Introduction
Brustkrebs ist eine der häufigsten bösartigen Tumoren in der ganzen Welt die weibliche Bevölkerung zu beeinflussen. Mehr als 1,3 Millionen Fälle von Brustkrebs werden jedes Jahr weltweit 1,2 berichtet. Obwohl Tumorzellen traditionell als biologisch homogen und hochproliferative angesehen worden sind, hat sich gezeigt, dass Brustkrebs ist genetisch und klinisch heterogen. Der Widerstand gegen vorherrschende Krebsmedikamente ist ein Markenzeichen von fortgeschrittenem Brustkrebs, in der Mehrzahl der Patienten durch die Erleichterung der Tumorprogression und Metastasierung Abstand 3 auf die Mortalität führt.
MicroRNAs (miRNAs) sind eine Klasse von kleinen RNA - Moleküle , etwa 22 Nukleotide lang , die die Genexpression regulieren , indem mRNA - Translation zu blockieren oder zu vermitteln mRNA - Abbau 4. Mehr als 2.000 verschiedene miRNAs sind bisher beim Menschen identifiziert worden, die für die menschliche Krankheiten 5 verbunden sind. Eine wachsende Reihe von Studien have gezeigt , dass miRNAs als Onkogene und Tumorsuppressoren wirken können und in Tumoren 6 häufig dysreguliert. miRNAs stark die gesamte Primär tumorigenesis auswirken , indem die wichtigsten Regulatoren des Zellzyklus zu steuern, Seneszenz, Apoptose und autophagy, zusammen mit denen der Tumorzellbeweglichkeit, Invasion und Metastasierung 7.
Aberrant miRNA - Expression wurde auch mit klinischen Auswirkungen wie Stadium, Differenzierung, Prognose und das Ansprechen auf adjuvante Therapie 8 verbunden. Insbesondere erhöht miR-146 - Expression mit einer schlechten Prognose bei Patienten mit Lungenkrebs 9 korreliert. Eine andere Studie hat gezeigt , dass verloren Expression von miRNA-let7b maligne Phänotypen verbunden ist und folglich schlechte Überleben 6. die Typen von Zellen und Strukturen zu verstehen, dass miRNAs ist ein wichtiger Teil des Verständnisses der Mechanik, durch die Veränderungen in der miRNA-Expression beeinflussen Zelle ausdrücken undGewebe Phänotypen 10. gefunden bestimmte miRNAs in Stromazellen sezerniert werden, werden von Epithelzellen aufgenommen und gezielt auf ihre Ziele handeln. In die gleiche Richtung, miR-212 und miR-132 werden von Stroma und regeln die epithelial-Stroma - Interaktionen für duktale Auswuchs während Brustdrüse Entwicklung 11 erforderlich abgesondert. Das übergeordnete Ziel dieser Arbeit ist es, ein detailliertes Protokoll zu erklären miRNA - Expression in Brustkrebsgewebe durch miRNA in - situ - Hybridisierung zu detektieren. Wir haben alle Bedingungen optimiert, um die Ebenen der miRNA-489-Expression zu untersuchen bei Brustkrebs Patientenproben. Zu diesem Zweck verwendeten wir ein markiertes DIG-Nukleinsäure (LNA) -Sonde in unserem Experiment verriegelt. Einige seiner Nukleotide hatte eine LNA Modifikation, das heißt, eine Methylenbrücke der 2 'Sauerstoffatom und 4' Kohlenstoffatom der Ribose-Backbone verbindet, die das Nukleotid fixiert, so dass sie "eingerastet" bleibt nach der Hybridisierung. Als Ergebnis ist es viel schwierigerfür die hybridisierten Komplexes 12,13 zu denaturieren.
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Protocol
Diese Studie wurde von der Institutional Review Board der Universität Chonnam Hwasun Hospital und University of South Carolina genehmigt. TMA-Proben zusammengesetzt von Brustkrebs und abgestimmt angrenzenden normalen Brustgewebe wurden durch die Biobank der Chonnam National University Hwasun Hospital, ein Mitglied des Korea Biobank-Netzwerk zur Verfügung gestellt.
1. Herstellung der Lösung
- Bereiten Sie 1 l DNase und RNase freies Wasser. Nehmen Sie alle chemischen Lösungen mit Diethylpyrocarbonat (DEPC) behandeltem Wasser. Behandlung 1 l Wasser mit 500 & mgr; l DEPC und Inkubation für 3 Stunden bei Raumtemperatur. Autoklav, das Wasser zu inaktivieren DEPC.
