Introduction
Le cancer du sein est parmi les tumeurs malignes les plus courantes qui touchent la population féminine à travers le monde. Plus de 1,3 millions de cas de cancer du sein sont signalés chaque année dans le monde 1,2. Bien que les cellules tumorales ont été traditionnellement considéré comme biologiquement homogène et hautement prolifératifs, il est devenu évident que le cancer du sein est génétiquement hétérogène et cliniquement. La résistance aux médicaments anti - cancéreux qui prévalent est une caractéristique des cancers du sein avancés, ce qui conduit à la mortalité chez la majorité des patients grâce à la facilitation de la progression du cancer et des métastases 3 minutes.
Les microARN (miARN) sont une classe de petites molécules d' environ 22 nucléotides de long ARN qui régulent l' expression des gènes en bloquant la traduction de l' ARNm ou de médiation ARNm dégradation 4. Plus de 2.000 miARN différents ont jusqu'à présent été identifiés chez l' homme, qui sont liés à des maladies humaines 5. Un tableau croissant d'études VHAe démontré que les miARN peuvent fonctionner comme oncogènes et suppresseurs de tumeurs et sont souvent dérégulée dans les tumeurs 6. miARN incidence fortement tous les tumorigenèse primaires en contrôlant les principaux régulateurs de la progression du cycle cellulaire, de la sénescence, l' apoptose et autophagy, ainsi que ceux de la motilité des cellules tumorales, l' invasion et les métastases 7.
Expression Aberrant miRNA a également été associée à des implications cliniques telles que le stade, la différenciation, le pronostic et la réponse au traitement adjuvant 8. En particulier, l' augmentation de l' expression de miR-146 est corrélée à un mauvais pronostic chez les patients atteints de cancer du poumon 9. Une autre étude a démontré que l' expression perdue de miARN-let7b est liée à des phénotypes malignes et, par conséquent, une faible survie 6. Comprendre les types de cellules et de structures qui expriment miARN est une partie importante de comprendre les mécanismes à travers lesquels des altérations de miRNA influence d'expression cellulaire ettissus phénotypes 10. Certains miARN révélées être sécrétées dans les cellules stromales sont pris en charge par les cellules épithéliales et agissent spécifiquement sur leurs cibles. Dans la même veine, miR-212 et miR-132 sont sécrétées par stroma et régulent les interactions épithéliales-stromal nécessaires à l' excroissance canalaire au cours du développement de la glande mammaire 11. L'objectif global de cet article est d'expliquer un protocole détaillé pour détecter l' expression de miARN dans les tissus du cancer du sein par miRNA hybridation in situ. Nous avons optimisé toutes les conditions pour tester les niveaux d'expression des miARN-489 dans le cancer du sein des échantillons de patients. À cette fin, nous avons utilisé un DIG marqué verrouillé acide (LNA) sonde nucléique dans notre expérience. Certains de ses nucléotides a eu une modification de LNA, qui est un pont méthylène connectant 'atome d'oxygène et 4 du 2 atome de carbone du squelette ribose qui fixe le nucleotide de telle sorte qu'il reste "bloque" après hybridation. Par conséquent, il est beaucoup plus difficilepour le complexe hybride pour dénaturer 12,13.
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Protocol
Cette étude a été approuvée par le comité d'examen institutionnel de l'Hôpital universitaire national Chonnam Hwasun et de l'Université de Caroline du Sud. échantillons TMA composés de cancer du sein et des tissus appariés mammaires normaux adjacents ont été fournis par la Biobanque de l'hôpital Hwasun Chonnam National University, membre de la Biobanque réseau Corée.
1. Préparation de la solution
- Préparer 1 L d'eau libre de DNase et RNase. Faire toutes les solutions chimiques à l'aide de diéthyle (DEPC) de l'eau traitée. Traiter 1 litre d'eau avec 500 ul de DEPC et laisser incuber pendant 3 heures à température ambiante. Autoclave l'eau pour inactiver DEPC.
Attention: Ne pas inhaler DEPC car il est connu cancérogène. - Préparer 1x PBS de 10x PBS en utilisant DEPC eau traitée.
- Préparer 20x SSC (dissoudre 175,3 g de NaCl et 88,2 g de citrate de sodium dans 800 ml d'eau, ajuster le pH à 7,0 avec quelques gouttes de 14 N solution de HCl et ajuster le volume à 1 L avec water), 4% de paraformaldehyde, 95% d'éthanol, 80% d'éthanol en utilisant de l'eau traitée au DEPC.
