Introduction
स्तन कैंसर दुनिया भर में महिलाओं की जनसंख्या को प्रभावित करने के लिए सबसे आम कैंसर के बीच है। स्तन कैंसर के 13 लाख से अधिक मामलों में हर साल दुनिया भर में 1,2 रिपोर्ट कर रहे हैं। ट्यूमर कोशिकाओं को पारंपरिक रूप से जैविक रूप से समरूप और अत्यधिक proliferative के रूप में माना गया है हालांकि, यह स्पष्ट हो गया है कि स्तन कैंसर के आनुवंशिक रूप से और नैदानिक विषम है। प्रचलित विरोधी दवाओं के लिए प्रतिरोध उन्नत स्तन कैंसर की एक बानगी, कैंसर की प्रगति और दूरी मेटास्टेसिस 3 के अपने सरलीकरण के माध्यम से रोगियों के बहुमत में मृत्यु दर के लिए अग्रणी है।
MicroRNAs (miRNAs) छोटे आरएनए अणुओं लगभग 22 न्यूक्लियोटाइड लंबी है कि mRNA अनुवाद अवरुद्ध या mRNA गिरावट 4 मध्यस्थता द्वारा जीन अभिव्यक्ति को विनियमित के एक वर्ग के हैं। 2,000 से अधिक विभिन्न miRNAs अब तक मनुष्य है, जो मानव रोगों 5 से जुड़े रहे हैं में पहचान की गई है। अध्ययनों की बढ़ती सरणी हवलदारई प्रदर्शन किया है कि miRNAs ओंकोजीन और ट्यूमर शामक के रूप में कार्य कर सकते हैं और अक्सर ट्यूमर 6 में dysregulated रहे हैं। miRNAs दृढ़ता, कोशिका चक्र प्रगति, वार्धक्य, apoptosis और भोजी की प्रमुख नियामकों को नियंत्रित करने से प्राथमिक tumorigenesis के सभी प्रभाव ट्यूमर सेल गतिशीलता, आक्रमण और मेटास्टेसिस 7 में से उन लोगों के साथ।
न्यायपालिका miRNA अभिव्यक्ति भी इस तरह के चरण, भेदभाव, रोग का निदान और सहायक चिकित्सा 8 के जवाब के रूप में नैदानिक प्रभाव के साथ संबद्ध किया गया है। विशेष रूप से, वृद्धि हुई मीर 146 अभिव्यक्ति फेफड़ों के कैंसर के रोगियों 9 में गरीब रोग का निदान के साथ जोड़ा जाता है। एक अन्य अध्ययन में दिखा दिया है कि miRNA-let7b की खोई हुई अभिव्यक्ति घातक phenotypes से जुड़ा हुआ है और इसके परिणामस्वरूप, गरीब अस्तित्व 6। कोशिकाओं और संरचनाओं के प्रकार है कि miRNAs को व्यक्त समझ है यांत्रिकी को समझने का एक महत्वपूर्ण हिस्सा है जिसके माध्यम से miRNA अभिव्यक्ति प्रभाव सेल में परिवर्तन औरऊतक 10 phenotypes। stromal कोशिकाओं में स्रावित हो पाया कुछ miRNAs उपकला कोशिकाओं द्वारा में लिया जाता है और विशेष रूप से अपने लक्ष्य पर काम करते हैं। उसी नस में, मीर 212 और मीर-132 स्ट्रोमा द्वारा स्रावित और स्तन ग्रंथि विकास 11 के दौरान नलीपरक परिणाम के लिए आवश्यक उपकला-stromal बातचीत को विनियमित रहे हैं। इस पत्र के समग्र उद्देश्य सीटू संकरण में miRNA के माध्यम से स्तन कैंसर के ऊतकों में miRNA अभिव्यक्ति का पता लगाने के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल की व्याख्या है। हम स्तन कैंसर के रोगी के नमूने में miRNA-489 अभिव्यक्ति के स्तर की परख के लिए सभी शर्तों अनुकूलित है। यह अंत करने के लिए, हम एक डीआईजी लेबल हमारे प्रयोग में बंद कर दिया न्यूक्लिक एसिड (LNA) से जांच कराने का इस्तेमाल किया। इसकी न्यूक्लियोटाइड में से कुछ, वह यह है कि एक LNA संशोधन किया था एक methylene पुल 2 'ऑक्सीजन परमाणु और 4' राइबोज़ रीढ़ जो न्यूक्लियोटाइड ऐसी है कि यह रहता है संकरण के बाद "जगह में बंद" सुधारों की कार्बन परमाणु जोड़ने। नतीजतन, यह बहुत अधिक मुश्किल हैसंकरित जटिल 12,13 denature करने के लिए।