Achtung: DEPC nicht einatmen, da sie krebserregend bekannt ist. - Bereiten Sie 1x PBS aus 10x PBS DEPC behandeltes Wasser verwendet wird.
- Bereiten Sie 20x SSC (lösen 175,3 g NaCl und 88,2 g Natriumcitrat in 800 ml Wasser, den pH-Wert auf 7,0 mit ein paar Tropfen 14 N HCl-Lösung und stellen Sie die Lautstärke auf 1 L mit water), 4% Paraformaldehyd, 95% Ethanol, 80% Ethanol DEPC behandeltes Wasser verwendet wird.
- 8 ml Triethanolamin und 1,05 ml HCl in 590 ml DEPC-behandeltem Wasser und 1,5 ml Essigsäureanhydrid zur Acetylierung.
- Vorbereitung 50 & mgr; g / & mgr; l Proteinase K in Puffer (50 mM Tris-HCl, pH 8,0, in DEPC-behandeltem Wasser).
- Bereiten Hybridisierungspuffer, bestehend aus 500 & mgr; l Formamid, 250 & mgr; l 20x SSC, 100 & mgr; l 50x Denhardt-Lösung, 12,5 & mgr; l t-RNA, 2,5 & mgr; l Heringssperma-DNA, 30 ul RVC, 0,02 g Blockierungsreagenz und 50 & mgr; l DEPC-Wasser. Bereiten Sie frisch.
2. Brustgewebeschnitte
- Schneiden Sie 5 um Formalin-fixierten und in Paraffin eingebetteten Schnitten mit Mikrotom und wenden Sie den Abschnitt Schlitten zu laden 14.
Hinweis: Die hier verwendeten Brustgewebe wurde zuvor aus dem Korea Biobank Netzwerk vorbereitet.
3. Gewebepräparation
- Entfernen Paraffin from das Gewebe durch Dias in Glasküvette 2x in frischem Xylol für jeweils 10 Minuten und Rehydrierung der Gewebeschnitt von 5 min Inkubationen in abnehmenden Konzentrationen von Ethanol (100%, 95% und 80%) in ddH 2 O getaucht Führen Sie diesen Schritt in einem Abzug.
- Tauchen Sie das Gewebe in DEPC Wasser für 5 min behandelt. An dieser Stelle machen Grenzen um Gewebeschnitt mit hydrophoben Barriere Stift.
- Befestigen Sie das Gewebe mit 4% PFA für 15 min durch eine Wäsche mit PBS.
- Eintauchen des Gewebes in 0,3% Triton X-100 / PBS für 10 min durch eine Waschung mit PBS.
- Inkubieren Probe mit 50 & mgr; g / & mgr; l Proteinase K-Lösung für 15 min bei 37 ° C. Dann Gewebeschnitte mit Triethanolamin und Essigsäureanhydrid für 5 min bei Raumtemperatur, gefolgt von einem Waschen mit PBS inkubiert. Kein PBS-Wasch zwischen Proteinase K-Behandlung und Triethanolamin / Essigsäureanhydrid-Behandlung erforderlich.
4. Die Hybridisierung
- Waschen Sie das Gewebe gründlich und incuBeize der Gewebeschnitt mit Hybridisierungspuffer für 2 bis 3 Stunden bei Raumtemperatur. Typischerweise 120 ul Hybridisierungspuffer ist genug, um den Gewebeschnitt zu bedecken.
- Verdünnte 5'-DIG markierten LNA-Sonde zur Endkonzentration von 03.00 in 120 & mgr; l Hybridisierungslösung. Da die Stoffkonzentration für 5 min in der Regel ist 40 ng / ul, fügen Sie 3 ul Lager bis 120 & mgr; l Hybridisierungspuffer und Inkubation Mischung bei 95 ° C.
- Inkubieren Gewebeschnitt mit der Sonde über Nacht bei 54 ° C (Tm) in einer feuchten Kammer. Typischerweise beträgt 120 & mgr; l genug einen Abschnitt abzudecken. Erstellen Sie Feuchtigkeit von zwei feuchten Papiertüchern. Die ideale Größe der Kammer ist 10 Zoll von 8 Zoll.
- Hinweis: Tm kann für verschiedene miRNA unterschiedlich sein. 54 ° C ist die Rede für miR-489.