- Ajouter 8 ml de triéthanolamine et 1,05 ml de HCl dans 590 ml d'eau traitée au DEPC et ajouter 1,5 ml d'anhydride acétique pendant acétylation.
- Préparer 50 ug / ul de proteinase K dans un tampon (50 mM de Tris-HCl, pH 8,0 dans l'eau traitée au DEPC).
- Préparer un tampon d'hybridation composée de 500 pi de formamide, 250 pi de 20x SSC, 100 pi de 50x solution de Denhardt, 12,5 pi de t-ARN, 2,5 pi d'ADN de sperme de hareng, 30 pi de RVC, 0,02 g de réactif de blocage et de 50 pi de l'eau DEPC. Préparer frais.
2. Les sections de tissus du sein
- Couper 5 um sections de paraffine fixés au formol avec microtome et appliquer la section pour charger la diapositive 14.
Remarque: Le tissu mammaire utilisé ici a été préparé précédemment de la Biobanque réseau Corée.
3. Préparation des tissus
- Retirer la paraffine from le tissu en l' immergeant les lames dans Coplin 2x jar dans le xylène frais pendant 10 minutes à chaque fois et réhydrater la section de tissu de 5 min d' incubation à des concentrations décroissantes d'éthanol (100%, 95% et 80%) dans le trou DDH 2 O. Effectuez cette étape dans une hotte.
- Immerger le tissu dans DEPC eau traitée pendant 5 min. À ce stade, faire des limites autour de la section de tissu avec un stylo barrière hydrophobe.
- Fixer le tissu avec 4% de PFA pendant 15 min suivie d'un lavage avec du PBS.
- Immerger le tissu dans 0,3% de Triton X-100 / PBS pendant 10 min suivi d'un lavage avec du PBS.
- Incuber l'échantillon avec une solution / ul Proteinase K 50 ug pendant 15 min à 37 ° C. Puis incuber des coupes de tissu avec de la triéthanolamine et de l'anhydride acétique pendant 5 min à température ambiante, suivie d'un lavage avec du PBS. Pas de lavage PBS est nécessaire entre le traitement Proteinase K et triéthanolamine / acide acétique traitement anhydride.
4. hybridation
- Laver le tissu à fond et incubate la section de tissu avec du tampon d'hybridation pendant 2 à 3 heures à la température ambiante. Typiquement 120 tampon d'hybridation ul est suffisant pour couvrir la section de tissu.
- Diluer 5'-DIG marqué sonde LNA à la concentration finale de 15 heures dans 120 ul solution d'hybridation. Comme la concentration des stocks est habituellement de 40 ng / pl, ajouter 3 pi de stock à un tampon d'hybridation de 120 pi et incuber le mélange à 95 ° C pendant 5 min.
- Incuber section de tissu avec la sonde pendant une nuit à 54 ° C (Tm) dans une chambre humide. Typiquement 120 ul est suffisant pour couvrir une section. Créer l'humidité en utilisant deux serviettes en papier humide. La taille idéale de la chambre est de 10 pouces par 8 pouces.
- Remarque: Tm peut être différent pour différents miARN. 54 ° C est fait mention pour miR-489.
5. Stringency Wash
- Laver le tissu avec 5x SSC pendant 7 min (après l'étape d'hybridation, de RNase conditions libres ne sont plus requis).
- Laver la section de tissu d'esprith 1x SSC pendant 7 min à deux reprises à 57 ° C.
- Laver la section de tissu avec 0,2x SSC pendant 7 minutes à 57 ° C.
- Laver la coupe tissulaire avec du SSC 0,2x pendant 7 minutes à la température ambiante.
- Incuber section de tissu dans du PBS pendant 10 min.
6. Blocage
- Incuber la section de tissu avec un tampon bloquant à la température ambiante pendant 1 h dans une chambre humide (Pour faire un tampon de blocage ajouter 2 ml de FBS, 10 pi de Tween-20 et 3 pi de BSA à 18 m de PBS. Magasin tampon de blocage à 4 ° C).
7. Anticorps primaire d'incubation et le développement
- Diluer 1: 300 d'anticorps anti-DIG-AP dans un tampon de blocage et on incube la section de tissu avec l'anticorps à 4 ° C pendant une nuit.
- Laver les sections avec un tampon de lavage 3 fois, pendant 5 minutes chacun (tampon fourni par le kit de développement).
- Développer la section de tissu avec un kit commercial pour la phosphatase alcaline qui produit CY-3 florescent lumière. <li> Laver la section avec un tampon de lavage pendant 5 min. la section des taches avec 100 ul de 2,5 ng / ul de colorant Hoechst pendant 5 min, suivie d'un lavage de 5 minutes avec du tampon de lavage.