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Protocol
इस अध्ययन Chonnam राष्ट्रीय विश्वविद्यालय Hwasun अस्पताल के संस्थागत समीक्षा बोर्ड और दक्षिण कैरोलिना विश्वविद्यालय द्वारा अनुमोदित किया गया था। स्तन कैंसर और मिलान आसन्न सामान्य स्तन के ऊतकों से बना टीएमए नमूने Chonnam राष्ट्रीय विश्वविद्यालय Hwasun अस्पताल, कोरिया Biobank नेटवर्क के एक सदस्य के Biobank द्वारा प्रदान किया गया।
1. समाधान तैयार
- DNase और RNase मुक्त पानी का 1 एल तैयार करें। diethylpyrocarbonate (DEPC) उपचारित पानी का उपयोग कर सभी रासायनिक समाधान करते हैं। DEPC के 500 μl के साथ पानी का 1 एल समझो और कमरे के तापमान पर 3 घंटे के लिए सेते हैं। पानी DEPC निष्क्रिय करने के लिए आटोक्लेव।
सावधानी: DEPC साँस लेना नहीं है, क्योंकि यह कैसरजन जाना जाता है। - DEPC इलाज पानी का उपयोग कर 10x पीबीएस से 1x पीबीएस तैयार करें।
- , 20x एसएससी (NaCl के 175.3 जी और 800 मिलीलीटर पानी में सोडियम साइट्रेट का 88.2 ग्राम भंग तैयार एचसीएल के 14 एन समाधान की कुछ गिरावट के साथ 7.0 पीएच को समायोजित करने और वाट के साथ 1 एल मात्रा समायोजितईआर), 4% paraformaldehyde, 95% इथेनॉल, 80% इथेनॉल DEPC इलाज पानी का उपयोग कर।
- triethanolamine के 8 मिलीग्राम और DEPC इलाज पानी की 590 मिलीलीटर में एचसीएल के 1.05 मिलीलीटर जोड़ें और एसिटिलीकरण के लिए एसिटिक एनहाइड्राइड के 1.5 मिलीलीटर जोड़ें।
- बफर में 50 माइक्रोग्राम / μl proteinase कश्मीर तैयार (50 मिमी Tris एचसीएल, DEPC में पीएच 8.0 पानी इलाज)।
- formamide के 500 μl, 20x एसएससी के 250 μl, 50x Denhardt के समाधान के 100 μl, टी-शाही सेना के 12.5 μl, हेरिंग शुक्राणु डीएनए के 2.5 μl, आर वी सी के 30 μl, अवरुद्ध अभिकर्मक और 50 μl की 0.02 ग्राम की रचना संकरण बफर तैयार DEPC पानी की। ताजा तैयार करें।
2. स्तन ऊतक वर्गों
- Microtome के साथ 5 माइक्रोन formalin तय आयल एम्बेडेड वर्गों में कटौती और इस खंड स्लाइड 14 चार्ज करने के लिए लागू होते हैं।
नोट: स्तन यहां इस्तेमाल किया ऊतक कोरिया Biobank नेटवर्क से पहले तैयार किया गया था।
3. ऊतक तैयार
- पैराफिन इधर-उधर हटाये10 मिनट के लिए ताजा xylene में Coplin जार 2x में स्लाइड्स डुबो प्रत्येक द्वारा ऊतक मी और DDH 2 ओ में इथेनॉल (100%, 95% और 80%) की सांद्रता कम में 5 मिनट incubations द्वारा ऊतक अनुभाग rehydrate एक धूआं हुड में इस कदम को पूरा करें।
- विसर्जित कर दिया DEPC में ऊतक 5 मिनट के लिए पानी का इलाज किया। इस बिंदु पर हाइड्रोफोबिक बाधा कलम के साथ ऊतक अनुभाग के आसपास सीमाओं बनाते हैं।
- 15 मिनट पीबीएस के साथ एक धोने के द्वारा पीछा के लिए 4% पीएफए के साथ ऊतक को ठीक करें।
- पीबीएस के साथ एक धोने के द्वारा पीछा 10 मिनट के लिए 0.3% ट्राइटन X-100 / पीबीएस में ऊतक विसर्जित कर दिया।
