Introduction
유방암은 전세계 여성 인구에 영향을 미치는 가장 흔한 악성 종양 중 하나입니다. 유방암의 130 만 이상의 경우는 전 세계적으로 1, 2 매년보고됩니다. 종양 세포 전통적 생물학적 균질 높은 증식으로 간주되었지만, 유방암 유전자 임상 이질적인 것을 분명하게 하였다. 유행 항암제에 대한 내성은 암의 진행과 전이 거리 (3)의 촉진을 통해 대부분의 환자에서 사망에 이르는 고급 유방암의 특징이다.
마이크로 RNA (miRNA가)의 mRNA의 번역을 차단하거나 mRNA의 분해 4 중개하여 유전자 발현을 조절하는 약 22 개의 뉴클레오티드 작은 RNA 분자 클래스이다. 2,000 개 이상의 다른의 miRNAs 지금까지 인간의 질병 (5)에 연결되어 인간에서 발견되었습니다. 연구의 증가 배열은 근래전자는의 miRNAs는 종양 유전자와 종양 억제 기능을 할 수 종종 종양 6 조절 곤란 것을 보여 주었다. miRNAs는 강하게 종양 세포 운동성, 침윤 및 전이 (7)의 것들과 함께, 세포주기 진행, 노화, 세포 사멸 및 자식 작용의 주요 레귤레이터를 제어하여 일차 종양 모두 영향을 미친다.
비정상적인 miRNA의 발현은 또한 무대, 분화, 예후 및 보조 요법 (8)에 대한 응답으로 임상 적 의미와 연결되었습니다. 특히 미르-146의 발현은 폐암 환자 9의 불량한 예후와 관련되어 증가 하였다. 또 다른 연구의 miRNA-let7b의 손실 발현이 결과적으로 가난한 생존 6, 악성 표현형에 연결되어 있음을 보여 주었다. miRNAs의 발현이 세포 구조의 유형을 이해하는 것은 메커니즘을 이해하는데 중요한 부분되는 miRNA의 발현에 영향을 미치는 셀 변경 및조직은 10 표현형. 간질 세포에서 분비되는 것으로 밝혀 특정 miRNAs의 상피 세포에서 찍은 구체적 목표물에 작용한다. 같은 맥락에서 미르-212은 miR-132는 유선 개발 11시 유관 가지에 필요한 상피 세포 - 기질 상호 작용을 기질에 의해 분비와 조절된다. 이 논문의 전반적인 목적은 계내 혼성화에 miRNA를 통해 유방암 조직에서의 miRNA 발현을 검출하는 상세한 프로토콜을 설명하는 것이다. 우리는 유방암 환자 샘플에서의 miRNA-489의 발현 수준을 분석하기 위해 모든 조건을 최적화했다. 이를 위해, 우리는 표시된 DIG는 우리의 실험에서 핵산 (LNA) 프로브를 고정 사용. 그 뉴클레오티드의 일부, 즉,는 LNA 수정 있던 2 '산소 원자 및 4'는 혼성화 후 "의 위치에 고정"상태로 유지되도록 염기를 해결 리보스 골격의 탄소 원자를 연결하는 메틸렌 다리. 그 결과, 훨씬 더 어렵다혼성화 단지는 12, 13를 변성하기 위해.
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Protocol
본 연구는 기관 검토 전남 대학교 화순 병원의 이사회와 사우스 캐롤라이나 대학의 승인을 받았다. 유방암과 일치 인접 정상 유방 조직 구성 TMA 샘플은 전남 대학교 화순 병원, 한국 바이오 뱅크 네트워크의 회원의 바이오 뱅크가 제공되었다.
1. 솔루션 준비
- DNase의와의 RNase 무료 물 1 L를 준비합니다. 디 에틸 피로 카보 (DEPC) 처리 된 물을 사용하는 모든 화학 솔루션을합니다. DEPC 500 μL에 물 1 L를 처리하고, 실온에서 3 시간 동안 배양한다. DEPC을 비활성화하는 물을 압력솥.
주의 :이 발암 물질 알려져 있기 때문에 DEPC를 흡입하지 마십시오. - DEPC 처리 된 물을 사용하여 10 배 PBS에서 1X PBS를 준비합니다.
- , 20 배 SSC (염화나트륨의 175.3 g 및 800 ml의 물에 구연산 나트륨의 88.2 g을 용해 준비의 HCl (14) N 용액 몇 방울 7.0 pH를 조정하고 와트 1 L에 볼륨을 조정ER), 4 % 파라 포름 알데히드, 95 % 에탄올, 80 % 에탄올 DEPC 처리 된 물을 사용.
- 8 트리에탄올 아민 ㎖의 DEPC 처리 된 물 590 ㎖ 중의 염산의 1.05 ML을 추가 및 아세틸 화를 위해 무수 초산 1.5 ml에 추가 할 수 있습니다.
