Introduction
Рак молочной железы является одним из наиболее распространенных злокачественных заболеваний, влияющих на женское население по всему земному шару. Более 1,3 миллиона случаев рака молочной железы сообщают каждый год по всему миру 1,2. Хотя опухолевые клетки традиционно считаются биологически гомогенным и высоко пролиферативные, стало очевидным, что рак молочной железы является генетически и клинически неоднородна. Устойчивость к распространенных противоопухолевых препаратов является отличительной чертой на поздних стадиях рака молочной железы, что приводит к смерти в большинстве пациентов через ее облегчения прогрессирования рака и метастазирования расстояния 3.
MicroRNAs (миРНК) представляют собой класс небольших молекул РНК примерно длиной 22 нуклеотидов , которые регулируют экспрессию генов путем блокирования трансляции мРНК или опосредовать деградацию мРНК 4. Более 2000 различных микроРНК до сих пор были идентифицированы у людей, которые связаны с заболеваниями человека 5. Увеличивается массив исследований ВГАе показали , что микроРНК может функционировать в качестве онкогенов и опухолевых супрессоров и часто дизрегуляции в опухолях 6. микроРНК сильно влияет на все первичные онкогенеза, контролируя основные регуляторы клеточного цикла, старении, апоптоза и аутофагии, наряду с таковыми из опухолевых клеток моторики, инвазию и метастазирование 7.
Выражение Аберрантная микроРНК было также связано с клиническими проявлениями , такими как стадия, дифференцировка, прогноза и ответа на адъювантной терапии 8. В частности, повышенная экспрессия микроРНК-146 коррелирует с плохим прогнозом при раке легкого пациентов 9. Другое исследование показало , что потеряли выражение микроРНК-let7b связана с злокачественными фенотипами и, как следствие, плохой выживаемости 6. Понимание типов клеток и структур, которые выражают микроРНК является важной частью понимания механики, через которые изменения в микроРНК выражение влияния клетки иткани фенотипы 10. Некоторые микроРНК найдены секретируется в стромальных клетках попадала в эпителиальных клетках и специфически воздействуют на их цели. В том же ключе, микроРНК-212 и микроРНК-132 секретируется стромы и регулировать эпителиальные-стромальных взаимодействий , необходимых для протоковой выроста в процессе развития молочной железы 11. Основная цель данной работы состоит в объяснении подробный протокол для выявления экспрессии микроРНК в тканях молочной железы с помощью микроРНК гибридизация. Мы оптимизировали все условия для анализа уровней экспрессии микроРНК-489 в образцах рака молочной железы пациента. С этой целью мы использовали DIG маркированы заперта кислоты (LNA) зонд нуклеиновой в нашем эксперименте. Некоторые из нуклеотидов имели модификацию МШУ, то есть, метиленовый мостик, соединяющий 2 'атом кислорода и 4' атом углерода рибозы основной цепи, которая фиксирует нуклеотид таким образом, что он остается "запертой на месте" после того, как гибридизации. В результате, это гораздо сложнеедля гибридизированных комплекс для денатурации 12,13.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Данное исследование было одобрено Институциональным наблюдательным советом из Чоннам больницы Университета Хвасун и Университета Южной Каролины. Образцы TMA, состоящие из рака молочной железы и совпавших соседних нормальных тканей молочной железы были предоставлены Биобанка из университета Чоннам больницы, член Корейской биобанке сети.
1. Получение раствора
- Готовят 1 л ДНКазы и РНКазы свободной воды. Сделать все химические растворы с использованием диэтилпирокарбонатом (DEPC) обработанной воды. Treat 1 л воды с 500 мкл DEPC и инкубируют в течение 3 ч при комнатной температуре. Автоклава водой инактивировать DEPC.
Предостережение: Не вдыхать DEPC, так как известно канцерогеном. - Приготовьте 1х PBS с 10-кратным PBS с использованием DEPC обработанной воды.
- Подготовка 20x SSC (растворять 175,3 г NaCl и 88,2 г цитрата натрия в 800 мл воды, довести рН до 7,0 с несколько капель 14 N раствора HCl и регулировать громкость до 1 л очистER), 4% параформальдегида, 95% этанола, 80% этанола с использованием DEPC очищенной воды.
- Добавить 8 мл триэтаноламина и 1,05 мл HCl в 590 мл ДЭФЦ обработанной воды и добавляют 1,5 мл уксусного ангидрида для ацетилирования.