- 37 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए 50 माइक्रोग्राम / μl proteinase कश्मीर समाधान के साथ नमूना सेते हैं। फिर कमरे के तापमान पर 5 मिनट, पीबीएस के साथ एक धोने के द्वारा पीछा के लिए triethanolamine और एसिटिक एनहाइड्राइड साथ ऊतक वर्गों सेते हैं। कोई पीबीएस धोने proteinase कश्मीर उपचार और triethanolamine / एसिटिक एनहाइड्राइड उपचार के बीच आवश्यक है।
4. संकरण
- ऊतक अच्छी तरह से और incu धोपीटा कमरे के तापमान पर 2 से 3 घंटा के लिए संकरण बफर के साथ ऊतक अनुभाग। आमतौर पर 120 μl संकरण बफर ऊतक अनुभाग को कवर करने के लिए पर्याप्त है।
- पतला 5'-डीआईजी 120 μl संकरण समाधान में 3 बजे के अंतिम एकाग्रता के लिए LNA जांच लेबल। जैसा कि शेयर एकाग्रता आमतौर पर 40 एनजी / μl है, 120 μl संकरण बफर स्टॉक से 3 μl जोड़ें और 5 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर मिश्रण सेते हैं।
- एक नम कक्ष में 54 डिग्री सेल्सियस (टीएम) पर जांच के साथ रात भर ऊतक अनुभाग सेते हैं। आमतौर पर 120 μl एक अनुभाग को कवर करने के लिए पर्याप्त है। दो गीला कागज तौलिए का उपयोग करके आर्द्रता बनाएँ। चैम्बर के आदर्श आकार 8 इंच से 10 इंच है।
- नोट: टीएम अलग miRNA के लिए अलग-अलग हो सकता है। 54 डिग्री सेल्सियस मीर 489 के लिए उल्लेख है।
5. तंगी धो
- 7 मिनट के लिए 5x एसएससी के साथ ऊतक धो (संकरण कदम के बाद, RNase मुक्त शर्तों अब जरूरी नहीं हैं)।
- धो ऊतक अनुभाग बुद्धि57 डिग्री सेल्सियस पर 7 मिनट में दो बार के लिए एच 1x एसएससी।
- 57 डिग्री सेल्सियस पर 7 मिनट के लिए 0.2X एसएससी के साथ ऊतक खंड धो लें।
- कमरे के तापमान पर 7 मिनट के लिए 0.2X एसएससी के साथ ऊतक खंड धो लें।
- 10 मिनट के लिए पीबीएस में ऊतक अनुभाग सेते हैं।
6. अवरुद्ध
- एक नम कक्ष में 1 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर बफर अवरुद्ध (बफर 18 मीटर पीबीएस के 2 मिलीलीटर FBS, बीच -20 के 10 μl और बीएसए के 3 μl जोड़ने अवरुद्ध बनाने के लिए। स्टोर 4 में बफर रोकने के साथ ऊतक अनुभाग सेते सी)।
7. प्राथमिक एंटीबॉडी ऊष्मायन और विकास
- अवरुद्ध बफर में 300 विरोधी डीआईजी एपी एंटीबॉडी और रात में 4 डिग्री सेल्सियस पर एंटीबॉडी के साथ ऊतक अनुभाग सेते: पतला 1।
- धारा 3 बार, 5 मिनट प्रत्येक (डेवलपमेंट किट द्वारा प्रदान बफर) के लिए धोने बफर के साथ धो लें।
- alkaline फॉस्फेट के लिए एक वाणिज्यिक किट कि सीवाई -3 फ्लोरोसेंट प्रकाश का उत्पादन के साथ ऊतक खंड विकास करना। <li> 5 मिनट के लिए धोने बफर के साथ खंड धो लें। धोने बफर के साथ एक 5 मिनट धोने के द्वारा पीछा 5 मिनट के लिए 2.5 एनजी / μl Hoechst डाई के 100 μl के साथ दाग अनुभाग।
- निर्माता प्रोटोकॉल के अनुसार बफर बढ़ते के साथ खंड माउंट। ऊतक अनुभाग प्रति 15 μl का प्रयोग करें और पोंछ ऊतक के साथ अत्यधिक बढ़ते समाधान पोंछ। स्पष्ट नेल पॉलिश लीक को रोकने के साथ स्लाइड सील।
- 10X लेंस तो कुल बढ़ाई के साथ प्रयोग खंड फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप का निरीक्षण 100X है।
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Representative Results