- 버퍼에 50 μg의 / ㎕의 단백질 분해 효소 K를 준비 (50 mM 트리스 - 염산은 DEPC의 pH가 8.0 물 처리).
- 포름 아미드 500 μL, 20 배 SSC 250 μL, 50 배 덴 하르트 용액 100 μL, t-RNA의 12.5 μL, 청어 정자 DNA의 2.5 μL, RVC 30 μL, 차단 시약 50 μl를 0.02 g로 구성된 하이브리드 버퍼를 준비 DEPC 물. 신선한 준비합니다.
2. 유방 조직 섹션
- 마이크로톰으로 5 μm의 포르말린 고정 파라핀 포함 된 부분을 잘라 슬라이드 (14)를 충전 할 수있는 부분을 적용합니다.
참고 : 여기에 사용되는 유방 조직이 한국 바이오 뱅크 네트워크에서 이전에 제조 하였다.
3. 조직 준비
- 이리저리 파라핀을 제거10 분 동안 신선한 크실렌 코 플린 항아리 배에 각각 슬라이드 침지하여 조직에서 m DDH 2 O. 에탄올 (100 %, 95 % 및 80 %)의 농도를 감소시키는 5 분간 배양하여 조직 절편을 재수 흄 후드에서이 단계를 수행합니다.
- DEPC의 조직이 5 분 동안 물을 처리 빠져. 이 시점에서 소수성 장벽 펜으로 조직 섹션 주변에 경계를 확인합니다.
- PBS로 세척 한 다음 15 분 동안 4 % PFA와 조직을 수정합니다.
- PBS로 세척 한 다음 10 분 동안 0.3 % 트리톤 X-100 / PBS에서 조직을 담근다.
- 37 ° C에서 15 분 50 μg의 / μL 테 K 용액으로 샘플을 품어. 그 다음 PBS로 세척 한 다음 실온에서 5 분 동안 아민 및 아세트산 무수물과 조직 절편을 배양한다. 어떤 PBS 세척은 테 K 처리 및 트리에탄올 아민 / 무수 초산 처리 사이에 필요하지 않습니다.
4. 하이브리드
- 철저하게 인큐 조직을 씻으십시오실온에서 2 시간 내지 3에 대한 혼성화 완충액 BATE 조직 절편. 일반적으로 120 ㎕의 혼성화 완충액을 조직 절편을 커버하기에 충분하다.
- 희석 5'-DIG 120 ㎕의 하이브리드 솔루션 오후 3시의 최종 농도 LNA 프로브를 표시. 재고 농도는 통상 40 NG / μL 바와 같이, 120 ㎕의 혼성화 버퍼 스톡 3 μL를 추가 5 분 동안 95 ℃에서 혼합물을 배양한다.
- 습기 챔버에서 54 ° C (TM)에서 프로브 밤새과 조직 섹션을 품어. 일반적으로 120 μl의 한 부분을 커버하기에 충분하다. 이 젖은 종이 타월을 사용하여 습도를 만듭니다. 챔버의 이상적인 크기는 8인치 10 인치입니다.
- 참고 : Tm은 다른 miRNA의 다를 수 있습니다. 54 ° C 미르-489에 대한 언급이다.
5. 엄격도 세척
- 7 분 동안 5 배 SSC와 조직을 씻으 (하이브리드 단계 이후에,의 RNase 무료 조건이 더 이상 필요 없음).
- 조직 섹션 위트을 씻으십시오57 ° C에서 두 번 7 분 시간 1X SSC.
- 57 ° C에서 7 분 동안 0.2 배씩 SSC와 조직 섹션을 씻으십시오.
- 실온에서 7 분 동안 0.2 배씩 SSC와 조직 섹션을 씻으십시오.
- 10 분 동안 PBS에서 조직 섹션을 품어.
6. 차단
- (완충액 PBS의 18m 2 ML의 FBS, 트윈 -20 10 μL 및 BSA 3 μL를 추가 차단 확인하십시오. 스토어 4에서 블로킹 완충액 습한 챔버에서 실온에서 1 시간 동안 블로킹 완충액으로 조직 절편을 부화 기음).
7. 차 항체 배양 및 개발
- 버퍼를 차단 300 항 DIG-AP 항체와 하룻밤 4 ° C에서 항체와 조직 섹션을 품어 : 1 희석.
- 5 분마다 (개발 키트에서 제공하는 버퍼)에 대해, 세척 버퍼로 3 번 섹션을 씻으십시오.
- CY-3 형광 빛을 생성하는 알칼리 포스 파타 아제에 대한 상용 키트와 함께 조직 섹션을 개발한다. <리는> 5 분 동안 세척 버퍼 섹션을 씻으십시오. 세척 완충액으로 5 분 세척 한 다음 5 분 동안 2.5 NG / μL의 Hoechst 염료 100 ㎕와 얼룩 부분.