- Monter la section de montage avec un tampon selon le protocole du fabricant. Utilisez 15 pi par section de tissu et essuyez solution excessive de montage avec le tissu essuyez. Sceller la lame avec vernis à ongles transparent pour éviter les fuites.
- Observer le microscope section florescent utilisant avec un grossissement 10X lentille de manière totale est 100X.
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Representative Results
tissu de cancer du sein humain a été utilisé pour déterminer l'expression des miARN-489. Glande mammaire conduit de cellules épithéliales et se sont révélés exprimer significativement plus élevés miARN-489 niveaux que le tissu adjacent à la tumeur chez deux patients (Figure 1A et 1B). Cela démontre clairement que l'expression du miARN-489 a été perdu dans le tissu tumoral, ce qui suggère une tumeur activité suppressive de miARN-489. Pour confirmer ces résultats en outre, un tissu tumoral et d'un tissu normal adjacent provenant du même patient ont été comparés. Comme observé sur la figure 2A et 2B, le tissu normal a été trouvé pour exprimer plus miARN-489 de son tissu tumoral adjacent. 10 pm dans les images indique la barre d'échelle. Les images ont été prises à l'aide de lentilles 10X.
Figure 1: Expression de miR-489 dans le tissu mammaire normalLes deux cellules de la structure de conduit et tumorales normales. Sont affichés sur la même section. Les tissus sont de différents patients atteints de cancer du sein. conduit mammaire normal et glande mammaire expriment miRNA-489 pendant son absence dans le tissu tumoral. Barre d'échelle = 10 pm. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2:. L' expression de miR-489 dans le cancer du sein Paire Patient Un tissu micro réseau a été utilisé pour étudier l' expression de miR-489 chez un patient de cancer du sein. Une paire du patient représentatif est montré ici. Barre d'échelle = 10 pm. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
Le but de cette étude était de déterminer le niveau d'expression de miARN dans les tissus du cancer du sein en utilisant des miARN hybridation in situ. Il convient de noter que dans cette expérience, toutes les conditions sont optimisées pour le tissu du cancer du sein. Une optimisation supplémentaire peut être nécessaire pour d'autres types de tissus. Toutes les solutions doivent être faites avec de l'eau DEPC et tous les conteneurs à utiliser doivent être rincés à l'eau traitée au DEPC et ensuite autoclavé. Même une légère contamination RNase peut interférer avec le résultat final de l'expérience. Comme miARN est une très courte séquence, il est nécessaire d'utiliser une sonde de LNA pour faciliter une meilleure hybridation avec la cible. En outre, après la fixation du tissu, le traitement avec RNase proteinase K est absolument nécessaire, sinon les protéines peuvent interférer avec l'hybridation de la sonde avec l'ARNmi endogène. En outre, avant l'incubation de la section de tissu avec la sonde, celle-ci doit être bouillie à 95 ° C pour déplier toutdes structures secondaires.
Après une nuit d'incubation, il est important de se laver avec des concentrations de SSC variant à la température mentionnée ci-dessus dans le protocole pour réduire la liaison non spécifique. Pour le développement de la fluorescence, la section de tissu incuber avec le substrat pendant au moins 1 h. Il est conseillé d'observer la section tout au long de l'incubation de telle sorte que le surdéveloppement peut être évité. Assurez-vous de monter la section avec les médias de montage fournies avec le kit.
Il y a un facteur limitant que l'on doit prendre en considération. Si la cible miRNA expression est plus faible dans le tissu, il sera difficile de détecter son expression en utilisant cette technique. Il est toujours conseillé d'effectuer ce protocole avec un contrôle positif tel que U6 de sorte que la technique peut être confirmée et tous les réactifs sont assurés de travailler et ils sont RNase.
Il est possible d'utiliser la biotine sonde marquée au lieu de DIG sonde marquée en cas de signe faibleal avec DIG sonde marquée. l'amplification du signal est possible en utilisant le système biotine-avidine. Avidine a une forte affinité pour la biotine. En tirant parti de cette affinité, il est possible de marquer la sonde de biotine avec duplex avidine-biotine qui est attacher avec de la phosphatase alcaline. En utilisant cette stratégie, il est possible d'amplifier le signal pour une faible miRNA abondante ainsi.