मानव स्तन कैंसर के ऊतकों miRNA-489 अभिव्यक्ति का निर्धारण करने के लिए इस्तेमाल किया गया था। स्तन ग्रंथि वाहिनी और उपकला कोशिकाओं काफी अधिक miRNA-489 दो रोगियों में आसन्न ट्यूमर के ऊतक (चित्रा 1 ए और 1 बी) की तुलना स्तर व्यक्त करने के लिए पाए गए। यह स्पष्ट रूप से दर्शाता है कि miRNA-489 अभिव्यक्ति ट्यूमर के ऊतक में खो गया है, miRNA-489 के ट्यूमर दमनकारी गतिविधि का सुझाव दे। आगे एक ही मरीज से इन परिणामों, ट्यूमर के ऊतक और आसन्न सामान्य ऊतकों की पुष्टि की तुलना में थे। जैसा कि चित्र 2A और 2 बी में मनाया, सामान्य ऊतकों अपनी आसन्न ट्यूमर के ऊतक की तुलना में अधिक miRNA-489 व्यक्त करने के लिए मिला था। छवियों में 10 माइक्रोन पैमाने पर पट्टी इंगित करता है। छवियाँ 10X लेंस का उपयोग करके ले जाया गया।
चित्रा 1: सामान्य स्तन के ऊतकों में मीर 489 की अभिव्यक्ति। दोनों सामान्य वाहिनी संरचना और ट्यूमर कोशिकाओं को एक ही खंड पर प्रदर्शित कर रहे हैं। ऊतकों अलग स्तन कैंसर के रोगियों से हैं। सामान्य स्तन वाहिनी और स्तन ग्रंथि miRNA-489 ट्यूमर के ऊतक में जबकि अनुपस्थित व्यक्त करते हैं। स्केल बार = 10 माइक्रोन। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 2:। स्तन कैंसर के रोगी जोड़ी में मीर 489 की अभिव्यक्ति एक ऊतक सूक्ष्म सरणी एक स्तन कैंसर के रोगी में मीर 489 अभिव्यक्ति का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया था। एक प्रतिनिधि रोगी जोड़ी यहाँ दिखाया गया है। स्केल बार = 10 माइक्रोन। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
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Discussion
इस अध्ययन का लक्ष्य सीटू संकरण में miRNA का उपयोग कर स्तन कैंसर के ऊतकों में miRNA अभिव्यक्ति के स्तर को निर्धारित करने के लिए किया गया था। ऐसा नहीं है कि इस प्रयोग में, सभी परिस्थितियों में स्तन कैंसर के ऊतकों के लिए अनुकूलित किया गया था कि ध्यान दिया जाना चाहिए। इसके अलावा अनुकूलन अन्य प्रकार के ऊतकों के लिए आवश्यक हो सकता है। सभी समाधान DEPC पानी के साथ किया जाना चाहिए और सभी कंटेनरों DEPC इलाज पानी के साथ rinsed होना चाहिए और बाद में autoclaved इस्तेमाल किया जाएगा। यहां तक कि मामूली RNase संदूषण प्रयोग के अंतिम परिणाम के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं। miRNA एक बहुत ही छोटे दृश्य है, यह लक्ष्य के साथ बेहतर संकरण की सुविधा के लिए एक LNA जांच का उपयोग करने के लिए आवश्यक है। इसके अलावा, ऊतक निर्धारण, के साथ RNase मुक्त proteinase कश्मीर उपचार के बाद अन्यथा प्रोटीन अंतर्जात miRNA के साथ जांच के संकरण के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं बिल्कुल जरूरी है। इसके अतिरिक्त, जांच के साथ ऊतक अनुभाग incubating से पहले, बाद 95 को उबला हुआ होना चाहिए सी ° किसी भी प्रकट करनामाध्यमिक संरचनाओं।
रात भर incubating के बाद, यह तापमान प्रोटोकॉल में उपर्युक्त में एसएससी की सांद्रता बदलती अविशिष्ट बाध्यकारी को कम करने के साथ धोने के लिए महत्वपूर्ण है। प्रतिदीप्ति के विकास के लिए, कम से कम 1 घंटे के लिए सब्सट्रेट के साथ ऊतक अनुभाग सेते हैं। यह ऊष्मायन के दौरान खंड का निरीक्षण करने के लिए इतना है कि overdevelopment बचा जा सकता है की सलाह दी जाती है। किट के साथ प्रदान बढ़ते मीडिया के साथ खंड माउंट करने के लिए सुनिश्चित करें।