- Подготовьте 50 мкг / мкл протеиназы К в буфере (50 мМ Трис-HCl, рН 8,0, в DEPC очищенной воды).
- Подготовка буфера гибридизации, состоящий из 500 мкл формамида, 250 мкл 20x SSC, 100 мкл 50х раствора Денхардта, 12,5 мкл т-РНК, 2,5 мкл ДНК спермы сельди, 30 мкл РВК, 0,02 г блокирующими мкл реагента и 50 из DEPC воды. Подготовить свежие.
2. ткани молочной железы Разделы
- Вырезать 5 мкм фиксированных формалином погруженных в парафин секции с микротома и применять раздел для зарядки слайд 14.
Примечание: ткани молочной железы, используемый здесь ранее получали из Кореи биобанке Network.
3. Подготовка ткани
- Удалить парафин сюдам ткани, погружая слайды в Коплин банку 2х в свежей ксилола в течение 10 минут каждый и регидратации срезы ткани на 5 мин инкубирования при уменьшении концентрации этанола (100%, 95% и 80%) в DDH 2 O. Выполните этот шаг в вытяжном шкафу.
- Погружают ткань в DEPC обработанной воды в течение 5 мин. На этом этапе сделать границы вокруг раздела тканей с гидрофобной барьерного пером.
- Закрепить ткань с 4% PFA в течение 15 мин с последующей промывкой ЗФР.
- Погружают ткань в 0,3% Triton X-100 / PBS в течение 10 мин с последующей промывкой PBS.
- Инкубируйте образца с 50 мкг раствора / мкл протеиназы К в течение 15 мин при 37 ° С. Затем инкубировать срезов ткани с триэтаноламина и уксусного ангидрида в течение 5 мин при комнатной температуре, с последующей промывкой ЗФР. Не мыть PBS не требуется между лечением протеиназы К и триэтаноламина обработки / уксусного ангидрида.
4. Гибридизация
- Промыть ткань тщательно и INCUBATE срез ткани с буфером для гибридизации в течение от 2 до 3 ч при комнатной температуре. Обычно 120 мкл буфера для гибридизации достаточно, чтобы покрыть ткань.
- Развести 5'-DIG меченый LNA зонд до конечной концентрации 3 мкМ в 120 мкл раствора для гибридизации. По мере того как концентрация запас обычно составляет 40 нг / мкл, добавляют 3 мкл запаса в 120 мкл буфера для гибридизации и инкубировать смеси при температуре 95 ° С в течение 5 мин.
- Выдержите участок ткани с зондом в течение ночи при 54 ° C (Tm) во влажной камере. Как правило, 120 мкл достаточно, чтобы покрыть одну секцию. Создание влажности с помощью двух влажных бумажных полотенец. Идеальный размер камеры составляет 10 дюймов на 8 дюймов.
- Примечание: Tm может отличаться для различных микроРНК. 54 ° C упоминание для MIR-489.
5. Жесткость Wash
- Промыть ткани с 5x SSC в течение 7 мин (после стадии гибридизации, РНКазы условия больше не требуется).
- Промыть срез ткани остроумиеч 1x SSC в течение 7 мин дважды при 57 ° C.
- Промыть срезы ткани с 0,2 × SSC в течение 7 мин при 57 ° C.
- Промыть срезы ткани с 0,2 × SSC в течение 7 мин при комнатной температуре.
- Инкубировать срезы ткани в PBS в течение 10 мин.
6. Блокирование
- Инкубировать срезы ткани с блокирующим буфером при комнатной температуре в течение 1 ч во влажной камере (Для того, чтобы блокирующий буфер добавляют 2 мл FBS, 10 мкл Tween-20 и 3 мкл БСА в 18 м от PBS. Хранить блокирующем буфере при 4 ° С).
7. Первичные антитела Инкубация и развития
- Разбавляют 1: 300 анти-DIG-AP антитела в блокирующем буфере и инкубировать срезы ткани с антителом при 4 ° С в течение ночи.
- Вымойте разделы с буфером для промывки 3 раза, в течение 5 мин каждый (буфер предоставляется комплект разработки).
- Разработка раздела тканей с помощью коммерческого набора для щелочной фосфатазы, который производит CY-3 флуоресцентный свет. <LI> Промыть участок с буфером для промывки в течение 5 мин. Пятно секция 100 мкл 2,5 нг / мкл Hoechst красителя в течение 5 мин, после чего 5 мин промывкой промывочным буфером.