Le domaine de miRNA émerge rapidement, depuis miARN jouent un rôle essentiel dans les processus cellulaires clés et sont étroitement liées au développement du cancer. En outre, ces miARN peuvent également être utilisés en tant que biomarqueur pour le diagnostic du cancer. Plusieurs études ont montré une forte corrélation entre l'expression des miARN et des paramètres cliniques tels que le stade tumoral suggérant une éventuelle application de l'expression des miARN dans le pronostic du cancer. Cette technique peut également être utilisée pour l'analyse d'expression de miARN dans d'autres types de cancer. Par exemple, l' expression de miR-182 et miR-503 ont été analysés dans les tissus des patients atteints de cancer du côlon à l' aide de Situ hybridation 15.
Traditionnelle analyse de l'expression du gène peut révéler miRNA niveau d'expression dans les tissus, mais il ne peut pas révéler l'emplacement à partir de laquelle la structure miARN est exprimée. En utilisant cette technique, on peut facilement trouver le niveau d'expression de miARN ainsi que l'emplacement.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ELF-97 | Life technology | E6604 | |
| 50x Denhard't | Life technology | 750018 | |
| t-RNA | Roche | 109541 | Reconstitute in DEPC water |
| Herring Sperm DNA | Promega | D1815 | |
| Roche Blocking | Roche | 11096176001 | |
| RVC | Fisher | 50-812-650 | Before use spin down it at 16.1 RCF and take supernatant |
| miR-489 probe | Exiqon | 38599-01 | |
| Nuclease free BSA | Roche | 711454 | |
| Primary antibody-anti DIG | Roche | 11093274910 | |
| Diethyl Pyrocarbonate | Sigma | 1609478 |
References
- Shah, N. R., Chen, H. MicroRNAs in pathogenesis of breast cancer: Implications in diagnosis and treatment. World J Clin Oncol. 5, 48-60 (2014).
- Tang, H., et al. miR-185 suppresses tumor proliferation by directly targeting E2F6 and DNMT1 and indirectly upregulating BRCA1 in triple-negative breast cancer. Mol Cancer Ther. 13, 3185-3197 (2014).
- Ye, X. M., et al. Epigenetic silencing of miR-375 induces trastuzumab resistance in HER2-positive breast cancer by targeting IGF1R. BMC Cancer. 14, 134 (2014).
- Oneyama, C., et al. MicroRNA-mediated downregulation of mTOR/FGFR3 controls tumor growth induced by Src-related oncogenic pathways. Oncogene. 30, 3489-3501 (2011).
- McGuire, A., Brown, J. A., Kerin, M. J. Metastatic breast cancer: the potential of miRNA for diagnosis and treatment monitoring. Cancer Metastasis Rev. 34, 145-155 (2015).
- Quesne, J. L., et al. Biological and prognostic associations of miR-205 and let-7b in breast cancer revealed by in situ hybridization analysis of micro-RNA expression in arrays of archival tumour tissue. J Pathol. 227, 306-314 (2012).
- Fernandez, S., et al. miR-340 inhibits tumor cell proliferation and induces apoptosis by targeting multiple negative regulators of p27 in non-small cell lung cancer. Oncogene. 34, 3240-3250 (2015).
- Yu, L., Zhang, J., Guo, X., Li, Z., Zhang, P. MicroRNA-224 upregulation and AKT activation synergistically predict poor prognosis in patients with hepatocellular carcinoma. Cancer Epidemiol. 38, 408-413 (2014).
- Li, J., et al. microRNA-146 up-regulation predicts the prognosis of non-small cell lung cancer by miRNA in situ hybridization. Exp Mol Pathol. 96, 195-199 (2014).
- Kriegel, A. J., Liang, M. MicroRNA in situ hybridization for formalin fixed kidney tissues. J Vis Exp. , e50785 (2013).
- Ucar, A., et al. miR-212 and miR-132 are required for epithelial stromal interactions necessary for mouse mammary gland development. Nat Genet. 42, 1101-1108 (2010).
- Nuovo, G. J. In situ detection of microRNAs in paraffin embedded, formalin fixed tissues and the co-localization of their putative targets. Methods. 52, 307-315 (2010).
- Kierzek, E., et al. The influence of locked nucleic acid residues on the thermodynamic properties of 2'-O-methyl RNA/RNA heteroduplexes. Nucleic Acids Res. 33, 5082-5093 (2005).
- Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Paraffin embedding tissue samples for sectioning. CSH Protoc. 2008, (2008).
- Li, L., et al. Sequential expression of miR-182 and miR-503 cooperatively targets FBXW7, contributing to the malignant transformation of colon adenoma to adenocarcinoma. J Pathol. 234, 488-501 (2014).