- 제조 업체의 프로토콜에 따라 버퍼를 장착와 섹션을 탑재합니다. 조직 섹션 당 15 μl를 사용하여 조직과 과도한 장착 솔루션을 닦아 닦아냅니다. 누출 방지하기 위해 명확한 매니큐어와 슬라이드를 밀봉합니다.
- 10X 렌즈 그래서 총 배율 사용하여 섹션 형광 현미경을 관찰 100X입니다.
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Representative Results
인간 유방암 조직의 miRNA-489은 발현을 측정 하였다. 유선 관 상피 세포는 인접한 두 환자에서 종양 조직 (도 1A 및 1B)에 비해 상당히 높은 수준의 miRNA-489를 발현하는 것으로 하였다. 이것은 분명히의 miRNA-489 발현의 miRNA-489 종양 억제 활성을 시사 종양 조직 소실 한 것을 보여준다. 또한 같은 환자에서 이러한 결과, 종양 조직과 인접한 정상 조직을 확인하는 비교 하였다. 도 2a 및도 2b에서 관찰 된 바와 같이, 정상 조직은 인접한 종양 조직보다 더의 miRNA-489을 표현하는 것으로 하였다. 이미지 10 μm의 규모 줄을 나타냅니다. 이미지는 10X 렌즈를 사용하여 수행 하였다.
그림 1 : 정상 유방 조직에서은 miR-489의 발현. 두 정상 덕트 구조 및 종양 세포는 동일한 섹션에 표시됩니다. 조직 상이한 유방암 환자이다. 보통 유방 덕트와 유선 종양 조직 내 존재의 miRNA-489을 표현한다. 스케일 바 = 10 μm의. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 :. 유방암 환자 쌍은 miR-489의 발현 티슈 마이크로 어레이는 유방암 환자에서은 miR-489의 발현을 연구하는 데 사용되었다. 한 대표 환자 쌍은 여기에 표시됩니다. 스케일 바 = 10 μm의. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
이 연구의 목적은 현장에서 miRNA의 혼성화를 사용하여 유방암 조직에서의 miRNA 발현 수준을 결정 하였다. 본 실험에서 모든 조건 유방암 조직에 최적화 된 것을 유의하여야한다. 또한 최적화는 다른 조직 유형에 필요한 될 수 있습니다. 모든 솔루션은 DEPC 물로 만든되어야하며, 모든 컨테이너는 DEPC 처리 수로 세척하고이어서 멸균해야 사용할 수 있습니다. 비록 약간의 오염 된 RNase 실험의 최종 결과를 방해 할 수있다. miRNA는 매우 짧은 시퀀스이기 때문에, 그 타겟과 더 잘 혼성화를 촉진하는 LNA 프로브를 사용하는 것이 필요하다. 또한,의 RNase없는 테 K와 조직을 고정, 치료 후 다른 단백질이 내생의 miRNA와 프로브의 하이브리드을 방해 할 수 있습니다 절대적으로 필요하다. 또한, 프로브를 조직 절편을 배양하기 전에, 후자는 95 비등해야 어떤을 펼쳐 C를 °이차 구조.
밤새 배양 한 결과, 비특이적 결합을 감소시키기 위해 프로토콜 전술 한 온도에서 SSC 다양한 농도로 세척하는 것이 중요하다. 형광의 개발을위한, 적어도 1 시간 동안 기질과 조직 절편을 배양한다. 그 과잉 개발을 회피 할 수 있도록 배양 전반 부분을 관찰하는 것이 바람직하다. 키트와 함께 제공되는 설치 미디어 섹션을 장착해야합니다.
하나의 고려해야 하나의 제한 요소가있다. 타겟의 miRNA 발현이 조직 낮은 경우는이 기술을 사용하여 발현을 검출하기 어려울 것이다. 이 기술을 확인할 수 있으며, 모든 시약이 작동하는 보장하고 자유의 RNase입니다되도록 같은 U6 등의 긍정적 인 컨트롤이 프로토콜을 수행하는 것이 좋습니다.
이는 약한 서명 경우 대신 DIG 표지 된 프로브를 바이오틴 표지 된 프로브를 사용할 수있다DIG와 알은 프로브를 표시. 신호 증폭 비오틴 - 아비딘 시스템을 이용함으로써 가능하다. 아비딘은 비오틴 강한 친 화성을 가지고있다. 이 친 화성을 활용함으로써, 알칼리성 포스파타제와 연결하다, 아비딘 - 비오틴과 양면 비오틴 프로브 태그 할 수있다. 이 전략을 사용함으로써,도 낮은 풍부한 miRNA를위한 신호를 증폭하는 것이 가능하다.
