNA-mediated downregulation of mTOR/FGFR3 controls tumor growth induced by Src-related oncogenic pathways. Oncogene. 30, 3489-3501 (2011).
- McGuire, A., Brown, J. A., Kerin, M. J. Metastatic breast cancer: the potential of miRNA for diagnosis and treatment monitoring. Cancer Metastasis Rev. 34, 145-155 (2015).
- Quesne, J. L., et al. Biological and prognostic associations of miR-205 and let-7b in breast cancer revealed by in situ hybridization analysis of micro-RNA expression in arrays of archival tumour tissue. J Pathol. 227, 306-314 (2012).
- Fernandez, S., et al. miR-340 inhibits tumor cell proliferation and induces apoptosis by targeting multiple negative regulators of p27 in non-small cell lung cancer. Oncogene. 34, 3240-3250 (2015).
- Yu, L., Zhang, J., Guo, X., Li, Z., Zhang, P. MicroRNA-224 upregulation and AKT activation synergistically predict poor prognosis in patients with hepatocellular carcinoma. Cancer Epidemiol. 38, 408-413 (2014).
- Li, J., et al. microRNA-146 up-regulation predicts the prognosis of non-small cell lung cancer by miRNA in situ hybridization. Exp Mol Pathol. 96, 195-199 (2014).
- Kriegel, A. J., Liang, M. MicroRNA in situ hybridization for formalin fixed kidney tissues. J Vis Exp. , e50785 (2013).
- Ucar, A., et al. miR-212 and miR-132 are required for epithelial stromal interactions necessary for mouse mammary gland development. Nat Genet. 42, 1101-1108 (2010).
- Nuovo, G. J. In situ detection of microRNAs in paraffin embedded, formalin fixed tissues and the co-localization of their putative targets. Methods. 52, 307-315 (2010).
- Kierzek, E., et al. The influence of locked nucleic acid residues on the thermodynamic properties of 2'-O-methyl RNA/RNA heteroduplexes. Nucleic Acids Res. 33, 5082-5093 (2005).
- Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Paraffin embedding tissue samples for sectioning. CSH Protoc. 2008, (2008).
- Li, L., et al. Sequential expression of miR-182 and miR-503 cooperatively targets FBXW7, contributing to the malignant transformation of colon adenoma to adenocarcinoma. J Pathol. 234, 488-501 (2014).