- Установите секцию с монтажным буфера в соответствии с протоколом производителя. Используйте 15 мкл на срез ткани и вытрите избыточное решение монтажа с тканью салфеткой. Печать слайд с прозрачным лаком для ногтей, чтобы предотвратить утечку.
- Обратите внимание на раздел флуоресцентный микроскоп с помощью с 10-кратным объективом, так это общее увеличение 100X.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ткани молочной железы человек был использован для определения экспрессии микроРНК-489. Были обнаружены молочной железы проток и эпителиальные клетки , чтобы выразить значительно более высокие микроРНК-489 уровней , чем соседние ткани опухоли у двух пациентов (рис 1А и 1В). Это ясно показывает, что экспрессия микроРНК-489 было потеряно в ткани опухоли, что указывает опухолевый подавляющий активность микроРНК-489. Для дальнейшего подтверждения этих результатов, опухолевой ткани и прилегающей нормальной ткани от того же самого пациента были сопоставлены. Как было отмечено на рисунке 2А и 2В, была обнаружена нормальная ткань , чтобы выразить больше микроРНК-489 , чем прилегающей к ней ткани опухоли. 10 мкм в изображениях указывает на масштабную линейку. Изображения были сделаны с использованием 10-кратным объективом.
Рисунок 1: Выражение MIR-489 в нормальной ткани молочной железы. Обе нормальной структуры проток и опухолевые клетки отображаются на той же секции. Ткани из разных больных раком молочной железы. Нормальная молочных желез и протоков молочной железы выразить микроРНК-489 в то время как отсутствующий в опухолевой ткани. Шкала бар = 10 мкм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рис . 2: Выражение MIR-489 в области рака груди Пара пациенту ткани микро массив был использован для изучения экспрессии микроРНК-489 у пациента с раком молочной железы. Один из представителей пары пациент показан здесь. Шкала бар = 10 мкм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Цель данного исследования состояла в том, чтобы определить уровень экспрессии микроРНК в тканях молочной железы с использованием микроРНК гибридизация. Следует отметить, что в этом эксперименте все условия были оптимизированы для ткани рака молочной железы. Дальнейшая оптимизация может потребоваться для других типов тканей. Все решения должны быть сделаны с DEPC водой и все контейнеры, которые будут использоваться следует промыть DEPC обрабатывают водой и затем обрабатывали в автоклаве. Даже незначительное загрязнение РНКазы может помешать окончательному результату эксперимента. Как микроРНК является очень короткой последовательностью, необходимо использовать МШУ зонд, чтобы способствовать лучшей гибридизации с мишенью. Кроме того, после фиксации ткани, лечение с РНКазы без протеиназы К абсолютно необходимо в противном случае белки могут препятствовать гибридизации зонда с эндогенным микроРНК. Кроме того, перед инкубацией срезы ткани с зондом, последний должен быть варят до 95 ° C разворачиваться любойвторичные структуры.
После инкубации в течение ночи, важно, чтобы вымыть с различными концентрациями SSC при температуре указанной выше в протоколе для снижения неспецифического связывания. Для развития флуоресценции, инкубировать срезы ткани с субстратом в течение по крайней мере 1 часа. Желательно соблюдать раздел по всей инкубации таким образом, чтобы переразвитие можно избежать. Обязательно установите раздел с монтажными носителей информации, предоставленных с комплектом.
Существует один ограничивающий фактор, который следует принимать во внимание. Если выражение целевой микроРНК ниже в ткани будет трудно обнаружить свое выражение с помощью этой техники. Всегда желательно, чтобы выполнить этот протокол с положительным контролем, такие как U6 поэтому техника может быть подтверждена и все реагенты гарантированно работать и они являются РНКазы.
Можно использовать биотин меченного зонда вместо DIG меченым зондом в случае слабого знакааль с DIG-меченным зондом. Усиление сигнала возможна с использованием биотин-авидин системы. Авидин имеет сильное сродство к биотин. Пользуясь этим сродства, можно пометить биотином зонд с авидин-биотин дуплекса, который придают с щелочной фосфатазы. Используя эту стратегию, можно усилить сигнал для низкого обильной микроРНК, а также.