वहाँ एक सीमित कारक है कि एक विचार में लेना चाहिए। यदि लक्ष्य miRNA अभिव्यक्ति के ऊतकों में कम है यह इस तकनीक का उपयोग अपनी अभिव्यक्ति का पता लगाने के लिए मुश्किल हो जाएगा। यह हमेशा ऐसा तकनीक की पुष्टि की जा सकती है और सभी अभिकर्मकों काम करने के लिए सुनिश्चित कर रहे हैं और वे मुफ्त RNase हैं ऐसे U6 के रूप में एक सकारात्मक नियंत्रण के साथ इस प्रोटोकॉल प्रदर्शन करने की सलाह दी जाती है।
यह कमजोर हस्ताक्षर के मामले में डीआईजी लेबल जांच के बजाय बायोटिन लेबल जांच उपयोग करना संभव हैडीआईजी के साथ अल जांच लेबल। संकेत प्रवर्धन बायोटिन Avidin प्रणाली का उपयोग करके संभव है। Avidin बायोटिन के लिए मजबूत संबंध है। इस समानता का लाभ लेने से, यह avidin बायोटिन द्वैध जो alkaline फॉस्फेट के साथ देते है साथ बायोटिन जांच टैग करने के लिए संभव है। इस रणनीति का उपयोग करके, यह कम प्रचुर मात्रा में miRNA के लिए संकेत बढ़ाना करने के साथ ही संभव है।
miRNA के क्षेत्र में तेजी से उभर रहा है, के बाद से miRNAs कुंजी सेलुलर प्रक्रियाओं में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं और दृढ़ता से कैंसर के विकास के साथ जुड़े हुए हैं। इसके अलावा, इन miRNAs भी कैंसर के निदान में बायोमार्कर के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है। कई अध्ययनों से इस तरह के ट्यूमर चरण के कैंसर रोग का निदान में miRNA अभिव्यक्ति के संभावित आवेदन सुझाव के रूप में miRNA अभिव्यक्ति और नैदानिक मापदंडों के बीच एक मजबूत संबंध का संकेत दिया है। इस तकनीक को भी अन्य प्रकार के कैंसर में miRNA अभिव्यक्ति विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, मीर 182 और मीर-503 की अभिव्यक्ति si में उपयोग कर पेट के कैंसर मरीज के ऊतकों में विश्लेषण किया गयाTu संकरण 15।
पारंपरिक जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण के ऊतकों में miRNA अभिव्यक्ति के स्तर प्रकट कर सकते हैं, लेकिन यह स्थान जो संरचना से miRNA व्यक्त की जा रही है प्रकट नहीं कर सकता। इस तकनीक का उपयोग करके, एक बड़ी आसानी से miRNA अभिव्यक्ति के स्तर के रूप में अच्छी तरह से स्थान के रूप में पा सकते हैं।
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ELF-97 | Life technology | E6604 | |
| 50x Denhard't | Life technology | 750018 | |
| t-RNA | Roche | 109541 | Reconstitute in DEPC water |
| Herring Sperm DNA | Promega | D1815 | |
| Roche Blocking | Roche | 11096176001 | |
| RVC | Fisher | 50-812-650 | Before use spin down it at 16.1 RCF and take supernatant |
| miR-489 probe | Exiqon | 38599-01 | |
| Nuclease free BSA | Roche | 711454 | |
| Primary antibody-anti DIG | Roche | 11093274910 | |
| Diethyl Pyrocarbonate | Sigma | 1609478 |
References
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