5. Die Stringenz Wash
- Waschen Sie das Gewebe mit 5 × SSC für 7 min (nach dem Hybridisierungsschritt sind freien Bedingungen RNase nicht mehr benötigt).
- Waschen Sie den Gewebeschnitt Witzh 1x SSC für 7 min zweimal bei 57 ° C.
- Waschen der Gewebeschnitt mit 0,2x SSC für 7 min bei 57 ° C.
- Waschen der Gewebeschnitt mit 0,2x SSC für 7 min bei Raumtemperatur.
- Inkubieren Gewebeschnitt in PBS für 10 min.
6. Sperrung
- Inkubieren Sie die Gewebeschnitt mit 1 Stunde in einer feuchten Kammer Puffer bei Raumtemperatur blockiert (um Puffer 2 ml FBS Blockierung hinzufügen, 10 ul Tween-20 und 3 ul BSA in 18 m von PBS. Speicherpuffer bei 4 blockiert ° C).
7. Primäre Antikörper-Inkubation und Entwicklung
- Verdünne 1: 300 Anti-DIG-AP-Antikörper in Blocking-Puffer und Inkubation über Nacht der Gewebeschnitt mit einem Antikörper bei 4 ° C.
- Waschen Sie die Abschnitte mit Waschpuffer 3-mal für jeweils 5 min (Puffer-Development-Kit zur Verfügung gestellt).
- Entwickeln Sie den Gewebeschnitt mit einem kommerziellen Kit für die alkalische Phosphatase, die CY-3 fluoreszierendem Licht erzeugt. <li> Waschen Sie den Abschnitt mit Waschpuffer für 5 min. Abschnitt Stain mit 100 & mgr; l von 2,5 ng / ul Hoechst-Farbstoff für 5 Minuten, gefolgt von einer 5 min Waschen mit Waschpuffer.
- Montieren Sie den Abschnitt mit Montagepuffer nach dem Protokoll des Herstellers. Verwenden Sie 15 ul pro Gewebeschnitt und wischen Sie übermäßige Montagelösung mit Tuch abwischen. Siegel die Folie mit klarem Nagellack zu verhindern undicht.
- Beachten Sie den Abschnitt fluoreszierendem Mikroskop mit 10fach-Objektiv so Gesamtvergrößerung ist 100X.
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Representative Results
Menschliche Brustkrebsgewebe wurde verwendet, miRNA-489-Expression zu bestimmen. Brustdrüsenkanal und Epithelzellen wurden in zwei Patienten (1A und 1B) signifikant höher miRNA-489 Ebenen als benachbarte Tumorgewebe zu exprimieren gefunden. Dies zeigt deutlich, dass miRNA-489 Expression im Tumorgewebe verloren gegangen ist, Tumor unterdrückende Aktivität von miRNA-489 hindeutet. Weiter zu bestätigen diese Ergebnisse, Tumorgewebe und benachbarten normalen Gewebe desselben Patienten verglichen. Wie in 2A und 2B beobachtet wurde normales Gewebe ergab mehr miRNA-489 als seine benachbarten Tumorgewebe zu exprimieren. 10 & mgr; m in den Bildern zeigt die Maßstabsleiste. Bilder wurden unter Verwendung von 10X-Objektiv aufgenommen.
Abbildung 1: Die Expression von miR-489 in normalem Brustgewebe. Sowohl normale Kanalstruktur und Tumorzellen werden auf demselben Abschnitt angezeigt. Gewebe sind von verschiedenen Brustkrebspatienten. Normale Brustkanal und Brustdrüse exprimieren miRNA-489, während fehlt im Tumorgewebe. Maßstabsbalken = 10 & mgr; m. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2:. Die Expression von miR-489 in Brustkrebs-Patienten - Pair Ein Gewebe wurde Mikro - Array verwendet , miR-489 Expression in einer Brustkrebs-Patienten zu untersuchen. Ein Vertreter Patientenpaar wird hier gezeigt. Maßstabsbalken = 10 & mgr; m. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
Das Ziel dieser Studie war es, die Höhe der miRNA - Expression in Brustkrebsgewebe mit miRNA in - situ - Hybridisierung zu bestimmen. Es ist zu beachten, dass in diesem Experiment sind alle Bedingungen für die Brustkrebsgewebe optimiert. Eine weitere Optimierung könnte für andere Gewebetypen erforderlich. Alle Lösungen müssen mit DEPC Wasser hergestellt werden und alle Behälter verwendet werden, sollten mit DEPC behandeltem Wasser und anschließend autoklaviert gespült werden. Selbst geringe RNase Kontamination kann mit dem endgültigen Ergebnis des Experiments stören. Als miRNA eine sehr kurze Sequenz ist, ist es notwendig, einen LNA-Sonde zu verwenden, besser Hybridisierung mit dem Target zu erleichtern. Weiterhin wird nach Gewebefixierung, Behandlung mit RNase-freiem Proteinase K ist absolut notwendig, ansonsten Proteine mit der Hybridisierung der Sonde mit dem endogenen miRNA stören können. Darüber hinaus, bevor sie mit der Sonde den Gewebeschnitt Inkubation, muss dieser auf 95 gekocht werden ° C entfalten jedeSekundärstrukturen.