Поле микроРНК быстро развивается, так как микроРНК играют важную роль в ключевых клеточных процессов и тесно связаны с развитием рака. Кроме того, эти микроРНК также могут быть использованы в качестве биомаркеров в диагностике рака. Несколько исследований показали сильную корреляцию между экспрессией микроРНК и клинических параметров, таких как стадия опухоли предполагая возможное применение экспрессии микроРНК в прогнозе рака. Этот метод также может быть использован для анализа экспрессии микроРНК в других типах рака. Например, выражение микроРНК-182 и MIR-503 были проанализированы в тканях больных раком толстой кишки с использованием в сиTu гибридизация 15.
Традиционный анализ экспрессии генов может выявить уровень экспрессии микроРНК в ткани, но она не может выявить место, из которого структура выражаясь микроРНК. Используя эту технику, можно легко найти уровень экспрессии микроРНК, а также местоположение.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ELF-97 | Life technology | E6604 | |
| 50x Denhard't | Life technology | 750018 | |
| t-RNA | Roche | 109541 | Reconstitute in DEPC water |
| Herring Sperm DNA | Promega | D1815 | |
| Roche Blocking | Roche | 11096176001 | |
| RVC | Fisher | 50-812-650 | Before use spin down it at 16.1 RCF and take supernatant |
| miR-489 probe | Exiqon | 38599-01 | |
| Nuclease free BSA | Roche | 711454 | |
| Primary antibody-anti DIG | Roche | 11093274910 | |
| Diethyl Pyrocarbonate | Sigma | 1609478 |
References
- Shah, N. R., Chen, H. MicroRNAs in pathogenesis of breast cancer: Implications in diagnosis and treatment. World J Clin Oncol. 5, 48-60 (2014).
- Tang, H., et al. miR-185 suppresses tumor proliferation by directly targeting E2F6 and DNMT1 and indirectly upregulating BRCA1 in triple-negative breast cancer. Mol Cancer Ther. 13, 3185-3197 (2014).
- Ye, X. M., et al. Epigenetic silencing of miR-375 induces trastuzumab resistance in HER2-positive breast cancer by targeting IGF1R. BMC Cancer. 14, 134 (2014).
- Oneyama, C., et al. MicroRNA-mediated downregulation of mTOR/FGFR3 controls tumor growth induced by Src-related oncogenic pathways. Oncogene. 30, 3489-3501 (2011).
- McGuire, A., Brown, J. A., Kerin, M. J. Metastatic breast cancer: the potential of miRNA for diagnosis and treatment monitoring. Cancer Metastasis Rev. 34, 145-155 (2015).
- Quesne, J. L., et al. Biological and prognostic associations of miR-205 and let-7b in breast cancer revealed by in situ hybridization analysis of micro-RNA expression in arrays of archival tumour tissue. J Pathol. 227, 306-314 (2012).
- Fernandez, S., et al. miR-340 inhibits tumor cell proliferation and induces apoptosis by targeting multiple negative regulators of p27 in non-small cell lung cancer. Oncogene. 34, 3240-3250 (2015).
- Yu, L., Zhang, J., Guo, X., Li, Z., Zhang, P. MicroRNA-224 upregulation and AKT activation synergistically predict poor prognosis in patients with hepatocellular carcinoma. Cancer Epidemiol. 38, 408-413 (2014).
- Li, J., et al. microRNA-146 up-regulation predicts the prognosis of non-small cell lung cancer by miRNA in situ hybridization. Exp Mol Pathol. 96, 195-199 (2014).
- Kriegel, A. J., Liang, M. MicroRNA in situ hybridization for formalin fixed kidney tissues. J Vis Exp. , e50785 (2013).
- Ucar, A., et al. miR-212 and miR-132 are required for epithelial stromal interactions necessary for mouse mammary gland development. Nat Genet. 42, 1101-1108 (2010).
- Nuovo, G. J. In situ detection of microRNAs in paraffin embedded, formalin fixed tissues and the co-localization of their putative targets. Methods. 52, 307-315 (2010).
- Kierzek, E., et al. The influence of locked nucleic acid residues on the thermodynamic properties of 2'-O-methyl RNA/RNA heteroduplexes. Nucleic Acids Res. 33, 5082-5093 (2005).
- Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Paraffin embedding tissue samples for sectioning. CSH Protoc. 2008, (2008).
- Li, L., et al. Sequential expression of miR-182 and miR-503 cooperatively targets FBXW7, contributing to the malignant transformation of colon adenoma to adenocarcinoma. J Pathol. 234, 488-501 (2014).