의 miRNAs 키 세포 과정에 중요한 역할을 강하게 암 발생과 연결되어 있기 때문에 miRNA의 분야는 빠르게 부상하고있다. 또한, 이들의 miRNAs는 암 진단에 바이오 마커로 사용될 수있다. 몇몇 연구는 암의 예후에 miRNA의 발현 가능한 응용 프로그램을 제안 종양 단계로 miRNA의 발현과 임상 매개 변수 사이에 강한 상관 관계를 나타내었다. 이 기술은 또한 다른 유형의 암의 miRNA 발현 분석에 사용될 수있다. 예를 들어,은 miR-182은 miR-503의 발현시에 사용하는 대장 암 환자의 조직을 분석 하였다TU 하이브리드 15.
전통적인 유전자 발현 분석은 조직에서의 miRNA 발현 수준을 표시 할 수 있지만, miRNA의 발현되고있는 구조에서의 위치를 밝힐 수있다. 이 기술을 이용하여, 하나 쉽게 위치뿐만 아니라 miRNA의 발현 량을 찾을 수있다.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ELF-97 | Life technology | E6604 | |
| 50x Denhard't | Life technology | 750018 | |
| t-RNA | Roche | 109541 | Reconstitute in DEPC water |
| Herring Sperm DNA | Promega | D1815 | |
| Roche Blocking | Roche | 11096176001 | |
| RVC | Fisher | 50-812-650 | Before use spin down it at 16.1 RCF and take supernatant |
| miR-489 probe | Exiqon | 38599-01 | |
| Nuclease free BSA | Roche | 711454 | |
| Primary antibody-anti DIG | Roche | 11093274910 | |
| Diethyl Pyrocarbonate | Sigma | 1609478 |
References
- Shah, N. R., Chen, H. MicroRNAs in pathogenesis of breast cancer: Implications in diagnosis and treatment. World J Clin Oncol. 5, 48-60 (2014).
- Tang, H., et al. miR-185 suppresses tumor proliferation by directly targeting E2F6 and DNMT1 and indirectly upregulating BRCA1 in triple-negative breast cancer. Mol Cancer Ther. 13, 3185-3197 (2014).
- Ye, X. M., et al. Epigenetic silencing of miR-375 induces trastuzumab resistance in HER2-positive breast cancer by targeting IGF1R. BMC Cancer. 14, 134 (2014).
- Oneyama, C., et al. MicroRNA-mediated downregulation of mTOR/FGFR3 controls tumor growth induced by Src-related oncogenic pathways. Oncogene. 30, 3489-3501 (2011).
- McGuire, A., Brown, J. A., Kerin, M. J. Metastatic breast cancer: the potential of miRNA for diagnosis and treatment monitoring. Cancer Metastasis Rev. 34, 145-155 (2015).
- Quesne, J. L., et al. Biological and prognostic associations of miR-205 and let-7b in breast cancer revealed by in situ hybridization analysis of micro-RNA expression in arrays of archival tumour tissue. J Pathol. 227, 306-314 (2012).
- Fernandez, S., et al. miR-340 inhibits tumor cell proliferation and induces apoptosis by targeting multiple negative regulators of p27 in non-small cell lung cancer. Oncogene. 34, 3240-3250 (2015).
- Yu, L., Zhang, J., Guo, X., Li, Z., Zhang, P. MicroRNA-224 upregulation and AKT activation synergistically predict poor prognosis in patients with hepatocellular carcinoma. Cancer Epidemiol. 38, 408-413 (2014).
- Li, J., et al. microRNA-146 up-regulation predicts the prognosis of non-small cell lung cancer by miRNA in situ hybridization. Exp Mol Pathol. 96, 195-199 (2014).
- Kriegel, A. J., Liang, M. MicroRNA in situ hybridization for formalin fixed kidney tissues. J Vis Exp. , e50785 (2013).
- Ucar, A., et al. miR-212 and miR-132 are required for epithelial stromal interactions necessary for mouse mammary gland development. Nat Genet. 42, 1101-1108 (2010).
- Nuovo, G. J. In situ detection of microRNAs in paraffin embedded, formalin fixed tissues and the co-localization of their putative targets. Methods. 52, 307-315 (2010).
- Kierzek, E., et al. The influence of locked nucleic acid residues on the thermodynamic properties of 2'-O-methyl RNA/RNA heteroduplexes. Nucleic Acids Res. 33, 5082-5093 (2005).
- Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Paraffin embedding tissue samples for sectioning. CSH Protoc. 2008, (2008).
- Li, L., et al. Sequential expression of miR-182 and miR-503 cooperatively targets FBXW7, contributing to the malignant transformation of colon adenoma to adenocarcinoma. J Pathol. 234, 488-501 (2014).