über Nacht Nach Inkubation ist es wichtig, mit variierenden Konzentrationen von SSC bei einer Temperatur oberhalb in Protokoll erwähnt zu waschen unspezifische Bindung zu reduzieren. Für die Entwicklung der Fluoreszenz, Gewebeschnitt mit Substrat für mindestens 1 h inkubiert. Es empfiehlt sich, den gesamten Abschnitt der Inkubation zu beobachten, so dass Überentwicklung vermieden werden kann. Achten Sie darauf, den Abschnitt mit den Befestigungs Medien mit dem Kit zur Verfügung gestellt zu montieren.
Es ist ein limitierender Faktor, die man in Betracht ziehen sollte. Wenn Ziel-miRNA-Expression niedriger im Gewebe ist, wird es schwierig sein, seinen Ausdruck mit dieser Technik zu erkennen. Es ist immer ratsam, dieses Protokoll mit einer positiven Kontrolle, wie U6 durchzuführen, um die Technik bestätigt werden kann und alle Reagenzien gewährleistet sind zu arbeiten und sie sind RNase frei.
Es ist möglich, Biotin markierten Sonde anstelle von DIG-markierten Sonde bei schwachen Zeichen zu verwenden,al mit DIG markierten Sonde. Signalverstärkung ist möglich durch Biotin-Avidin-System. Avidin- hat eine starke Affinität für Biotin. Durch die Nutzung dieser Affinität ist es möglich, Biotin-Sonde mit Avidin-Biotin-Duplex zu markieren, die anhängen mit alkalischer Phosphatase ist. Durch die Nutzung dieser Strategie ist es möglich, Signal für niedrige reichlich miRNA als auch zu verstärken.
Das Feld der miRNA wird sich schnell entwickelnden, da miRNAs wichtige Rollen in wichtigen zellulären Prozessen spielen und sind stark mit der Entwicklung von Krebs verbunden. Darüber hinaus können diese miRNAs auch als Biomarker in der Krebsdiagnose verwendet werden. Mehrere Studien haben eine starke Korrelation zwischen miRNA-Expression und klinischen Parametern wie Tumorstadium der Eingabe mögliche Anwendung von miRNA-Expression in Krebsprognose angegeben. Diese Technik kann auch für die miRNA-Expressionsanalyse in anderen Krebsarten eingesetzt werden. Zum Beispiel wird die Expression von miR-182 und miR-503 wurden in Darmkrebspatientengewebe mit in si analysierttu Hybridisierung 15.
Traditionelle Genexpressionsanalyse kann miRNA-Expressionsniveau in Gewebe zeigen, aber es kann nicht die Position zeigen, aus der Struktur miRNA ausgedrückt wird. Durch die Verwendung dieser Technik kann man leicht die miRNA-Expressionsniveau finden sowie Lage.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ELF-97 | Life technology | E6604 | |
| 50x Denhard't | Life technology | 750018 | |
| t-RNA | Roche | 109541 | Reconstitute in DEPC water |
| Herring Sperm DNA | Promega | D1815 | |
| Roche Blocking | Roche | 11096176001 | |
| RVC | Fisher | 50-812-650 | Before use spin down it at 16.1 RCF and take supernatant |
| miR-489 probe | Exiqon | 38599-01 | |
| Nuclease free BSA | Roche | 711454 | |
| Primary antibody-anti DIG | Roche | 11093274910 | |
| Diethyl Pyrocarbonate | Sigma | 1609478 |
References
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